JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Протокол здесь демонстрирует, что внеклеточные везикулы могут быть адекватно отделены от обусловленных клеточных культуральных сред с помощью размерной эксклюзионной хроматографии.

Аннотация

Внеклеточные везикулы (EV) представляют собой наноразмерные липидно-мембранные связанные структуры, которые высвобождаются из всех клеток, присутствуют во всех биожидкостях и содержат белки, нуклеиновые кислоты и липиды, которые отражают родительскую клетку, из которой они получены. Правильное отделение EV от других компонентов в образце позволяет характеризовать связанный с ними груз и дает представление об их потенциале в качестве межклеточных коммуникаторов и неинвазивных биомаркеров для многочисленных заболеваний. В текущем исследовании oligodendrocyte derived EV были выделены из среды клеточной культуры с использованием комбинации современных методов, включая ультрафильтрацию и хроматографию исключения размера (SEC) для отделения EV от других внеклеточных белков и белковых комплексов. Используя коммерчески доступные колонки SEC, EV были отделены от внеклеточных белков, высвобождаемых из клеток олигодендроглиомы человека как под контролем, так и при стрессовых условиях эндоплазматического ретикулума (ER). Канонические EV-маркеры CD9, CD63 и CD81 наблюдались во фракциях 1-4, но не во фракциях 5-8. GM130, белок аппарата Гольджи, и кальнексин, интегральный белок ER, использовались в качестве отрицательных маркеров EV и не наблюдались ни в одной фракции. Далее, при объединении и концентрировании фракций 1-4 в качестве фракции EV и фракций 5-8 в качестве белковой фракции наблюдалась экспрессия CD63, CD81 и CD9 в фракции EV. Экспрессия GM130 или кальнексина не наблюдалась ни в одном из типов фракций. Объединенные фракции как из контрольных, так и из ER-стрессовых состояний были визуализированы с помощью просвечивающей электронной микроскопии, и везикулы наблюдались в фракциях EV, но не в белковых фракциях. Частицы в EV и белковых фракциях из обоих состояний также были количественно определены с помощью анализа отслеживания наночастиц. Вместе эти данные демонстрируют, что SEC является эффективным методом отделения EV от условных клеточных культур.

Введение

Взрыв интереса к изучению внеклеточных везикул (EV) сопровождался значительными достижениями в технологиях и методах, используемых для разделения и изучения этих наноразмерных гетерогенных частиц. За время, прошедшее с момента их открытия почти четыре десятилетия назад 1,2, было обнаружено, что эти небольшие мембранные структуры содержат биологически активные липиды, нуклеиновые кислоты и белки и играют важную роль в межклеточной коммуникации 3,4. EV высвобождаются из всех типов клеток и, следовательно, присутствуют во всех биологических жидкостях, включая плазму крови и сыворотку, слюну и мочу. Ev в этих жидкостях имеют большие перспективы служить неинвазивными биомаркерами для различных заболеваний, включая нейровоспалительные и нейродегенеративные заболевания, рак и аутоиммунные расстройства 5,6,7. Кроме того, механистические исследования in vitro могут быть выполнены с помощью методов клеточной культуры путем разделения EV, высвобождаемых вкультуральную среду 3,8,9.

Чтобы понять роль EV в патофизиологии заболеваний, адекватное отделение от жидкости, в которой они находятся, имеет первостепенное значение. Золотым стандартом для разделения электромобилей уже давно является дифференциальное ультрацентрифугирование (dUC)10, однако возникли более сложные методы для достижения лучшего отделения EV от других внеклеточных компонентов. Некоторые из этих методов включают градиенты плотности, асимметрично-поточную полевую фракцию потока (A4F), проточную цитометрию, иммунозахват, осаждение полиэтиленгликоля и хроматографию с исключением размеров (SEC)11,12,13. Каждая методика имеет свой набор преимуществ и недостатков; тем не менее, было показано, что SEC, в частности, отделяет EV как от биологических жидкостей, так и от супернатантов клеточных культур довольно эффективно 8,14,15. SEC также имеет дополнительный бонус в том, что он относительно прост и удобен для пользователя.

SEC - это метод, который разделяет компоненты жидкости на основе размера. С помощью этого метода столб смолы (либо изготовленный собственными силами, либо приобретенный на коммерческой основе) используется для фракционирования образца. Мелкие частицы в образце попадают в ловушку между шариками внутри смолы, в то время как более крупные частицы способны проходить через смолу более свободно и, таким образом, элюироваться раньше в процессе. Поскольку EV больше по размеру, чем многие внеклеточные белки и белковые агрегаты, EV проходят через столб быстрее и элюируются в более ранних фракциях, чем внеклеточные белки14.

В данной работе по методам изложено использование SEC для отделения EV от клеточных культуральных сред (CCM) от олигодендроцитов человека как под контролем, так и в условиях стресса эндоплазматического ретикулума (ER). Используя этот протокол, показано, что EV, разделенные с помощью этого метода, обнаруживаются в определенных фракциях, которые могут быть объединены вместе и сконцентрированы для последующей характеристики, и что разделенные EV получены из клеток, а не из экзогенного источника, такого как фетальная бычья сыворотка (FBS), используемая для дополнения CCM. Наличие канонических ev-маркеров CD63, CD81 и CD9 16,17,18,19 в фракциях EV и их отсутствие в белковых фракциях демонстрируется при вестерн-блоттинге. Используя просвечивающую электронную микроскопию (ТЭМ), EV визуализируются и отображают ожидаемую морфологию и наблюдаются только в фракции EV. Частицы также подсчитываются в EV и белковых фракциях как контрольных, так и ER-стрессовых условий, а в образцах EV наблюдается большое количество частиц в пределах ожидаемого диапазона размеров 50-200 нм в диаметре. Вместе эти данные подтверждают представление о том, что SEC является эффективным и действенным методом отделения EV от сред клеточных культур.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка буферов и реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Сделайте реагенты клеточной культуры в вытяжке для клеточной культуры для поддержания стерильности.

  1. Приготовление реагентов для клеточных культур
    1. Приготовьте нормальный высокий уровень глюкозы DMEM, добавив 50 мл FBS и 5 мл пенициллина-стрептококка (Pen-Strep) в 500 мл высокой глюкозы DMEM и храните при 4 °C. Используйте эту среду для культивирования и расширения клеток.
    2. Приготовьте экзосомный обедненный высокий уровень глюкозы DMEM, добавив 50 мл истощенного экзосомой FBS и 5 мл Pen-Strep в 500 мл высокой глюкозы DMEM и храните при 4 °C. Используйте эту среду для лечения клеток до изоляции EV.
    3. Готовят туникамицин, добавляя 10 мг туникамицина к 1 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Сделайте 50 мкл аликвот в пробирках по 0,2 мл и храните при -20 °C.
  2. Подготовка реагентов для разделения EV
    1. Приготовьте 1x фосфатного буферного физиологического раствора (PBS), добавив 9,89 г порошка PBS в 1 л деионизированной (DI) воды в градуированном цилиндре объемом 1 л. Перемешайте раствор на перемешиваемой пластине до тех пор, пока PBS не растворится.
    2. Используйте автоклав для стерилизации стеклянной посуды перед добавлением PBS. Положите стеклянную посуду в мусорное ведро, закройте дверцу и стерилизуйте в течение 30 минут при 121 °C.
    3. Внутри ламинарного проточного шкафа подключите вакуум к фильтру 0,22 мкм и поместите фильтр поверх автоклавной бутылки. Медленно вылейте PBS на фильтр и соберите отфильтрованный PBS в автоклавную бутылку.
    4. Готовят 0,5 М гидроксида натрия, добавляя 9,99 г гидроксида натрия к 500 мл 1x PBS в градуированном цилиндре объемом 500 мл. Перемешайте раствор на перемешиваемой пластине до тех пор, пока гидроксид натрия не растворится в PBS, а затем фильтруйте с помощью фильтра 0,22 мкм в автоклавную бутылку объемом 500 мл.
    5. Приготовьте 0,05% азида натрия, добавив 0,25 г азида натрия к 500 мл 1x PBS в градуированном цилиндре объемом 500 мл. Перемешайте раствор на перемешиваемой пластине до тех пор, пока азид натрия не растворится в PBS, а затем фильтруйте с помощью фильтра 0,22 мкм в автоклавную бутылку объемом 500 мл.
  3. Получение реагентов выделения, количественной оценки и идентификации белка
    1. Готовят 100 мл буфера лизиса RIPA, сочетая 1 мл 1 M Tris (рН 7,4), 1 мл 10% додецилсульфата натрия (SDS), 1 г дезоксихолата, 1 мл NP-40 и 0,89 г хлорида натрия (NaCl). Доведите объем до 100 мл с дистиллированнымH2Oи храните при 4 °C. Чтобы получить RIPA плюс раствор фосфатазы и ингибитора протеазы, добавляют 10 мкл фосфатазы и ингибитора протеазы на каждый 1 мл буфера RIPA в пробирке 15 мл и хранят раствор при 4 °C.
    2. Непосредственно перед использованием подготовьте рабочий реагент для анализа BCA, добавив 10 мл реагента A и 200 мкл реагента B, предоставленного набором для анализа BCA, в трубку объемом 15 мл. Непосредственно перед использованием подготовьте рабочий реагент для анализа microBCA, добавив 25 частей реагента A, 24 части реагента B и 1 часть реагента C в трубку объемом 15 мл.
    3. Приготовьте 10-кратный гель-электрофорез, добавив 30,3 г основы Tris, 144 г г глицина и 10 г SDS в 1 л воды DI. Храните работающий буфер при температуре 4 °C. Подготовьте 1-кратный буфер переноса, добавив 3,03 г основы Tris, 14,4 г г глицина и 200 мл метанола, и отрегулируйте объем до 1 л с водой DI. Храните буфер передачи при температуре 4 °C.
    4. Приготовьте буферный физиологический раствор Tris с Tween-20 (TBS-Tween), добавив 2,4 г основы Tris, 8 г NaCl и 1 мл Tween-20 в 1 л воды DI. Хранить TBS-Tween при температуре 4 °C.
    5. Приготовьте 5% блокирующий раствор, добавив 5 г сухого обезжиренного молока в 100 мл TBS-Tween. Храните блокирующий буфер при температуре 4 °C.
    6. Непосредственно перед использованием приготовьте хемилюминесцентный субстрат, добавив 4 мл раствора перекиси и 4 мл раствора люминола/энхансера в пробирку объемом 15 мл и осторожно переверните для смешивания.

2. Культивирование и обработка клеток

  1. Посейте две колбы для культивирования клеток T175 с 2,3 х 106 клетками олигодендроглиомы человека (HOG) каждая. Доведите конечный объем нормального высокого уровня глюкозы DMEM до 25 мл и инкубируйте при 37 °C с 5% CO2 в инкубаторе клеточной культуры в течение 48 ч.
  2. В конце 48 ч теплые экзосомы истощают высокий уровень глюкозы DMEM на водяной бане 37 °C. Для лечения добавляют 25 мкл 10 мг/мл туникамицина к 25 мл экзосомно-истощенной среды, конечную концентрацию 10 мкг/мл туникамицина для индуцирования ЭР-стресса. Для контроля добавляют 25 мкл ДМСО к 25 мл среды, обедненной экзосомами.
  3. Удалите и утилизируйте нормальный высокий уровень глюкозы DMEM из клеток и осторожно промойте клетки и колбу с 10 мл 1x PBS. Аспирировать и выбросить PBS.
  4. Добавьте 25 мл контрольной среды в колбу с маркировкой контроля и 25 мл 10 мкг/мл туникамицина в среде в колбу, помеченную обработкой. Возвращают колбы в инкубатор клеточных культур в течение 24 ч.

3. Сбор и концентрация кондиционированного СКК (Рисунок 1)

  1. Поместите PBS на водяную баню с температурой 37 °C. Наблюдайте за колбами под составным микроскопом с объективом 10x и 100x. Обратите внимание на любые различия между колбами. Выполните следующие действия как для контрольных, так и для обработанных колб.
  2. Извлеките среду из колбы и поместите в пробирку объемом 50 мл. Центрифугируйте трубку при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в новую трубку объемом 50 мл.
  3. Центрифугируйте трубку при 2 000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Переложите супернатант в новую трубку объемом 50 мл и поместите на лед.
  4. Получите четыре блока ультрафильтрации 15 мл 3 кДа и добавьте 5 мл PBS в каждую трубу. Грунтуйте фильтр центрифугированием ультрафильтрационных установок при 4 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В текущем протоколе использовались 3 кДа отсечных ультрафильтрационных единиц молекулярной массы для удержания всех внеклеточных белков, высвобождаемых из клеток. Блоки ультрафильтрации с большей молекулярной массой (например, 30 кДа) также будут работать с этим протоколом, однако внеклеточные белки размером менее 30 кДа будут отфильтрованы и удалены из образцов20,21.
  5. Удалите PBS из ультрафильтрационных блоков. Разделите супернатант из каждого состояния (контроль и обработанный туникамицин) на две ультрафильтрационные единицы каждая, примерно по 12,5 мл среды в каждой.
  6. Центрифугируют пробирки при 4000 х г в течение 1 ч 45 мин при 4 °С или до тех пор, пока концентрированная среда (называемая ретентатом) в каждой установке ультрафильтрации не будет сконцентрирована до 250 мкл или менее.
  7. Перенесите ретентат из обоих блоков ультрафильтрации управления в одну маркированную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Перенесите ретентат из обоих обработанных ультрафильтрационных блоков в другую маркированную микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл.
  8. Измерьте общий объем ретентата в каждой микроцентрифужной трубке, чтобы он составлял 500 мкл. Если объем образца составляет менее 500 мкл, добавьте 0,22 мкм отфильтрованного 1x PBS до тех пор, пока конечный объем не достигнет 500 мкл. Поместите пробирки в морозильную камеру с температурой -80 °C.

4. Коллекция ячеек

  1. Поместите трипсин, PBS и истощенный экзосомами DMEM на водяную баню с температурой 37 °C. Добавьте 7 мл трипсина как в контрольные, так и в обработанные колбы и поместите в инкубатор на 5 мин.
  2. Посмотрите под микроскопом, чтобы увидеть, подняты ли клетки. Если клетки не подняты, плотно постучите колбой по ладони, чтобы выбить клетки.
  3. Промыть колбу 7 мл истощенного экзосомой DMEM. Соберите клеточную суспензию из колбы и поместите в пробирки по 15 мл.
  4. Центрифугируйте тубы в течение 10 мин при 500 х г при 4 °C. Удалите супернатант и добавьте 5 мл 1x PBS в ячейку гранулы. Аккуратно перемешайте пипетку, чтобы разбить гранулы.
  5. Центрифугируйте пробирки при 500 х г в течение 5 мин при 4 °C. Удалите супернатант и добавьте 200 мкл RIPA плюс раствор фосфатазы и ингибитора протеазы в клеточную гранулу, пипетку для смешивания.
  6. Переложите ячейки в растворе RIPA в пробирки по 1,5 мл. Дайте трубочкам постоять на льду в течение 5 минут. Центрифугируйте пробирки при 14 000 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  7. Перенесите супернатант на новые трубки объемом 1,5 мл. Маркировка пробирок с указанием состояния и даты лечения. Поместите трубки в морозильную камеру при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.

5. Разделение ЭЛЕКТРОМОБИЛей с помощью хроматографии с исключением размеров (рисунок 2)

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие шаги дважды, один раз для контрольного ретентата и один раз для ретентата, обработанного туникамицином.
ПРИМЕЧАНИЕ: PBS, используемый в этом разделе, составляет 0,22 мкм с фильтрацией 1x PBS.

  1. Включите автоматический сборщик фракций (AFC) и отрегулируйте параметры для сбора восьми фракций, 0,5 мл на фракцию и буферного (пустого) объема по умолчанию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочие условия AFC являются следующими: объем колонны/слоя = 10 мл; объем пустоты = 2,70 мл; объем промывки = 15 мл; оптимальный размер фракции = 500 мкл; буфер, необходимый для одного прогона = 65 мл; расход при 20 °C = 1,0 мл/мин; возможность повторного использования столбца = пять применений.
  2. Снимите столбец (см. Таблицу материалов) с 4 °C и дайте колонке нагреться до комнатной температуры перед началом (обычно ~30 мин).
  3. Извлеките образцы ретентата из морозильной камеры при температуре -80 °C и поместите на лед для оттаивания. Во время ожидания установите восемь маркированных 1,5 мл трубок в карусель AFC с крышками, обращенными внутрь.
  4. Вставьте столбец в AFC со штрих-кодом, обращенным к считывателю. Начните сбор, следуя инструкциям на экране, чтобы убедиться, что в карусели есть трубки и работает ли коллектор отходов правильно.
  5. Начните промывку столбца, добавив 15 мл 1x PBS в столбец после того, как буфер хранения будет полностью поглощен верхней частью матрицы столбца. Не добавляйте PBS слишком рано, так как это разбавит буфер хранилища и предотвратит адекватную промывку.
  6. Непосредственно перед тем, как все 15 мл PBS будут поглощены матрицей, нажмите OK , чтобы остановить промывку и удалить любую остаточную PBS из верхней части матрицы столбца с помощью микропипетки. Не прикасайтесь к матрице.
  7. Добавьте 500 мкл образца в центр колонны. Нажмите кнопку ОК , чтобы начать запуск. Наблюдайте, как образец впитывается в матрицу, и быстро добавляйте 8 мл PBS в колонку сразу после того, как образец полностью абсорбируется.
  8. AFC автоматически рассеет объем пустоты в центр карусели, а затем соберет все восемь фракций по 500 мкл каждая. По завершении пробега снимите фракции с карусели и поместите на лед. Фракции 1-4 содержат EV, в то время как фракции 5-8 содержат внеклеточные белки. Удалите пустой объем из центра карусели.
  9. Добавьте 10 мл PBS в колонку после того, как восемь фракций были собраны для промывки любого остаточного образца из колонки. После того, как ретентированный образец будет полностью промыт через столбец, добавьте в колонку 1 мл 1x PBS.
  10. Поскольку конечная PBS поглощается матрицей, добавьте 500 мкл 0,5 М гидроксида натрия в центр матрицы колонны. По мере поглощения гидроксида натрия добавьте 30 мл 1x PBS в колонку и дайте ему промыться.
  11. Если используется другой образец, добавьте восемь меченых микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл в карусель и повторите шаги 5,7-5,10.
  12. После работы со всеми образцами выполните следующие действия, чтобы сохранить столбец для последующего использования. После промывки 30 мл PBS через колонну, как описано на этапе 5.10, добавьте в колонку 15 мл 0,05% азида натрия.
  13. Оставьте примерно 5 мл азида натрия в верхней части матрицы колонки. Снимите колонку с AFC и прикрепите верхнюю и нижнюю крышки. Поместите колонну обратно при 4 °C для хранения (колонку можно использовать до пяти раз).

6. Ультрафильтрация EV и белковых фракций

  1. Получите две единицы ультрафильтрации 2 мл, 3 кДа на образец. Используйте одну единицу для концентрирования фракций EV (фракции 1-4), а другую для концентрирования белковых фракций (фракции 5-8). Каждый блок состоит из трех частей: конуса, фильтра и проточного цилиндра; пометьте каждую деталь должным образом.
  2. Сконструируйте блок ультрафильтрации и добавьте 1 мл 0,22 мкм отфильтрованного 1x PBS в часть фильтра и колпачок с конусной частью. Центрифуга ультрафильтрационного блока конусообразной стороной вверх при 3 500 х г в течение 10 мин при 4 °C.
  3. Извлеките отфильтрованный PBS из проточного цилиндра. Переверните блок ультрафильтрации вверх дном (конус вниз) и центрифугу на 2 мин при 1000 x g при 4 °C. Удалите все оставшиеся PBS из конуса.
  4. Добавьте соответствующие фракции (весь объем 500 мкл) к каждой единице ультрафильтрации (общий объем составит 2 мл). Колонки центрифуги конусообразно поднимаются вверх в течение 1 ч 45 мин при 3 500 х г при 4 °C или до тех пор, пока уровень ретентата не достигнет 100 мкл.
  5. Снимите проточный цилиндр и отбросьте поток. Переверните блок ультрафильтрации вверх дном (конус вниз) и центрифугу на 2 мин при 1000 x g при 4 °C.
  6. Перенесите ретентат в конусе в меченую микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и доведите каждый объем образца до 150 мкл с 0,22 мкм, отфильтрованным 1x PBS. Поместите трубки в морозильную камеру при температуре -80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.

7. Элементы управления мультимедиа

  1. Получите две колбы для культивирования клеток T175. Маркировка одной колбы контроля, а другой обработки. Теплые экзосомы с высоким содержанием глюкозы DMEM на водяной бане 37 °C.
  2. Добавьте 25 мкл раствора туникамицина (10 мг/мл) к 25 мл среды и поместите в колбу с маркировкой обработки. Добавьте 25 мкл ДМСО к 25 мл среды и поместите в колбу с маркировкой контроля. Храните колбы в инкубаторе клеточной культуры в течение 24 ч.
  3. Сбор мультимедиа и обработка для разделения электромобилей, как описано в шагах 3.2-3.8. Затем выполните все действия, описанные в разделах 5 и 6.

8. Вестерн блоттинг

  1. Количественная оценка белка из лизатов клеток и белковых фракций с помощью анализа BCA
    ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка белка как из контрольных образцов, так и из образцов, обработанных туникамицином, выполняется с помощью следующих этапов.
    1. Размораживайте на льду лизированные клетки и белковые фракции. Сделайте три разбавляющие трубки для каждого образца; 1:2, 1:10 и 1:100.
    2. Нагрузка в трех экземплярах на 96-луночную пробирную пластину с прозрачным дном, 25 мкл стандартов белка сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA) и 25 мкл каждого разведения образца. Добавьте 200 мкл рабочего реагента к каждой скважине, содержащей стандарт или образец, используя многоканальную пипетку.
    3. Инкубируют пластину при 37 °C в течение 30 мин, затем считывают пластину с помощью пластинчатого считывателя при поглощении 562 нм. Рассчитать концентрацию белка в каждом образце и определить объем образца, необходимый для получения 20 мкг белка для клеточных лизатов и 15 мкг белка для белковых фракций.
  2. Количественная оценка белка из фракций EV с помощью анализа microBCA
    1. Размораживание образцов EV на льду. Сделайте два разведения для каждого образца: 1:50 и 1:100.
    2. Загрузка в трех экземплярах на 96-луночную пробирную пластину с прозрачным дном, 100 мкл стандартов белка BSA и 100 мкл каждого разбавления образца. Добавьте 100 мкл рабочего реагента microBCA в каждую скважину, содержащую стандарт или образец, используя многоканальную пипетку.
    3. Инкубируют пластину при 37 °C в течение 2 ч, затем считывают пластину с помощью пластинчатого считывателя при поглощении 562 нм. Рассчитайте концентрацию белка в каждом образце и определите объем образца, необходимый для получения 15 мкг белка для фракций EV.
  3. Вестерн блоттинг
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол вестерн-блоттинга был выполнен аналогично описанному в22, и модифицирован, как описано ниже.
    1. Сделайте 10% полиакриламидные гели с помощью набора для приготовления геля, используя инструкцию производителя.
    2. Для гелевого электрофореза подготовьте образцы лизата клеток, объединив в пробирке объемом 1,5 мл, объем лизата клеток, необходимый для 20 мкг белка, 5 мкл 4x буфера Laemmli и объем буфера RIPA, необходимый для доведения общего объема до 20 мкл.
    3. Подготовьте образцы EV и белковой фракции, объединив в пробирке объемом 1,5 мл, необходимый для 15 мкг белка, 5 мкл 4x буфера Laemmli и буфера RIPA в объеме 20 мкл.
    4. Подготовьте контрольные образцы среды, объединив в пробирке 1,5 мл 15 мкл образца и 5 мкл 4x буфера Laemmli.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемых антител буфер Laemmli может содержать или не содержать восстановитель, такой как 50 мМ дитиотрейтол (DTT).
    5. Вскипятите все образцы при 95 °C в течение 5 мин, перенесите образцы в лед для охлаждения и кратковременно центрифугируйте в течение 30 с при 10 000 х г, а затем верните образцы в лед.
    6. Добавьте гели в резервуар для электрофореза и добавьте 1x гель электрофореза, работающий буфером. Нагрузка 15 мкл белковой лестницы и 20 мкл образца. Запускайте гель при 200 В в течение 30-50 мин или до тех пор, пока образцы не достигнут дна геля, непосредственно перед запуском.
    7. Перенос белка на PVDF-мембрану с 1x переносным буфером при 4 °C в течение 30 мин при 100 В или до завершения переноса. На дополнительном рисунке 1, дополнительном рисунке 2 и дополнительном рисунке 3 показаны изображения каждого пятна без пятен после завершения переноса.
    8. Блокируйте мембрану в 5% молоке/TBS-Tween в течение 1 ч при комнатной температуре на шейкере. Инкубировать мембрану в растворе первичного антитела на ночь на шейкере при 4 °C. Информацию о разбавлении антител см. в таблице 1 .
    9. На следующий день удалите первичное антитело и промывайте мембрану 3 раза TBS-Tween в течение 5 мин каждая при комнатной температуре на шейкере.
    10. Приготовьте соответствующие вторичные антитела в 5% молоке/TBS-Tween. Информацию о разбавлении см. в таблице 1 . Добавьте вторичное антитело к мембране и инкубируйте на шейкере при комнатной температуре в течение 1 ч, затем промыть 3 раза TBS-Tween в течение 5 мин каждый при комнатной температуре на шейкере.
    11. Добавить хемилюминесцентный субстрат к мембране и инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре на шейкере. Пятно изображения с помощью колориметрического и хемилюминесцентного анализа. На дополнительном рисунке 4, дополнительном рисунке 5 и дополнительном рисунке 6 показаны необрезанные изображения каждого пятна.

9. Визуализация ТЕА

  1. Тлеющий разряд23 400 сетчатых углеродных/формварных покрытий для удаления углеводородов и придания сеткам гидрофильных.
  2. Добавьте 5 мкл образца EV или белковой фракции в сетки. Инкубировать сетки при комнатной температуре в течение 3-5 мин.
  3. Удалите излишки раствора, обложив фильтровальной бумагой. Вымойте сетки 5 мкл наночистой воды и удалите излишки путем впитывания.
  4. Нанесите 5 мкл 1% водного уранилацетата и немедленно снимите фитиль. Дайте сеткам высохнуть. Снимайте сетки на 120 кВ на просвечивающем электронном микроскопе и захватывайте изображения с помощью камеры с заряженной парой устройств.

10. Анализ отслеживания наночастиц (NTA)

  1. Получают образцы EV и белковой фракции от -80 °C и оттаивают на льду.
  2. Включите компьютер и прибор NTA. Откройте программное обеспечение NTA, и оно начнет инициализироваться автоматически.
  3. Выберите соответствующий насос, содержащий воду без частиц, и нажмите кнопку «Промыть инструмент», чтобы промыть ячейку. Во время промывки впрыскивайте 10-20 мл воды без частиц в инъекционный порт на передней панели инструмента, используя шприц, и избегайте пузырьков воздуха.
  4. Появится экран проверки качества ячеек; нажмите кнопку ОК , и начнется проверка качества ячеек. После успешного прохождения проверки появится всплывающее окно автовыравнивания с надписью: Пожалуйста, заполните ячейку подвеской выравнивания 100 нм (разбавление 1:250 000).
    1. Подготовьте разбавление 1 суспензии выравнивания, добавив в трубку 10 мл воды без частиц и 10 мкл полистирольных шариков 100 нм (разбавление 1:1000). Аккуратно переверните, чтобы перемешать. Разведение 1 имеет срок годности 2-3 дня при 4 °C.
    2. Создайте разбавление 2 выровненной суспензии путем добавления 20 мл воды без частиц и 80 мкл разбавления 1 (1:1000) в трубку для создания разбавления 1:250 000. Аккуратно переверните трубку, чтобы перемешать. Разведение 2 имеет срок годности 30-60 мин при комнатной температуре.
  5. Наполните ячейку 2 мл разведения 2 (1:250 000). Нажмите OK , и программа завершит автовыравнивание (фокус) и оптимизацию фокуса. Откроется вкладка анализа, создающая профиль, обеспечивающий результаты чистоты и симметрии измерительной ячейки в параболе. Появится всплывающее окно с надписью: View Video Microscope теперь готов к экспериментам; нажмите кнопку ОК , и программа вернется на вкладку проверки ячейки.
  6. Промойте полистирольные шарики из ячейки, введя воду без частиц в инъекционный порт для промывки клетки. Продолжайте промывку до тех пор, пока количество обнаруженных частиц не составит 0-10 (обычно между 5-10 мл). Добавьте 1 мл 0,22 мкм отфильтрованной PBS, чтобы загрунтовать ячейку для первого образца.
  7. Разбавьте первый образец фильтруемым PBS 0,22 мкм (начните с разбавления 1:1000) и введите коэффициент разбавления в программу. Вставьте 1 мл образца в ячейку и подождите 5 минут, пока движение частиц замедлится, так как они изначально будут очень быстро перемещаться по экрану. Установите чувствительность и затвор на 75,0 и 100 соответственно.
  8. Количество обнаруженных частиц для идеального разбавления образца составляет 50-200 частиц. Если сообщается о частицах ниже 50 или выше, отрегулируйте разбавление образца. Если требуется новое разведение, промыть клетку водой без частиц до тех пор, пока не появится 0-10 обнаруженных частиц. Повторите добавление разбавленного образца и промывку до тех пор, пока не будет найдено идеальное разведение.
  9. Проверьте все 11 положений камеры, чтобы визуализировать, что движение частиц замедлилось, и убедитесь, что количество обнаруженных частиц одинаково между всеми положениями камеры. Если количество частиц сильно различается в зависимости от положения камеры, добавьте больше образца.
  10. Перейдите на вкладку Измерение и запустите сбор видео. На вкладке Получение видео введите пользовательское имя образца и определите безопасное местоположение. Установите флажки автосохранения.txt и автосохранения.pdf чтобы сохранить данные.
  11. Установите температуру на 25 ° C, нажмите на 488 нм , чтобы установить лазер, и нажмите на 11 для положения камеры. Нажмите кнопку ОК , чтобы запустить сбор данных. Программа начнет анализировать количество и размер частиц во всех 11 позициях. На вкладке анализа появится гистограмма с диаметром/нм по оси X и частицами/мл по оси Y.
  12. После сбора данных появится всплывающее окно под названием «Обзор позиций», содержащее данные для каждой из 11 позиций. Если из анализа удалено более двух позиций, повторите процедуру с большим количеством образца. Если нет, нажмите кнопку Продолжить . Откроется файл PDF и txt, содержащий результаты. Сохраните файлы в безопасном месте.
  13. Чтобы запустить другой пример, перейдите на вкладку Проверка ячейки и повторите шаги с 10.6 по 10.12. Если это сделано, промыть клетку водой без частиц до тех пор, пока количество обнаруженных частиц не составит 0-10 (около 5-10 мл). Промыть ячейку 1 мл 0,22 мкм с фильтром PBS, закрыть программу и выключить компьютер.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Вестерн-блоттинг показывает адекватное отделение EV от CCM
Чтобы оценить эффективность SEC для отделения EV от клеточных культуральных сред, было проведено западное пятно с использованием каждой отдельной фракции из контрольных образцов для зондирования экспрессии трех канони...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

SEC - это удобный для пользователя метод адекватного отделения электромобилей от кондиционированного CCM. Чтобы конкретно изолировать ЭВ, полученные из клеток, необходимо тщательно учитывать тип СКК и его добавок. Многие среды клеточных культур должны быть дополнены FBS, который содержит E...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Авторы хотели бы поблагодарить Penn State Behrend и Hamot Health Foundation за финансирование, а также Центр микроскопии штата Пенсильвания в Университетском парке, штат Пенсильвания.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
2-MercaptoethanolVWR97064-588
4X Laemmli Sample BufferBioRad1610747
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Unit, Ultracel, 3 KDa, 15mLSigma-AldrichUFC9003083 kDa cutoff
Amicon Ultra-2 Centrifugal Filter Unit with Ultracel-3 membraneSigma-AldrichUFC2003243 kDa cutoff
Ammonium PersulfateSigma-AldrichA3678-100G
Anti rabbit IgG, HRP linked AntibodyCell Signaling Technology7074V1:1000 Dilution
Anti-Calnexin antibodyAbcam ab225951:500 Dilution
Anti-CD9 Mouse Monoclonal AntibodyBioLegend3121021:500 Dilution
Anti-GM130 antibody [EP892Y] - cis-Golgi MarkerAbcamab526491:500 Dilution
Anti-mouse IgG, HRP-linked AntibodyCell Signaling Technology7076V1:1000 Dilution
Automatic Fraction CollectorIzon Science
BCA assay KitBio-Rad
CCD cameraGatan Orius SC200
Cd63 Mouse anti HumanBD5560191:1000 Dilution
CD81 AntibodySanta Cruz Biotechnologysc-239621:1000 Dilution
Cellstar Filter Cap Cell Culture FlasksGreiner Bio-One660175
ChemiDoc MP ImagerBioRad
Clarity Western ECL SubstrateBioRad1705061
deoxycholateSigma-AldrichD6750-10G
dithiothreitolSigma3483-12-3
DMEM/High glucose with L-glutamine; without sodiumCytivaSH300022.FS
Fetal Bovine Serum Premium gradeVWR97068-085
Fetal Bovine Serum, exosome-depletedThermo ScientificA2720801
GlycineBioRad1610718
Great Value Nonfat Dry MilkAmazonB076NRD2TZ
HOG Human Oligodendroglioma Cell LineSigma-AldrichSCC163
Izon Science Usa Ltd qev Size Exclusion Columns 5pkIzon Science
Methanol >99.8% ACSVWRBDH1135-4LP
Mini-PROTEAN Glass platesBioRad1653310with 0.75mm spacers
Mini-PROTEAN Short platesBioRad1653308
NP-40Sigma-Aldrich492016
Penicillin-Streptomycin,SolutionSigma-AldrichP4458-100mL
Phosphate Buffered Saline PBSFisher ScientificBP66150
Pierce BCA Protein Assay Kits and ReagentsThermo Fisher Scientific23227
Pierce PVDF Transfer MembranesThermo Scientific88518
Pierce Western Blotting Filter PaperThermo Scientific84783
Polyoxyethylene-20 (TWEEN 20), 500mLBio BasicTB0560
Protease/phosphatase Inhibitor Cocktail (100X)Cell Signaling Technology5872S
Recombinant Anti-TSG101 antibody [EPR7130(B)]ABCamab1250111:1000 dilution
Slodium hydroxideSigma-AldrichSX0603
Sodium azideFisher ScientificBP922I-500
Sodium ChlorideSigma-AldrichS9888-500G
Sodium dodecyl sulfate,≥99.0% (GC), dust-free pelletsSigma-Aldrich75746-1KG
TetramethylethylenediamineSigma-AldrichT9281-25ML
TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Kit, 10%BioRad1610183
Transmission Electron MicroscopeFEI Tecnai 12 Biotwin
TrisBioRad1610716
Trypsin 0.25% protease with porcine trypsin, HBSS, EDTA; without calcium, magnesiumCytivaSH30042.01
TunicamycinTocris3516
Zeta View softwareAnalytikNTA software

Ссылки

  1. Pan, B. T., Teng, K., Wu, C., Adam, M., Johnstone, R. M. Electron microscopic evidence for externalization of the transferrin receptor in vesicular form in sheep reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 101 (3), 942-948 (1985).
  2. Harding, C., Heuser, J., Stahl, P. Receptor-mediated endocytosis of transferrin and recycling of the transferrin receptor in rat reticulocytes. The Journal of Cell Biology. 97 (2), 329-339 (1983).
  3. Valadi, H., et al. Exosome-mediated transfer of mRNAs and microRNAs is a novel mechanism of genetic exchange between cells. Nature Cell Biology. 9 (6), 654-659 (2007).
  4. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
  5. Rontogianni, S., et al. Proteomic profiling of extracellular vesicles allows for human breast cancer subtyping. Communications Biology. 2 (1), 1-13 (2019).
  6. Lane, R. E., Korbie, D., Hill, M. M., Trau, M. Extracellular vesicles as circulating cancer biomarkers: opportunities and challenges. Clinical and Translational Medicine. 7 (1), 14(2018).
  7. Thompson, A. G., et al. Extracellular vesicles in neurodegenerative disease-pathogenesis to biomarkers. Nature Reviews Neurology. 12 (6), 346-357 (2016).
  8. O'Brien, K., Ughetto, S., Mahjoum, S., Nair, A. V., Breakefield, X. O. Uptake, functionality, and re-release of extracellular vesicle-encapsulated cargo. Cell Reports. 39 (2), 110651(2022).
  9. Joshi, B. S., de Beer, M. A., Giepmans, B. N. G., Zuhorn, I. S. Endocytosis of extracellular vesicles and release of their cargo from endosomes. ACS Nano. 14 (4), 4444-4455 (2020).
  10. Théry, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids. Current Protocols in Cell Biology. 30 (1), 3-22 (2006).
  11. Willms, E., Cabañas, C., Mäger, I., Wood, M. J. A., Vader, P. Extracellular vesicle heterogeneity: Subpopulations, isolation techniques, and diverse functions in cancer progression. Frontiers in Immunology. 9, 738(2018).
  12. Tzaridis, T., et al. Extracellular vesicle separation techniques impact results from human blood samples: Considerations for diagnostic applications. International Journal of Molecular Sciences. 22 (17), 9211(2021).
  13. Liangsupree, T., Multia, E., Riekkola, M. L. Modern isolation and separation techniques for extracellular vesicles. Journal of Chromatography A. 1636, 461773(2021).
  14. Gámez-Valero, A., et al. Size-exclusion chromatography-based isolation minimally alters extracellular vesicles' characteristics compared to precipitating agents. Scientific Reports. 6 (1), 1-9 (2016).
  15. Mol, E. A., Goumans, M. J., Doevendans, P. A., Sluijter, J. P. G., Vader, P. Higher functionality of extracellular vesicles isolated using size-exclusion chromatography compared to ultracentrifugation. Nanomedicine: Nanotechnology, Biology, and Medicine. 13 (6), 2061-2065 (2017).
  16. Campos-Silva, C., et al. High sensitivity detection of extracellular vesicles immune-captured from urine by conventional flow cytometry. Scientific Reports. 9 (1), 2042(2019).
  17. Norman, M., et al. L1CAM is not associated with extracellular vesicles in human cerebrospinal fluid or plasma. Nature methods. 18 (6), 631-634 (2021).
  18. Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750(2018).
  19. Mathieu, M., et al. Specificities of exosome versus small ectosome secretion revealed by live intracellular tracking of CD63 and CD9. Nature Communications. 12 (1), 1-18 (2021).
  20. Guo, J., et al. Establishment of a simplified dichotomic size-exclusion chromatography for isolating extracellular vesicles toward clinical applications. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (11), 12145(2021).
  21. Benedikter, B. J., et al. Ultrafiltration combined with size exclusion chromatography efficiently isolates extracellular vesicles from cell culture media for compositional and functional studies. Scientific Reports. 7 (1), 1-13 (2017).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (44), e2359(2010).
  23. Grassucci, R. A., Taylor, D. J., Frank, J. Preparation of macromolecular complexes for cryo-electron microscopy. Nature Protocols. 2 (12), 3239(2007).
  24. Williams, R. L., Urbé, S. The emerging shape of the ESCRT machinery. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8 (5), 355-368 (2007).
  25. Willms, E., et al. Cells release subpopulations of exosomes with distinct molecular and biological properties. Scientific Reports. 6 (1), 1-12 (2016).
  26. Lehrich, B. M., Liang, Y., Fiandaca, M. S. Foetal bovine serum influence on in vitro extracellular vesicle analyses. Journal of Extracellular Vesicles. 10 (3), 12061(2021).
  27. Kornilov, R., et al. Efficient ultrafiltration-based protocol to deplete extracellular vesicles from fetal bovine serum. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1422674(2018).
  28. Böing, A. N., et al. Single-step isolation of extracellular vesicles by size-exclusion chromatography. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).
  29. Zhang, X., Borg, E. G. F., Liaci, A. M., Vos, H. R., Stoorvogel, W. A novel three step protocol to isolate extracellular vesicles from plasma or cell culture medium with both high yield and purity. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1791450(2020).
  30. Guerreiro, E. M., et al. Efficient extracellular vesicle isolation by combining cell media modifications, ultrafiltration, and size-exclusion chromatography. PLoS ONE. 13 (9), 02024276(2018).
  31. Onódi, Z., et al. Isolation of high-purity extracellular vesicles by the combination of iodixanol density gradient ultracentrifugation and bind-elute chromatography from blood plasma. Frontiers in Physiology. 9, 1479(2018).
  32. Yuana, Y., Levels, J., Grootemaat, A., Sturk, A., Nieuwland, R. Co-isolation of extracellular vesicles and high-density lipoproteins using density gradient ultracentrifugation. Journal of Extracellular Vesicles. 3 (1), (2014).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены