Дактилоскопирование кардиолипина в лейкоцитах масс-спектрометрией для быстрой диагностики синдрома Барта

Резюме

Этот протокол показывает, как получить масс-спектрометрический «отпечаток» кардиолипина лейкоцитов для диагностики синдрома Барта. Оценка повышенного соотношения монолизокардиолипина к кардиолипину отличает пациентов с синдромом Барта от контрольных пациентов с сердечной недостаточностью со 100% чувствительностью и специфичностью.

Аннотация

Кардиолипин (CL), димерный фосфолипид, несущий в своей структуре четыре цепи жирных кислот, является липидным маркером митохондрий, в котором он играет решающую роль в функционировании внутренней мембраны. Его метаболит монолизокардиолипин (MLCL) физиологически почти отсутствует в липидном экстракте клеток животных, а его внешний вид является отличительной чертой синдрома Барта (BTHS), редкого и часто неправильно диагностируемого генетического заболевания, которое вызывает тяжелую кардиомиопатию в младенчестве. Метод, описанный здесь, генерирует «кардиолипиновый отпечаток» и позволяет провести простой анализ относительных уровней видов CL и MLCL в клеточных липидных профилях. В случае лейкоцитов требуется только 1 мл крови для измерения соотношения MLCL / CL с помощью матричной лазерной десорбционной ионизации - время полета / масс-спектрометрия (MALDI-TOF / MS) всего в пределах 2 ч от забора крови. Анализ прост и может быть легко интегрирован в рутинную работу клинической биохимической лаборатории для скрининга на BTHS. Тест показывает 100% чувствительность и специфичность для BTHS, что делает его подходящим диагностическим тестом.

Введение

Синдром Барта (BTHS) является редким Х-сцепленным заболеванием, характеризующимся ранней кардиомиопатией, миопатией скелетных мышц, задержкой роста, нейтропенией, вариабельной дисфункцией митохондриальной дыхательной цепи и аномальной^{структурой} митохондрий ^1,2,3,4,5. BTHS имеет распространенность одного случая на миллион мужчин с в настоящее время менее 250 известными случаями во всем мире, хотя широко признано, что болезнь недодиагностирована ^2,6. BTHS является результатом мутаций потери функции гена Tafazzin (TAFAZZIN), локализованного в хромосоме Xq28.12 ^7,8, вызывающих недостаточное ремоделирование митохондриального фосфолипида кардиолипина (CL), процесс, который обычно приводит к высокосимметричному и ненасыщенному ациловому составу ^9,10. CL считается сигнатурным липидом митохондрий, где он является важным компонентом внутренней мембраны, жизненно важным для окислительного фосфорилирования (то есть митохондриального энергетического метаболизма), образования суперкомплексов, импорта белка и участвует в динамике митохондрий, митофагии и апоптозе 11,12,13,14,15,16 . При потере функции TAFAZZIN ремоделирование CL не удается и в митохондриях пациентов с BTHS возникают специфические аномалии фосфолипидов: зрелый уровень CL (CLm) снижается, в то время как повышаются уровни монолизокардиопина (MLCL) и изменяется состав CL ацила (т.е. незрелые виды CL, CLi). Это приводит к резкому увеличению соотношения MLCL/CL¹⁷.

Диагностика BTHS часто затруднена, так как расстройство представляет собой чрезвычайно изменчивые клинические и биохимические особенности и может отличаться между пострадавшими лицами из одной семьи и внутри пациента с течением^{времени 3,5}. Многие мальчики BTHS показывают очень высокий уровень экскреции с мочой 3-метилглутаконовой кислоты (3-MGCA), но уровень мочи может быть нормальным или только слегка увеличиваться у пациентов с течением времени³. Тем не менее, увеличение 3-MGCA является особенностью различных других митохондриальных и немитохондриальных расстройств, таких как дефицит гидразы 3-метилглютаконил-КоА (дефект AUH), 3-метилглутаконовая ацидурия, дистония-глухота, энцефалопатия, синдром Ли (MEGDEL), синдром Костеффа и дилатационная кардиомиопатия с атаксией (DCMA)^{синдром 18,19} . Следовательно, плохая специфичность 3-MCGA как маркера BTHS и огромная вариабельность у пациентов делают биохимический диагноз неоднозначным.

Кроме того, было описано более 120 различных мутаций TAFAZZIN, вызывающих расстройство⁵ , и, следовательно, генетический диагноз может быть сложным, медленным и дорогостоящим. Более того, молекулярный анализ гена TAFAZZIN может привести к ложноотрицательным результатам при наличии мутаций в некодирующих или регулирующих последовательностях³. BTHS может быть однозначно проверен путем определения относительных количеств и распределения (монолизо-)видов CL и подтвержден секвенированием гена TAFAZZIN или наоборот.

Практическим тестом для диагностики является измерение соотношения MLCL/CL методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и анализа электрораспыляемой ионизации/масс-спектрометрии (ESI/MS) в пятне крови^20,21. Измерение уровня CL само по себе не является адекватным для диагностики, так как некоторые пациенты имеют почти нормальные уровни CL, но измененное соотношение MLCL / CL. Таким образом, измерение соотношения MLCL/CL имеет 100% чувствительность и специфичность для диагноза BTHS²¹. Другой проверенный метод, основанный на анализе ВЭЖХ и ESI / MS, был создан на лейкоцитах²², но сложные хроматографические методы разделения ранее извлеченных липидов и дороговизна инструментов ограничивают этот анализ несколькими клиническими лабораториями. Все эти факторы, вместе с отсутствием простого диагностического теста, способствовали недостаточной диагностике состояния.

MALDI-TOF/MS является еще одним валидным инструментом в анализе липидов^23,24. Этот аналитический метод может быть использован для непосредственного получения липидных профилей различных биологических образцов, пропуская таким образом этапы экстракции и разделения 25,26,27,28,29, в том числе в тканевых срезах для приложений MS Imaging ³⁰. Учитывая это преимущество, был разработан простой и быстрый метод диагностики BTHS путем профилирования митохондриального КЛ в интактных лейкоцитах с MALDI-TOF/MS²⁸. Выделение лейкоцитов всего из 1 мл цельной крови путем оседания и лизиса эритроцитов является простым и не требует специального оборудования или реагентов. Кроме того, был описан протокол быстрой липидной «мини-экстракции», применимый к мельчайшим количествам лейкоцитов, чтобы гарантировать успешное получение спектров, имеющих более чистые сигналы РС с более высоким отношением сигнал/шум (S/N), чем в спектрах, полученных из интактных лейкоцитов²⁸. Этот дальнейший шаг занимает мало времени и позволяет воспроизводить анализ даже при проведении на инструментах MS с низкой чувствительностью. Таким образом, аналитический метод, описанный здесь, требует минимальной пробоподготовки, поскольку трудоемкое и трудоемкое хроматографическое разделение липидов может быть пропущено, тем самым ускоряя тест.

протокол

Образцы крови здоровых доноров и пациентов с сердечной недостаточностью были собраны в поликлинической больнице Бари (Италия), а образцы пациентов с BTHS были получены клиникой BTHS Национальной службы здравоохранения Великобритании в Бристольской королевской больнице для детей (Великобритания). Было получено письменное информированное согласие здоровых доноров, пациентов и родителей (при необходимости) и одобрение соответствующих комитетов по этике.

ПРИМЕЧАНИЕ: Если не использовать немедленно, кровь (в гелевой пробирке K-EDTA) может храниться при 4 °C в течение 24-48 ч.

1. Выделение лейкоцитов путем декстранового осаждения эритроцитов (эритроцитов)

1. Поместите образцы крови (в K-EDTA) на орбитальный шейкер в течение 10 минут, чтобы смешать кровь.
2. К 0,9 мл цельной крови в пробирке объемом 1,5 мл добавляют 0,1 мл 20% раствора декстрана (молекулярная масса > 100 кДа, в 0,9% NaCl). Пипетку и рассейте суспензию осторожно 20 раз, избегая пузырьков воздуха, которые в противном случае удерживали бы эритроциты в верхней части трубки. Оставьте эритроциты отстойными в течение примерно 1 ч при комнатной температуре.
3. Используя шприц, соберите и перенесите желтый супернатант в трубку объемом 15 мл, а затем центрифугу при 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (без тормоза, ротор качающегося ковша).
4. Откажитесь от надосадочного вещества и повторно суспендируйте гранулу, содержащую в основном лейкоциты и остаточные эритроциты, в 0,6 мл ледяной бидистиллированной воды (ddH_2O).
5. Через ~15 с добавьте 0,2 мл 0,6 МКл к клеточной суспензии для восстановления правильной осмолярности. Короткий осмотический шок лизирует эритроциты и оставляет лейкоциты нетронутыми. Отрегулируйте конечный объем до 2,5 мл с 1x PBS.
6. Центрифуга подвески при 400 х г в течение 15 мин при комнатной температуре (без тормоза, поворотный ротор). Откажитесь от надосадочного вещества и снова промыте гранулу лейкоцитов 2,5 мл 1x PBS.
7. Центрифуга как на шаге 1.6 и выбросьте супернатант. Повторно суспендируют гранулы, содержащие лейкоциты в 200 мкл стерилизованного ddH_2O.
   ПРИМЕЧАНИЕ: По опыту авторов, это соответствует содержанию белка в диапазоне от 200 мкг до 400 мкг.
8. Заморозьте суспензию при -80 °C или непосредственно выполните экстракцию липидов следующим образом.

2. «Мини-экстракция» липидов из изолированных лейкоцитов

1. Перенос 20 мкл суспензии лейкоцитов (около 20-40 мкг белков) в трубку объемом 1,5 мл и вращение при 16 000 х г в течение 30 с.
2. Откажитесь от надосадочного вещества, добавьте 10 мкл CHCl₃ к оставшейся грануле и пипетку многократно, чтобы способствовать экстракции липидов.
3. Наконец, добавляют 10 мкл матричного раствора 9-аминоакридина (9-АА) (10 мг/мл 9-АА в 2-пропаноле/ацетонитриле, 60:40 в/об)) к грануле в CHCl₃. Пипетку и разогнать многократно, чтобы перемешать.
4. Раскрутите раствор, содержащий липиды в CHCl₃ и 9-AA, при 16 000 х г в течение 30 с, а затем нанесите супернатант в виде капель 0,35 мкл (три реплики для каждого образца) на мишень MALDI (пластину образца), подлежащую анализу (метод осаждения «высушенных капель»).
5. Дайте каплям высохнуть на воздухе не менее 10-15 мин.

3. Липидный анализ maldi-TOF/MS

1. Получение масс-спектров образцов в трех экземплярах на масс-спектрометре MALDI-TOF.
2. После калибровки с липидными эталонами (см. Таблицу материалов) установите анализы в режим отрицательных ионов и оптимизируйте диапазон обнаружения m/z от 200 Th до 2000 Th для анализа малых молекул.
3. Держите флюенс лазера на 5% выше порога (CL и MLCL), чтобы иметь S / N (не менее 2).
4. Получение спектров в режиме рефлектора с помощью замедленной импульсной экстракции. Для каждого массового спектра в среднем 2000 одиночных лазерных снимков (сумма 4 х 500). Примените закрытое матричное подавление до 400 Th для предотвращения насыщения детектора.

4. Как рассчитать соотношение (MLCL + CLi)/CLm

1. Запустите программное обеспечение прибора MALDI-TOF/MS (см. Таблицу материалов) для анализа полученных спектров.
2. С помощью команды Открыть откройте диалоговое окно Spectrum Browser , которое позволяет выбрать и загрузить интересующий спектр.
3. В строке меню нажмите на иконки Smooth Mass Spectrum и Subtract Mass Spectrum Baseline.
4. Нажмите файл > Экспорт > mass Spectrum и выберите формат ASCII для экспорта спектра в виде таблицы с двумя столбцами с парами точек данных: m/z (x) и интенсивность (y). Скопируйте и вставьте координаты в программу для работы с электронными таблицами (*.xls).
5. Повторите шаги с 4.2 по 4.4 для трех частей каждого анализируемого образца, вставив координаты в тот же программный файл электронной таблицы, как показано на рисунке 1 (шаг 1).
6. Следуя x-диапазонам, показанным на рисунке 1 (шаг 2) для каждого перечисленного вида, рассчитайте сумму значений y₁, y₂ и y₃ (трипликатов) с помощью функции СУММ , чтобы получить пиковую площадь (рисунок 1; Шаг 3).
7. Выполните среднее значение тройных значений площади с помощью функции СРЗНАЧ (рисунок 1; Шаг 3).
8. Поместите средние значения площади для каждого вида в столбец, как показано на рисунке 1 (шаг 2).
9. Чтобы рассмотреть только первый изотополог вида CLm 72:7, как в²⁸, рассчитайте изотопную коррекцию для перекрытия между изотопологом M + 2 CLm 72:8 и моноизотопным пиком CLm 72:7, как показано на рисунке 1 (шаг 4).
10. Наконец, рассчитайте соотношение (MLCL + CLi)/CLm, как показано на рисунке 1 (шаг 5).

Результаты

В этом исследовании был описан простой и быстрый метод выделения лейкоцитов из 1 мл цельной крови и получения дактилоскопии CL методом MALDI-TOF/MS (см. Рисунок 2). На рисунке 3 показано сравнение репрезентативной дактилоскопии CL лейкоцитов, полученной от контро...

Обсуждение

Синдром Барта является врожденной ошибкой метаболизма и изменяющим жизнь состоянием, которое, вероятно, будет недодиагностировано ^{2,6. Как упоминалось ранее, способствующим фактором может быть отсутствие простого диагностического теста. Здесь был оп?...}

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,1′,2,2′-tetratetradecanoyl cardiolipin	Avanti Polar Lipids	750332	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,1′2,2′-tetra- (9Z-octadecenoyl) cardiolipin	Avanti Polar Lipids	710335	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-di- (9Z-hexadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamine	Avanti Polar Lipids	878130	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phosphate	Avanti Polar Lipids	830845	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-snglycero-3-phospho-(1′-rac-glycerol)	Avanti Polar Lipids	840445	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
1,2-ditetradecanoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine	Avanti Polar Lipids	840033	Lipid standard for MALDI-TOF calibration
2-Propanol, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	190764
9-Aminoacridine hemihydrate, 98%	Acros Organics	134410010
Acetonitrile, ACS reagent, ≥99.5%	Merck Life Science S.r.l.	360457
Chloroform, ACS reagent, ≥99.8%	Merck Life Science S.r.l.	319988
Dextran from Leuconostoc spp. Mr 450,000-650,000	Merck Life Science S.r.l.	31392
Flex Analysis 3.3	Bruker Daltonics		Software
MALDI-TOF mass spectrometer Microflex LRF	Bruker Daltonics
Microsoft Excel	Microsoft Office		Software
OmniPur 10X PBS Liquid Concentrate	Merck Life Science S.r.l.	6505-OP
Potassium chloride, ACS reagent, 99.0-100.5%	Merck Life Science S.r.l.	P3911
Sodium chloride, ACS reagent, ≥99.0%	Merck Life Science S.r.l.	S9888