JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем протокол скрининга соединений вируса гепатита В (HBV), нацеленных на стадии жизненного цикла до и после вирусного входа, с использованием изотермической титрующей калориметрии для измерения сродства связывания (KD) с котранспортирующим полипептидом таурохолата натрия хозяина. Противовирусную эффективность определяли путем подавления маркеров жизненного цикла вируса (образование cccDNA, транскрипция и вирусная сборка).

Аннотация

Инфекция вируса гепатита В (HBV) считается решающим фактором риска развития гепатоцеллюлярной карциномы. Текущее лечение может только уменьшить вирусную нагрузку, но не привести к полной ремиссии. Эффективная модель гепатоцитов для инфекции HBV обеспечит реальный жизненный цикл вируса, который будет иметь решающее значение для скрининга терапевтических агентов. Большинство доступных анти-HBV агентов нацелены на этапы жизненного цикла после поступления вируса, но не до проникновения вируса. Этот протокол детализирует создание компетентной модели гепатоцитов, способной проводить скрининг на терапевтические агенты, нацеленные на стадии жизненного цикла довирусного входа и после вирусного входа. Это включает в себя нацеливание на связывание таурохолата таурохолата натрия (NTCP), образование, транскрипцию и вирусную сборку на основе imHC или HepaRG в качестве клеток-хозяев. Здесь анализ ингибирования входа HBV использовал куркумин для ингибирования функций связывания и транспортировки HBV через NTCP. Ингибиторы оценивали на сродство связывания (KD) с NTCP с использованием изотермической титрационной калориметрии (ITC) - универсального инструмента для скрининга лекарств HBV на основе термодинамических параметров.

Введение

Инфекция, вызванная вирусом гепатита В (HBV), считается опасным для жизни заболеванием во всем мире. Хроническая инфекция HBV сопряжена с риском цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы1. Современное лечение анти-HBV фокусируется в основном на поствирусном введении с использованием аналогов нуклеоса (t)ide (NA) и интерферона-альфа (IFN-α)2,3. Открытие ингибитора входа HBV, Myrcludex B, определило новую мишень для анти-HBV агентов4. Комбинация ингибиторов входа и АНА при хроническом HBV значительно снизила вирусную нагрузку по сравнению с теми, которые нацелены только на репликацию вируса 5,6. Однако классическая модель гепатоцитов для скрининга ингибиторов входа HBV ограничена низкими уровнями вирусных рецепторов (котранспортирующий полипептид таурохолата натрия, NTCP). Сверхэкспрессия hNTCP в клетках гепатомы (т.е. HepG2 и Huh7) улучшает инфекционность HBV 7,8. Тем не менее, эти клеточные линии экспрессируют низкие уровни ферментов, метаболизирующих лекарства фазы I и II, и проявляют генетическую нестабильность9. Модели гепатоцитов, которые могут помочь нацелиться на различные механизмы соединений-кандидатов против HBV, такие как превирусное вступление, связывание NTCP и проникновение вируса, ускорят идентификацию и разработку эффективных комбинированных схем. Исследование анти-HBV активности куркумина прояснило ингибирование проникновения вируса в качестве нового механизма в дополнение к прерыванию поствирусного входа. Этот протокол детализирует модель хозяина для скрининга входных молекул10 против HBV.

Целью этого метода является изучение потенциальных анти-HBV соединений для ингибирования проникновения вируса, особенно блокирования связывания и транспорта NTCP. Поскольку экспрессия NTCP является критическим фактором для входа в HBV и инфекции, мы оптимизировали протокол созревания гепатоцитов, чтобы максимизировать уровни NTCP11. Кроме того, этот протокол может дифференцировать ингибирующее действие на вход HBV как ингибирование прикрепления HBV по сравнению с ингибированием интернализации. Анализ поглощения таурохолевой кислоты (ТЦА) также модифицировали с использованием метода на основе ИФА вместо радиоизотопа для представления переноса NTCP12,13. Взаимодействие рецептора и лиганда было подтверждено их 3D структурами14,15. Ингибирование функции NTCP может быть оценено путем измерения активности поглощения TCA16. Однако этот метод не предоставил прямых доказательств связывания NTCP с ингибиторами-кандидатами. Таким образом, связывание может быть исследовано с использованием различных методов, таких как поверхностный плазмонный резонанс17, ИФА, анализ теплового сдвига на основе флуоресценции (FTSA)18, FRET19, AlphaScreen и различные другие методы20. Среди этих методов ITC является целевым стандартом в анализе связывания, поскольку он может наблюдать поглощение тепла или излучение почти в каждой реакции21. Сродство связывания (KD) NTCP и соединений-кандидатов оценивали непосредственно с использованием ITC; эти значения сродства были более точными, чем те, которые были получены с использованием модели прогнозирования in silico 22.

Этот протокол охватывает методы созревания гепатоцитов, инфекции HBV и скрининга на ингибитор входа HBV. Вкратце, модель гепатоцитов была разработана на основе клеточных линий imHC и HepaRG. Культивируемые клетки дифференцировали в зрелые гепатоциты в течение 2 недель. Повышение уровня NTCP было обнаружено с помощью ПЦР в реальном времени, вестерн-блоттинга и проточной цитометрии11. Вирион гепатита В (HBVcc) был получен и собран из HepG2.2.15. Дифференцированный imHC или HepaRG (d-imHC, d-HepaRG) профилактически лечили анти-HBV кандидатами за 2 ч до инокуляции вирионом HBV. Ожидаемым результатом эксперимента стала идентификация агентов, снижающих клеточный HBV и инфекционность. Анти-NTCP активность оценивали с использованием анализа поглощения TCA. Активность NTCP может быть подавлена агентами, которые специально связывали NTCP. Метод ITC был использован для исследования возможности интерактивного связывания, которое могло бы предсказывать ингибиторы и их белки-мишени, определяя сродство связывания (KD) лиганда для рецептора посредством нековалентных взаимодействий биомолекулярного комплекса23,24. Например, KD ≥ 1 × 103 мМ представляет собой слабое связывание, KD ≥ 1 × 106 мкМ представляет собой умеренное связывание, а KD ≤ 1 × 109 нМ представляет собой сильное связывание. ΔG напрямую коррелирует с связывающими взаимодействиями. В частности, реакция с отрицательным ΔG является экзергонической реакцией, указывающей на то, что связывание является спонтанным процессом. Реакция с отрицательным ΔH указывает на то, что процессы связывания зависят от водородной связи и сил Ван-дер-Ваальса. Как поглощение TCA, так и данные ITC могут быть использованы для скрининга агентов против HBV. Результаты этих протоколов могут обеспечить основу не только для скрининга против HBV, но и для взаимодействия с NTCP, оцениваемого через сродство связывания и транспортную функцию. В этой статье описывается подготовка и характеристика клеток-хозяев, экспериментальное проектирование и оценка входа анти-HBV вместе с сродством связывания NTCP.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие процедуры должны выполняться в вытяжке биологической опасности класса II или вытяжке с ламинарным потоком. Обращение с HBV было этически одобрено IRB (MURA2020/1545). Смотрите Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех растворах, реагентах, оборудовании и клеточных линиях, используемых в этом протоколе.

1. Подготовка клеток-хозяев (зрелых гепатоцитов)

  1. Культивировать гепатоциты (3,75 × 105 клеток HepaRG или imHC) и поддерживать в культуральной колбе размером 75см2 с 10 мл среды DMEM/F12 с добавлением 10% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 1% L-глутамина, пенициллина 100 Ед/мл и стрептомицина 100 мкг/мл. Подождите, пока клетки достигнут 80%-90% слияния (в течение 1 недели).
  2. Выбросьте старую среду из колбы и промыть клетки 4 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
  3. Аспирировать PBS и добавить 4 мл 0,05% трипсина-ЭДТА.
  4. Инкубируйте колбу в инкубаторе с температурой 37 °C в течение 2-3 мин и проверяйте адгезивные клетки с помощью перевернутого микроскопа с 10-кратной объективом. Убедитесь, что монослой отделился от обрабатываемой поверхности.
  5. Ингибировать трипсин путем добавления 4 мл питательной среды, дополненной 10% FBS, в колбу и тщательно повторно суспендировать собранные клетки. Переложите клеточную суспензию в коническую трубку 15 мл и центрифугу в течение 3 мин при 300 × г, 25 °C.
  6. Аспирировать супернатант из клеточной гранулы и повторно суспендировать 1-2 мл предварительной питательной среды, дополненной 10% ФБС и антибиотиками.
  7. Смешайте по 10 мкл каждой клеточной суспензии и трипан синего цвета и подсчитайте клетки с помощью гемацитометра. Убедитесь, что жизнеспособность клеток выше 90%, прежде чем переходить к следующему шагу.
  8. Семена 1 × 106 клеток на 2 мл в каждой лунке 6-луночной пластины и выдерживают в полной среде DME/F12 до тех пор, пока клетки не достигнут 100% слияния.
  9. Для созревания печени готовят среду созревания печени (среду Е Уильямса, дополненную 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 5 мкг/мл инсулина, 50 мкМ гидрокортизона, 2 мМ L-глутамина и 2% ДМСО).
  10. Заменяйте питательную среду 2 раза в неделю.
  11. Поддерживайте гепатоциты в среде созревания в течение 2 недель, чтобы получить зрелые гепатоциты, готовые к инфекции HBV.

2. Количественная оценка сотового NTCP

  1. Измерение экспрессии NTCP с помощью ПЦР в реальном времени
    1. Соберите гранулы зрелых гепатоцитов путем трипсинизации (см. Шаги 1.2-1.5).
    2. Извлеките общую РНК из клеточной гранулы с помощью набора для экстракции РНК с обработкой DNase I.
    3. Синтезируют кДНК из 200 нг общей РНК с помощью олиго-дТ-праймера и системы обратной транскрипции в соответствии с инструкциями производителя.
    4. Разбавьте кДНК до 50 нг/мкл и используйте ее в качестве шаблона для реакции ПЦР. Смешайте 2 мкл разбавленной кДНК с реагентами мастер-микса ПЦР, содержащими раствор SYBR green qRT-PCR Kit с 5 мкМ NTCP-специфическими праймерами (5'-GGACATGAACCTCAGCATTGTG-3' и 5'-ATCATAGATCCCCCTGGAGTAGAT-3').
    5. Для нормализации используйте GAPDH в качестве гена домашнего хозяйства со специфическими праймерами (5'-GAAATCCCATCACCATCTTCC-3' и 5'-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3').
    6. Амплифицировать образцы кДНК с помощью термоциклера при следующих температурных условиях: 1 цикл продолжительностью 3 мин при 95 °C (начальная денатурация); 40 циклов по 30 с при 95 °C (денатурация), 30 с при 60 °C до 65 °C (отжиг), 30 с при 72 °C (расширение); 1 цикл 5 мин при 72 °C (окончательное удлинение).
    7. Рассчитать изменение складки NTCP в зрелых гепатоцитах над недифференцированными клетками, используя GAPDH в качестве калибратора гена на основе метода 2-ΔΔCT .
  2. Количественная оценка NTCP с использованием анализа вестерн-блот
    1. Собирают гепатоциты с помощью клеточного скребка и центрифугируют их при 300 х г, 25 °C в течение 5 мин для сбора клеточной гранулы.
    2. Следуйте инструкциям производителя буфера RIPA, чтобы извлечь клеточный белок со 100 мкл буфера RIPA, содержащего 1x ингибитор протеазы.
    3. Измерьте общую концентрацию белка с помощью метода бицинхониновой кислоты (BCA).
    4. Смешайте 12,5 мкл белка с 2-кратным нагрузочным красителем в соотношении 1:1 по объему.
    5. Кипятить белковую смесь и стандартную лестницу при 95 °C в течение 5 мин.
    6. Добавьте 1x работающий буфер в камеру электрофореза.
    7. Нагрузка 5 мкл белка стандартной лестницы или 20 мкл вареной белковой смеси в 10% (мас./об.) полиакриламидном геле.
    8. Выполняют гель-электрофорез: 50 В в течение 30 мин с последующим 90 В в течение 1 ч при комнатной температуре.
    9. Подготовьте мембрану PVDF, замочив ее в метаноле на 30 с, промыть ее двойной дистиллированной водой в течение 1-2 минут и замочить вместе с двумя кусочками фильтровальной бумаги в буфере переноса на 10 минут или до использования.
    10. Поместите фильтровальную бумагу на анодную пластину полусухой передаточной ячейки; затем поместите сверху мембрану PVDF, гель и фильтровальную бумагу в указанном порядке.
    11. Перенесите белки из геля на мембрану PVDF при 10 В в течение 25 мин при комнатной температуре.
    12. Блокируют мембрану раствором блокировки WB в течение 1 ч при комнатной температуре.
    13. Инкубировать мембрану с котранспортирующим полипептидом против таурохолата натрия (анти-NTCP) (разведение 1:100) при 4 °C в течение ночи.
    14. Промыть мембрану 3 х 10 мин с помощью TBST.
    15. Инкубируют мембрану пероксидазой хрена (HRP)-конъюгированным козьим анти-кроликовым антителом (разведение 1:10 000) в течение 1 ч при комнатной температуре.
    16. Промыть мембрану 3 х 10 мин с TBST, а затем 1 х 5 мин с TBS.
    17. Обнаружение NTCP с помощью подложки HRP (см. Таблицу материалов).
    18. Добавляют не менее 0,1 мл раствора субстрата HRP/см2 мембраны и инкубируют мембрану в течение 3-5 мин в темноте.
    19. Визуализируйте NTCP с помощью системы документирования геля в режиме хемилюминесценции, выберите опцию маркера для мембраны, отрегулируйте время экспозиции с накопительным режимом каждые 1 мин и сделайте фотографию с различным временем экспозиции в течение 5 мин.
    20. Снимите и прощупывайте пятно с помощью мышиного антитела против GAPDH (разведение 1:200 000) и HRP-конъюгированного козьего антимышьего вторичного антитела (разведение 1:10 000).
  3. Измерение уровня NTCP с помощью проточной цитометрии
    1. Соберите клеточные гранулы зрелых гепатоцитов путем инкубации клеток с 8 мМ ЭДТА в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте использования трипсина или других протеаз, которые могут нарушить рецепторы клеточной поверхности. Поскольку NTCP является белком рецептора клеточной поверхности, повреждение из-за трипсинизации может дать отрицательные результаты.
    2. Зафиксируйте гепатоциты 300 мкл 3,7% параформальдегида в 1x PBS в течение 15 мин. Переложите клеточную суспензию в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл и центрифугу в течение 10 мин при 300 × г, 25 °C.
    3. Промыть клетки 2x с 700 мкл 1x PBS с 1% FBS (v/v), центрифугу в течение 10 мин при 300 × г, 25 °C, добавить 300 мкл 0,05% Тритона X-100 в PBS к грануле клетки и инкубировать клетки при комнатной температуре в течение 20 мин для их проницаемости.
    4. Центрифугу в течение 10 мин при 300 × г, 25 °C, промыть ячейку гранулы 3 х 1 мин с 700 мкл PBS, содержащей 1% FBS (v/v). Инкубируют клетки с первичным антителом против NTCP (разведение 1:100) при 4 °C в течение 30 мин. Промыть ячейки 3 х 1 мин с буфером Perm/Wash и центрифугой в течение 10 мин при 300 × г, 25 °C.
    5. Окрашивают клетки вторичным антителом, конъюгированным с Alexa Fluor 488 при 4 °C в течение 30 мин. Промыть ячейки 3 х 1 мин с буфером Perm/Wash и центрифугой в течение 10 мин при 300 × г, 25 °C. Повторно суспендировать ячейку гранулы с 200 мкл PBS с 1% FBS (v/v).
    6. Включите проточный цитометр, прогрейте лазер на 15 минут и выполните обычную очистку.
    7. Выберите параметры измерения, включая прямое рассеяние (FSC), боковое рассеяние (SSC) и изотиоцианат флуоресцеина (FITC) или фикоэритрин (PE), и установите автоматическую настройку компенсации программным обеспечением. Включите контрольные образцы компенсации: неиспорченный контроль, контроль, окрашенный FITC, и контроль PE-окрашенный.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры FSC и SSC используются для определения размера и гранулярности отдельных клеток для отбора клеточной популяции для анализа гатинга. Детектор флуоресцентных каналов имеет каналы FITC и PE . Для этого протокола выберите канал FITC для обнаружения Alexa Fluor 488.
    8. Запустите незапятнанный образец со средней текучей скоростью потока (60 мкл/мин), отрегулируйте порог FSC и SSC до тех пор, пока они не покроют интересующую популяцию клеток, отметьте область затвора в этой области и примените ко всем элементам управления компенсацией.
    9. Установите флуоресцентную фотоумножительную трубку (PMT) с помощью незапятнанного управления и отрегулируйте напряжение PMT FITC или PE в отрицательном квадранте. Запустите положительный окрашенный образец и отрегулируйте FITC или PE по шкале положительного квадранта. Запустите элементы управления, окрашенные FITC или PE, рассчитайте компенсацию и примените ее к настройкам образца. Запустите образец гепатоцитов для измерения уровня NTCP.
    10. Анализ окрашенных гепатоцитов с помощью программного обеспечения проточного цитометра (см. Таблицу материалов).
      1. В окнах BD FACSuite щелкните трубку управления на вкладке Источники данных и дождитесь появления необработанных данных.
      2. На вкладке Лист справа нажмите кнопку Ellipse Gate , выделите заполнение ячеек в SSC и точечный график FSC с помощью курсора мыши и дождитесь появления круга P1.
      3. Нажмите кнопку Interval Gate и отметьте область в гистограмме FITC, начиная с самого высокого значения интенсивности флуоресценции справа. Обратите внимание на появившуюся линию P2.
      4. Щелкните трубку эксперимента и обратите внимание, что данные на вкладке Лист изменяются. Нажмите на кнопку Статистика , а затем на пустое место на листе. Наблюдайте за статистическими значениями популяции NTCP, которые появляются.

3. Производство частиц HBV, полученных из клеточной культуры (HBVcc)

  1. Культивирование HepG2.2.15 в полной среде (DMEM с добавлением 10% FBS, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина) в чашке Петри 10 см в течение 24 ч.
  2. Замените полную среду, дополненную 380 мкг/мл генетином (G418), когда HepG2.2.15 достигнет 60%-70% слияния. Собирать урожай кондиционированной среды каждые 2 дня; хранить среду, содержащую HBV, при 4 °C.
  3. Удаляют клеточный мусор путем центрифугирования супернатанта при 5000 × г, 4 °C в течение 20 мин. Соберите кондиционированную среду с помощью шприца объемом 20 мл и отфильтруйте ее через фильтр с низким содержанием белка 0,45 мкм для удаления клеточного мусора.
  4. Чтобы сконцентрировать HBV, разбавляют 1 объем концентратора с 3 объемами фильтрованного супернатанта со стадии 3.3 в конической центрифужной трубке и тщательно перемешивают раствор путем инверсии трубки. Поместите смесь при 4 °C в течение 1 ч. Центрифугируйте раствор в течение 1 ч при 1 500 × г, 4 °C и убедитесь, что видна белая гранула.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На каждые 30 мл отфильтрованного супернатанта на этапе 3.3 добавляют 10 мл концентратора, чтобы достичь 40 мл общего объема.
  5. Оцените титр HBV (эквивалент генома) с помощью репликона HBV 1.3-mer WT в качестве стандартной кривой в диапазоне от 1 × 102 до 1 × 1010 с использованием абсолютной ПЦР в реальном времени, как описано ранее11.
  6. Аккуратно восстановите гранулы в FBS и храните до 1 года при температуре −80 °C в одноразовых аликвотах.

4. Входной анализ на анти-HBV

  1. Поддерживать 100% сливающийся imHC или HepaRG в 6-луночных пластинах в среде созревания (2% DMSO в среде Уильямса E, 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 5 мкг/мл инсулина, 50 мкМ гидрокортизона и 2 мМ L-глутамина) в течение 2 недель и менять среду 2 раза в неделю.
  2. Аспирировать среду, затем добавить куркумин (10-30 мкМ) или 4 мкМ циклоспорина А (CsA), разбавленный средой Уильяма Е в течение 2 ч. Аспирировать потенциальный ингибитор входа HBV и заменить его 1 мл среды William's E, содержащей 4% полиэтиленгликоля.
  3. Добавляют частицы HBV в культуральную среду при кратности инфекции (MOI) 100 на лунку и инкубируют при 37 °C в течение 18 ч. Выбросьте супернатант, добавьте 2 мл холодного PBS и осторожно закрутите, чтобы смыть старую среду с несвязанным HBV.
  4. Добавьте 2 мл полной среды William's E и культуры в течение 7 дней. Аспирировать среду, промыть клетки 1x PBS и зафиксировать клетки 3,7% параформальдегидом в PBS в течение 15 мин при комнатной температуре. Пермеабилизируют и блокируют инфицированные клетки раствором, блокирующим ПЧ (0,2% тритона Х-100 и 3% бычьего сывороточного альбумина в PBS) и инкубируют их в течение 60 мин при комнатной температуре.
  5. Добавляют первичное антитело (анти-HBV основной антиген) в разведении 1:200 в блокирующем растворе и инкубируют в течение ночи при 4 °C. Промыть ячейки 3 х 1 мин моющим раствором (0,5% Tween 20 в PBS).
  6. Добавьте вторичное антитело (разведение 1:500) в раствор, блокирующий ПЧ, инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре и промывайте клетки 3 х 1 мин моющим раствором.
  7. Установите образец с антизатухней монтажной средой с 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI) и накройте стеклянной крышкой. Обнаружение флуоресцентного сигнала с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтром DAPI (Ex 352-402 nM и Em 417-477) и полиэтиленовым фильтром (Ex 542-582 и Em 604-644), а также объективом 20x, и определение входной активности анти-HBV соединений-кандидатов.

5. HbV-клеточный связывающий анализ

  1. Поддерживать 100% сливающийся imHC или HepaRG в 6-луночных пластинах в среде созревания (2% DMSO в среде Уильямса E, 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 5 мкг/мл инсулина, 50 мкМ гидрокортизона и 2 мМ L-глутамина) в течение 2 недель и менять среду 2 раза в неделю.
  2. Аспирировать среду, затем добавить куркумин (10-30 мкМ) или циклоспорин А (4 мкМ), разведенные в среде Уильяма Е в течение 2 ч. Аспирировать ингибитор входа HBV и заменить его 1 мл среды William's E, содержащей 4% полиэтиленгликоля.
  3. Добавляют частицы HBV в культуральную среду при MOI 100 на лунку и инкубируют при 4 °C в течение 2 ч, чтобы обеспечить связывание HBV с гепатоцитами. Отбросьте среду, содержащую несвязанный HBV, добавьте 2 мл холодного PBS и осторожно закрутите, чтобы удалить следы отработанной среды.
  4. Соберите инфицированные клетки с помощью клеточного скребка и разрушайте клетки с буфером лизиса. Перенесите лизат в сборную трубку и извлеките общую ДНК для оценки ДНК HBV с использованием ПЦР в режиме реального времени со специфическими праймерами для HBV (прямая праймер: 5'- GTT GCC CGT TTG TCC TCT AATTC-3', и обратная праймер: 5'- GGA GGG ATA CAT AGA GGT TCC TTG A-3') с использованием PRNP (прямая грунтовка: 5'- GACCAATTTATGCCTACAGC-3', обратная праймер: 5'- TTTATGCCTACAGCCTCCTA-3') в качестве внутреннего контроля.
  5. Амплируйте продукты ПЦР в термоциклере, используя температурные условия, описанные в шаге 2.1.
  6. Рассчитайте относительные уровни ДНК HBV /1 × 106 клеток при лечении по сравнению с контролем с использованием PRNP в качестве гена-калибратора на основе метода 2-ΔΔCT .

6. Анализ поглощения таурохолевой кислоты (ТЦА)

  1. Поддерживать 100% сливающиеся клетки imHC и HepaRG в среде созревания в течение 14 дней.
  2. Аспирировать среду и промыть гепатоциты 1x PBS. Добавьте куркумин или циклоспорин А (10-50 мкМ), разведенные в среде Уильяма Е в течение 2 ч. Заменить среду раствором таурохолевой кислоты натрия (0,5 М гидрата таурохолата натрия в 1x HEPES) и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Аспирировать раствор натриевой таурохолевой кислоты и промыть 3x холодным 1x HEPES. Добавьте 300-500 мкл холодного 1x HEPES и соберите ячейки с помощью скребков на льду.
  4. Гомогенизируют клетки ультразвуком на частоте 20 кГц в течение 20 с и инкубируют на льду в течение 5 мин. Центрифугируйте лизаты при 10 000 × г в течение 20 мин для осаждения клеточного мусора. Соберите супернатант и оцените внутриклеточную концентрацию таурохолевой кислоты с помощью набора для анализа TCA ELISA (см. Таблицу материалов).

7. Определение белково-лигандных взаимодействий с помощью изотермической титрующей калориметрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта система анализа была разработана на основе программного обеспечения MicroCal PEAQ-ITC (ITC).

  1. Подготовьте буфер (50 мМ буфер Tris-HCl, рН 7,0).
  2. Подготовьте 15 мкМ NTCP в буфере.
  3. Готовят 150 мкМ потенциальных растворов ингибиторов ВГВ в буфере.
  4. Промыть пробоотборную ячейку, эталонную ячейку и шприц в приборе ITC с помощью буфера (шаг 7.1.).
    1. Запустите программное обеспечение ITC, дважды щелкнув значок программного обеспечения в системах Windows. На вкладке Выполнить эксперимент выберите Метод microCal для 19 Injection.itcm и нажмите кнопку Открыть. Когда откроется новое окно, нажмите на вкладку «Очистка» и в окне «Метод очистки» выберите кнопку «Стирка» для метода очистки клеток и кнопку «Промыть» для метода очистки шприца. Нажмите кнопку Далее и следуйте инструкциям на экране.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этап стирки может занять 1,4 часа.
  5. Загрузить образец в ЦМТ; на вкладке Запуск эксперимента нажмите кнопку Загрузить и прочитайте инструкции на экране. Нажмите «Далее» и следуйте видеоинструкциям, пока этот шаг загрузки не будет завершен.
    1. Заполните эталонную ячейку буфером раствора с помощью шприца. Заполните ячейку образца 15 мкМ NTCP в буфере с помощью шприца и удалите лишний раствор NTCP над ячейкой образца. Заполните шприц 150 мкМ раствором куркумина (лиганда), избегая пузырьков воздуха в шприце.
  6. Запустите образец и на вкладке Запуск эксперимента нажмите кнопку Выполнить . Понаблюдайте за окнами с левой стороны, показывающими экспериментальную информацию и экспериментальную обстановку. Введите концентрации лиганда и белка в виде 150 мкМ в [Syr], 15 мкМ в [Клетке] и 25 °C в температуре.
  7. В программном обеспечении нажмите « Пуск », чтобы выполнить процесс инъекции, и подождите 1,4 часа, пока взаимодействие белка и лиганда завершится.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выцветшая кнопка анализа появляется под окнами программного обеспечения.
  8. Обратите внимание, что кнопка анализа становится ярче после завершения инъекции. Нажмите на кнопку анализа в управляющем программном обеспечении, чтобы проанализировать необработанные данные с помощью программного обеспечения для анализа. Щелкните обзор , чтобы отобразить необработанные данные, и выберите модель подгонки в качестве одного набора сайта привязки.
  9. Убедитесь, что в состоянии привязки отображаются экспериментальные данные (привязка, без привязки, контрольные или контрольные данные) и что значения эксперимента (KD, ΔG, ΔH, TΔS и N) представлены на панели программного обеспечения.
  10. Экспортируйте термодинамические параметры, которые предсказывают связывание взаимодействия, включая водородную связь, связь Ван-дер-Ваальса и гидрофобное взаимодействие, в формат tif или jpeg.
  11. После завершения эксперимента промыть клетку образца, следуя шагу 7.4.

8. Статистический анализ

  1. Выполните все эксперименты в трех независимых репликах (n = 3).
  2. Представить экспериментальные данные как средство ± SD и выполнить статистический анализ с использованием требуемого программного обеспечения для статистического анализа.
  3. Используйте двухсторонний непарный t-тест студентов для сравнения двух средних значений или примените односторонний дисперсионный анализ (ANOVA) с Dunnett для многократного сравнения между несколькими значениями и контрольным значением. Установите уровень значимости на p ≤ 0,05.

Результаты

Наблюдались особенности созревания печени, включая бинуклеированные клетки и полигонально-образную морфологию (рисунок 1), особенно в дифференцированной стадии имГК (рисунок 1А). Значительное увеличение экспрессии NTCP было измерено в d-HepaRG и d-imHC в 7 и 40 раз...

Обсуждение

HbV-инфекция инициируется через низкоаффинное связывание с протеогликанами гепарана сульфата (HSPG) на гепатоцитах25 с последующим связыванием с NTCP с последующей интернализацией через эндоцитоз26. Поскольку NTCP является критически важным рецептором для входа HBV, н...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что исследование проводилось при отсутствии каких-либо коммерческих или финансовых отношений, которые могли бы быть истолкованы как потенциальный конфликт интересов.

Благодарности

Этот исследовательский проект поддерживается Университетом Махидол и Таиландским научным исследованием и инновациями (TSRI), отдельно присуждаемым А. Вонгкаджорнсилпу и К. Са-нгиамсунторну. Эта работа была финансово поддержана Управлением Национального совета по научным исследованиям и инновационной политике в области высшего образования через Отдел управления программами по конкурентоспособности (номер гранта C10F630093). A. Wongkajornsilp является получателем гранта Chalermprakiat медицинского факультета больницы Сирирадж Университета Махидол. Авторы хотели бы поблагодарить мисс Савини Симахан (Отличный центр по открытию лекарств, факультет естественных наук, Университет Махидол) за ее помощь с техникой ITC.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Cell lines
HepaRG Cells, CryopreservedThermo Fisher ScientificHPRGC10
Hep-G2/2.2.15 Human Hepatoblastoma Cell LineMerckSCC249
Reagents
4% Paraformadehyde Phosphate Buffer SolutionFUJIFLIM Wako chemical163-20145
BD Perm/Wash bufferBD Biosciences554723Perm/Wash buffer
Cyclosporin Aabcam59865-13-3
EDTAInvitrogen15575-0388 mM
G 418 disulfate saltMerck108321-42-2
Halt Protease Inhibitor Cocktail  EDTA-free (100x)Thermo Scientific78425
HEPESMerck7365-45-9
illustraTM RNAspin Mini RNA isolation kitsGE Healthcare25-0500-71
illustra RNAspin Mini RNA Isolation KitGE Healthcare25-0500-71
ImProm-II Reverse Transcription SystemPromegaA3800
KAPA SYBR FAST qPCR KitKapa BiosystemsKK4600
Lenti-X ConcentratorTakara bioPT4421-2concentrator
Luminata crescendo Western HRP substrateMerckWBLUR0100
Master Mix (2x) UniversalKapa BiosystemsKK4600
Nucleospin DNA extraction kitmacherey-nagel1806/003
Phosphate buffered salineMerckP3813
Polyethylene glycol 8000Merck25322-68-3
ProLong Gold Antifade MountantThermo scientificP36930
Recombinant NTCPCloud-CloneRPE421Hu02
RIPA Lysis Buffer (10x)Merck20-188
TCASigma345909-26-4
TCA Elisa kitMybiosourceMB2033685
Triton X-100Merck9036-19-5
Trypsin-EDTAGibco25200072Dilute to 0.125%
Antibodies
    Anti-NTCP1 antibodyAbcamab1310841:100 dilution
    Anti-GAPDH antibodyThermo Fisher ScientificAM43001:200,000 dilution
   HRP-conjugated goat anti-rabbit antibodyAbcamab2057181:10,000 dilution
   HRP goat anti-mouse secondary antibodyAbcamab970231:10,000 dilution
   Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 488InvitrogenA-110081:500 dilution
Reagent composition
1° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     3% BSASigmaA7906-100GWorking concentration: 3%
     Sodium azideSigma199931Working concentration: 0.05%
Hepatocyte Growth Medium
      DME/F12Gibco12400-024
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
Hepatic maturation medium
      Williams’ E mediumSigma AldrichW4125-1L
      10% FBSSigma AldrichF7524
      1% Pen/StrepHyClonSV30010
      1% GlutaMAXGibco35050-061
      5 µg/mL  InsulinSigma Aldrich91077C-100MG
      50 µM hydrocotisoneSigma AldrichH0888-1g
     2% DMSOPanReac AppliChemA3672-250ml
IF Blocking solution
     1x PBSGibco21300-058
     3% BSASigmaA7906-100GWorking concentration: 3%
     0.2% Triton X-100SigmaT8787Working concentration: 0.2%
RIPA Lysis Buffer SolutionMerck20-188Final concentration: 1X
     Protease Inhibitor CocktailThermo Scientific78425Final concentration: 1X
       Na3VO4Final concentration: 1 mM
       PMSFFinal concentration: 1 mM
       NaFFinal concentration: 10 mM
Western blot reagent
     10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     Tween 20Merck9005-64-5
     1x TBST0.1% Tween 20
     1x PBSGibco21300-058
     Pierce BCA Protein Assay KitThermo Fisher ScientificA53225
     Polyacrylamide gelBio-Rad161-0183
     Ammonium Persulfate (APS)Bio-Rad161-0700Final concentration: 0.05%
    TEMEDBio-Rad161-0800Stacker gel: 0.1%, Resolver gel: 0.05%
    2x Laemmli Sample BufferBio-Rad161-0737Final concentration: 1X
    Precision Plus Protein Dual Color StandardsBio-Rad161-0374
WB Blocking solution/ 2° Antibody dilution buffer
     1x TBST
     5% Skim milk (nonfat dry milk)Bio-Rad170-6404Working concentration: 5%
1x Running buffer 1 L
      10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     GlycineSigmaG889814.4 g
     SDSMerck7910Working concentration: 0.1%
Blot transfer buffer 500 mL
      10x Tris-buffered saline (TBS)Bio-Rad170-6435Final concentration: 1X
     GlycineSigmaG88987.2 g
     MethanolMerck106009100 mL
Mild stripping solution 1 LAdjust pH to 2.2
    GlycineSigmaG889815 g
     SDSMerck79101 g
     Tween 20Merck9005-64-510 mL
Equipments
15 mL centrifuge tubeCorning430052
50 mL centrifuge tubeCorning430291
Airstream Class IIEsco2010621Biological safety cabinet
CelCulture CO2 IncubatorEsco2170002Humidified tissue culture incubator
CFX96 Touch Real-Time PCR DetectorBio-Rad1855196
FACSVerse Flow CytometerBD Biosciences651154
Graduated pipettes (10 mL)Jet BiofilGSP010010
Graduated pipettes (5 mL)Jet BiofilGSP010005
MicroCal PEAQ-ITCMalvernIsothermal titration calorimeters
Mini PROTEAN Tetra CellBio-Rad1658004Electrophoresis chamber
Mini Trans-blot absorbent filter paperBio-Rad1703932
Omega Lum G Imaging SystemAplegen8418-10-0005
Pipette controllerEppendorf4430000.018Easypet 3
PowerPac HCBio-Rad1645052Power supply
PVDF membraneMerckIPVH00010
T-75 cell culture flaskCorning431464U
Trans-Blot SD Semi-Dry Transfer CellBio-Rad1703940Semi-dry transfer cell
Ultrasonic processor (Vibra-Cell VCX 130)Sonics & Materials
Versati Tabletop Refrigerated CentrifugeEscoT1000RCentrifuge with swinging bucket rotar

Ссылки

  1. Levrero, M., Zucman-Rossi, J. Mechanisms of HBV-induced hepatocellular carcinoma. Journal of Hepatology. 64 (1), 84-101 (2016).
  2. Kim, K. -. H., Kim, N. D., Seong, B. -. L. Discovery and development of anti-HBV agents and their resistance. Molecules. 15 (9), 5878-5908 (2010).
  3. Shaw, T., Bowden, S., Locarnini, S. Chemotherapy for hepatitis B: New treatment options necessitate reappraisal of traditional endpoints. Gastroenterology. 123 (6), 2135-2140 (2002).
  4. Volz, T., et al. The entry inhibitor Myrcludex-B efficiently blocks intrahepatic virus spreading in humanized mice previously infected with hepatitis B virus. Journal of Hepatology. 58 (5), 861-867 (2013).
  5. Mak, L. -. Y., Seto, W. -. K., Yuen, M. -. F. Novel antivirals in clinical development for chronic hepatitis B infection. Viruses. 13 (6), 1169 (2021).
  6. Zuccaro, V., Asperges, E., Colaneri, M., Marvulli, L. N., Bruno, R. HBV and HDV: New Treatments on the Horizon. Journal of Clinical Medicine. 10 (18), 4054 (2021).
  7. Iwamoto, M., et al. Evaluation and identification of hepatitis B virus entry inhibitors using HepG2 cells overexpressing a membrane transporter NTCP. Biochemical and Biophysical Research Communications. 443 (3), 808-813 (2014).
  8. Tong, S., Li, J. Identification of NTCP as an HBV receptor: the beginning of the end or the end of the beginning. Gastroenterology. 146 (4), 902-905 (2014).
  9. Xuan, J., Chen, S., Ning, B., Tolleson, W. H., Guo, L. Development of HepG2-derived cells expressing cytochrome P450s for assessing metabolism-associated drug-induced liver toxicity. Chemico-Biological Interactions. 255, 63-73 (2016).
  10. Thongsri, P., et al. Curcumin inhibited hepatitis B viral entry through NTCP binding. Scientific Reports. 11 (1), 19125 (2021).
  11. Sa-Ngiamsuntorn, K., et al. An immortalized hepatocyte-like cell line (imHC) accommodated complete viral lifecycle, viral persistence form, cccDNA and eventual spreading of a clinically-isolated HBV. Viruses. 11 (10), 952 (2019).
  12. Watashi, K., et al. Cyclosporin A and its analogs inhibit hepatitis B virus entry into cultured hepatocytes through targeting a membrane transporter, sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP). Hepatology. 59 (5), 1726-1737 (2014).
  13. Kaneko, M., et al. A novel tricyclic polyketide, Vanitaracin A, specifically inhibits the entry of hepatitis B and D viruses by targeting sodium taurocholate cotransporting polypeptide. Journal of Virology. 89 (23), 11945-11953 (2015).
  14. Manta, B., Obal, G., Ricciardi, A., Pritsch, O., Denicola, A. Tools to evaluate the conformation of protein products. Biotechnology Journal. 6 (6), 731-741 (2011).
  15. Martinez Molina, D., Nordlund, P. The cellular thermal shift assay: a novel biophysical assay for in situ drug target engagement and mechanistic biomarker studies. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 56, 141-161 (2016).
  16. Appelman, M. D., Chakraborty, A., Protzer, U., McKeating, J. A., van de Graaf, S. F. J. N-Glycosylation of the Na+-taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) determines its trafficking and stability and is required for hepatitis B virus infection. PLoS One. 12 (1), 0170419 (2017).
  17. Tsukuda, S., et al. A new class of hepatitis B and D virus entry inhibitors, proanthocyanidin and its analogs, that directly act on the viral large surface proteins. Hepatology. 65 (4), 1104-1116 (2017).
  18. Klumpp, K., et al. High-resolution crystal structure of a hepatitis B virus replication inhibitor bound to the viral core protein. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (49), 15196-15201 (2015).
  19. Donkers, J. M., Appelman, M. D., van de Graaf, S. F. J. Mechanistic insights into the inhibition of NTCP by myrcludex B. JHEP Reports. 1 (4), 278-285 (2019).
  20. Saso, W., et al. A new strategy to identify hepatitis B virus entry inhibitors by AlphaScreen technology targeting the envelope-receptor interaction. Biochemical and Biophysical Research Communications. 501 (2), 374-379 (2018).
  21. Baranauskiene, L., Kuo, T. C., Chen, W. Y., Matulis, D. Isothermal titration calorimetry for characterization of recombinant proteins. Current Opinion in Biotechnology. 55, 9-15 (2019).
  22. Zhang, J., et al. Structure-based virtual screening protocol for in silico identification of potential thyroid disrupting chemicals targeting transthyretin. Environmental Science & Technology. 50 (21), 11984-11993 (2016).
  23. Duff, J. M. R., Grubbs, J., Howell, E. E. Isothermal titration calorimetry for measuring macromolecule-ligand affinity. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (55), e2796 (2011).
  24. Du, X., et al. Insights into protein-ligand interactions: mechanisms, models, and methods. International Journal of Molecular Sciences. 17 (2), 144 (2016).
  25. Sureau, C., Salisse, J. A conformational heparan sulfate binding site essential to infectivity overlaps with the conserved hepatitis B virus A-determinant. Hepatology. 57 (3), 985-994 (2013).
  26. Herrscher, C., et al. Hepatitis B virus entry into HepG2-NTCP cells requires clathrin-mediated endocytosis. Cellular Microbiology. 22 (8), 13205 (2020).
  27. Gripon, P., et al. Infection of a human hepatoma cell line by hepatitis B virus. Proceedings of the National Academy of Sciences. 99 (24), 15655-15660 (2002).
  28. Mayati, A., et al. Functional polarization of human hepatoma HepaRG cells in response to forskolin. Scientific Reports. 8 (1), 16115 (2018).
  29. Sells, M. A., Chen, M. L., Acs, G. Production of hepatitis B virus particles in Hep G2 cells transfected with cloned hepatitis B virus DNA. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 84 (4), 1005-1009 (1987).
  30. Freyer, M. W., Lewis, E. A. Isothermal titration calorimetry: experimental design, data analysis, and probing macromolecule/ligand binding and kinetic interactions. Methods in Cell Biology. 84, 79-113 (2008).
  31. Srivastava, V. K., Yadav, R., Misra, G. . Data Processing Handbook for Complex Biological Data Sources. , 125-137 (2019).
  32. Seeger, C., Mason, W. S. Sodium-dependent taurocholic cotransporting polypeptide: a candidate receptor for human hepatitis B virus. Gut. 62 (8), 1093-1095 (2013).
  33. Seeger, C., Sohn, J. A. Targeting hepatitis B virus with CRISPR/Cas9. Molecular Therapy - Nucleic Acids. 3, 216 (2014).
  34. Ni, Y., et al. Hepatitis B and D viruses exploit sodium taurocholate co-transporting polypeptide for species-specific entry into hepatocytes. Gastroenterology. 146 (4), 1070-1083 (2014).
  35. Chai, N., et al. Properties of subviral particles of hepatitis B virus. Journal of Virology. 82 (16), 7812-7817 (2008).
  36. Moore, A., Chothe, P. P., Tsao, H., Hariparsad, N. Evaluation of the interplay between uptake transport and CYP3A4 induction in micropatterned cocultured hepatocytes. Drug Metabolism and Disposition. 44 (12), 1910-1919 (2016).
  37. Parvez, M. K., et al. Plant-derived antiviral drugs as novel hepatitis B virus inhibitors: Cell culture and molecular docking study. Saudi Pharmaceutical Journal. 27 (3), 389-400 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

183NTCPHBVITCTCA

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены