Демонстрация иннервации волосатой и гламурной кожи в 3D-паттерне с использованием нескольких флуоресцентных подходов к окрашиванию и очистке тканей

Резюме

Толщина тканевых срезов ограничивала морфологическое исследование иннервации кожи. Настоящий протокол описывает уникальную технику очистки тканей для визуализации кожных нервных волокон в толстых 300 мкм участках ткани под конфокальной микроскопией.

Аннотация

Иннервация кожи является важной частью периферической нервной системы. Хотя изучение кожных нервных волокон быстро прогрессировало, большая часть понимания их распределительных и химических характеристик исходит из обычного гистохимического и иммуногистохимического окрашивания тонких участков тканей. С развитием техники очистки тканей стало возможным просматривать кожные нервные волокна на более толстых участках ткани. Настоящий протокол описывает множественные флуоресцентные окрашивания на участках тканей толщиной 300 мкм от подошвенной и дорсальной кожи задних лап крыс, двух типичных волосистых и блестящих участков кожи. Здесь пептид, связанный с геном кальцитонина, маркирует сенсорные нервные волокна, в то время как фаллоидин и эндотелиальный гиалуроновый рецептор лимфатических сосудов 1 помечают кровеносные и лимфатические сосуды соответственно. Под конфокальным микроскопом меченые сенсорные нервные волокна полностью отслеживались на более длинной дистанции, бегая пучками в глубоком кожном слое и фристайлом в поверхностном слое. Эти нервные волокна проходили параллельно или окружали кровеносные сосуды, а лимфатические сосуды образовывали трехмерную (3D) сеть в волосатой и блестящей коже. Текущий протокол обеспечивает более эффективный подход к изучению иннервации кожи, чем существующие традиционные методы с точки зрения методологии.

Введение

Кожа, самый большой орган в организме, служащий ключевым интерфейсом к окружающей среде, плотно иннервируется многими нервными волокнами ^1,2,3. Хотя иннервация кожи была широко изучена ранее с помощью различных гистологических методов, таких как окрашивание на цельных участках кожи и тканей ^4,5,6, подробная эффективная демонстрация кожных нервных волокон по-прежнему является проблемой ^7,8. Учитывая это, настоящий протокол разработал уникальную технику для более четкого отображения кожных нервных волокон в толстом срезе ткани.

Из-за ограничения по толщине срезов наблюдение за иннервированными нервными волокнами кожи недостаточно точно, чтобы точно изобразить взаимосвязь между нервными волокнами, связанными с геном кальцитонина (CGRP), и местными тканями и органами из полученной информации изображения. Появление технологии 3D очистки тканей обеспечивает осуществимый метод решения этой проблемы ^9,10. Быстрое развитие подходов к очистке тканей предложило много инструментов для изучения тканевых структур, целых органов, нейронных проекций и целых животных в последнее время¹¹. Прозрачная кожная ткань может быть изображена в гораздо более толстом срезе с помощью конфокальной микроскопии для получения данных для визуализации кожных нервных волокон.

В текущем исследовании подошвенная и спинная кожа задней лапы крысы была выбрана в качестве двух целевых участков волосатой и блестящей кожи ^3,4,7. Чтобы проследить кожные нервные волокна на большем расстоянии, кожную ткань разрезали толщиной 300 мкм для иммуногистохимического и гистохимического окрашивания с последующей очисткой тканей. CGRP использовали для маркировки сенсорных нервных волокон^12,13. Кроме того, для выделения кожных нервных волокон на тканевом фоне дополнительно использовали фаллоидин и эндотелиальный гиалуроновый рецептор лимфатических сосудов 1 (LYVE1) для маркировки кровеносных и лимфатических сосудов соответственно^14,15.

Эти подходы обеспечили простой метод, который может быть применен для демонстрации изображения кожных нервных волокон с высоким разрешением, а также для визуализации пространственной корреляции между нервными волокнами, кровеносными сосудами и лимфатическими сосудами в коже, что может предоставить гораздо больше информации для понимания гомеостаза нормальной кожи и изменения кожи в патологических условиях.

протокол

Настоящее исследование было одобрено Комитетом по этике Института иглоукалывания и прижигания Китайской академии китайских медицинских наук (регистрационный номер D2018-04-13-1). Все процедуры проводились в соответствии с Руководством Национальных институтов здравоохранения по уходу за лабораторными животными и их использованию (National Academy Press, Washington, D.C., 1996). В этом исследовании использовались три взрослых самца крыс (Sprague-Dawley, вес 230 ± 15 г). Все животные были размещены в 12-часовом цикле света / темноты с контролируемой температурой и влажностью и имели свободный доступ к пище и воде.

1. Перфузия и пробоподготовка

1. Вводят 250 мг/кг раствора трибромэтанола (см. Таблицу материалов) внутрибрюшинно крысе, чтобы вызвать эвтаназию.
2. Как только дыхание остановится, используйте хирургические ножницы из нержавеющей стали, чтобы открыть грудную полость крысы. Используйте иглы 20 г для перфузии через левый сердечный желудочек¹³ со скоростью 3 мл/мин со 100 мл 0,9% нормального физиологического раствора, а затем 250-300 мл 4% параформальдегида в 0,1 М фосфатного буфера (ПБ, рН 7,4) (Рисунок 1А,В).
3. После перфузии используйте скальпель, чтобы удалить кожу спинки и подошвы с задней лапы.
   1. Для образцов, требующих замороженного сечения, постфиксируют ткани в 4% параформальдегиде в 0,1 М ПБ в течение 2 ч; затем криопротекция тканей в 25% сахарозы в 0,1 М ПБ в течение более 24 ч при 4 °C
   2. Для образцов с толстым сечением, требующим очистки тканей, постфиксируют ткани в 4% параформальдегиде в 1x фосфатно-буферном физиологическом растворе (1x PBS) в течение 2 ч; затем криопротекция тканей в 1x PBS при 4 °C (рисунок 1C–E).

2. Тройное флуоресцентное окрашивание CGRP, фаллоидином и LYVE1 с последующей очисткой тканей

ПРИМЕЧАНИЕ: Тройное флуоресцентное окрашивание с CGRP, фаллоидином и LYVE1 было применено для выявления нервных волокон, кровеносных сосудов и лимфатических сосудов в волосистой и блестящей коже на участках тканей толщиной 300 мкм после очистки тканей.

1. Готовят 2% агарозы в 1x PBS путем нагревания в микро-печи в течение 2 мин до растворения агарозы (см. Таблицу материалов).
2. После промывания вставить ткани кожи в 2% агарозу при 37 °C и поместить их внутрь ледяного ящика для охлаждения (рисунок 1F, G).
3. Зафиксируйте навесные ткани на вибрационном микротоме ледяной водой и нарежьте их толщиной 500 мкм в поперечном направлении. Используйте следующие параметры для установки вибрационного слайсера и финишной нарезки: скорость 0,50 мм/с и амплитуда 1,5 мм (рисунок 1H-K).
4. После нарезки удалите агарозу из срезов и храните их в шестилуночной пластине с 1x PBS (рН 7,4) (рисунок 1л).
5. Инкубируют участки ткани в растворе 2% Тритона Х-100 в 1x PBS (TriX-PB) в течение ночи при 4 °C. Следующая процедура приведена на рисунке 2 .
6. Поместите участки ткани в блокирующий буфер и вращайте на шейкере со скоростью 72 оборота в сутки при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Блокирующий буферный состав составляет 10% обычной ослиной сыворотки, 1% Triton-X 100 и 0,2% азида натрия в 1x PBS (см. Таблицу материалов).
7. Переложить участки ткани в раствор, содержащий первичные антитела мышиного моноклонального анти-CGRP (1:500) и овечьего поликлонального анти-LYVE1 антитела (1:500) в буфере разведения в микроцентрифужной трубке (см. Таблицу материалов), и вращать на шейкере в течение 2 дней при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буферный состав разведения составляет 1% обычной ослиной сыворотки, 0,2% Triton-X 100 и 0,2% азида натрия в 1x PBS.
8. Дважды вымойте участки тканей с помощью промывочного буфера при комнатной температуре, затем держите их на шейкере в течение ночи при 4 °C в буфере для промывки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Моющий буферный состав составляет 0,2% Triton-X 100 в 0,1 М ПБ (рН 7,4).
9. На следующий день перекладывают участки тканей в смешанный раствор, содержащий вторичные антитела ослиной антимышиной IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) и ослиной антиовечьей трубки IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), а также фаллоидин Alexa-Flour594 (1:1000) (см. Таблицу материалов) в микроцентрифужной трубке и вращают на шейкере со скоростью 72 об/мин в течение 5 ч при 4 °C.
10. Промыть участки ткани в шестилуночной пластине с промывочным буфером в течение 1 ч, дважды, при комнатной температуре. Держите участки ткани в моющем буфере на шейкере в течение ночи при 4 °C.
11. Перенесите срезы ткани в реагент очистки тканей (см. Таблицу материалов, его объем был в пять раз больше объема образца) и вращайте на шейкере со скоростью 60 об/мин осторожно в течение 1 ч при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После этого лечения участки тканей становятся четкими (рисунок 2B).
12. Установите очищенные ткани на предметное стекло, обведите ткани распоркой и заклейте щель свежим реагентом для очистки тканей и обложек.

3. Тройное флуоресцентное окрашивание CGRP, фаллоидином и LYVE1 в соответствии с традиционным подходом

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сравнения, такое же окрашивание проводилось на участках тканей толщиной 30 мкм по обычным методикам.

1. Нарежьте участки ткани на 30 мкм на микротоме в поперечном направлении и установите их на слайд.
2. Добавьте блокирующий раствор с 3% обычной ослиной сывороткой и 0,3% Тритоном Х-100 в 0,1 М ПБ и инкубируйте секции в течение 30 мин при комнатной температуре.
3. Удаляют блокирующий раствор и инкубируют участки с раствором, содержащим первичные антитела мышиного моноклонального анти-CGRP (1:500) и овечьего поликлонального анти-LYVE1 антитела (1:500) в буфере разведения на ночь при 4 °C.
4. На следующий день промыть участки тканей с 0,1 М ПБ (рН 7,4) трижды, добавить смешанный раствор, содержащий вторичные антитела ослиной антимышиной IgG H&L Alexa-Flour488 (1:500) и ослиной антиовечьей IgG H&L Alexa-Flour405 (1:500), а также фаллоидин Alexa-Flour594 (1:1000) и инкубировать в течение 1 ч при комнатной температуре.
5. Перед микроскопическим наблюдением промыть срезы в 0,1 М ПБ (рН 7,4) три раза, затем покрыть их покровными пластинками в 50% глицерине.

4. Визуализация и анализ

1. Наблюдайте за окрашенными образцами под флуоресцентным микроскопом, а затем делайте снимки с помощью конфокального микроскопа.
2. Захватите 30 изображений (Z-стеков), каждое в кадрах по 10 мкм, из каждого участка толщиной 300 мкм и интегрируйте одно изображение в фокусе с помощью процессора изображений системы конфокальной микроскопии (см. Таблицу материалов).
   1. Выполните следующие шаги в программном обеспечении для обработки изображений конфокальной установки для трехмерного (3D) анализа: Set Start Focal Plane | Установка концевой | фокальной плоскости Установка размера шага | Выберите | «Узор глубины» | захвата изображений Серия Z.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Длины волн возбуждения и излучения синих флуоресцентных сигналов составляли 401 нм и 421 нм соответственно. Длины волн возбуждения и излучения зеленых флуоресцентных сигналов составляли 499 нм и 519 нм соответственно. Длины волн возбуждения и излучения красных флуоресцентных сигналов составляли 591 нм и 618 нм соответственно. 152 мкм - диаметр конфокального точечного отверстия (объектив 10x, NA: 0,4). Разрешение захвата изображения составило 1024 × 1024 пикселей.
3. Для обычных образцов (этап 3) захватите 30 изображений (Z-стеки) в кадрах по 1 мкм из каждого участка толщиной 30 мкм и далее обработайте эти изображения, как указано выше (шаги 4.1-4.2).
4. Демонстрация изображений в схеме 3D-реконструкции с помощью системы обработки изображений.
5. Выполняйте 3D-реконструкции путем импорта конфокальных изображений Z-стека в Imaris 9.0 (программное обеспечение для визуализации клеток, см. Таблица материалов) и создавайте визуализацию поверхностей на основе интенсивности пятен: добавление новых поверхностей | Выберите исходный канал | Определите параметры в параметре «Гладкость» | Определите параметры в пороговом параметре абсолютной интенсивности | Классификация поверхностей | Отделка.
6. Получение данных в области поверхности положительных нервных волокон с помощью программного обеспечения для визуализации клеток. Выберите | визуализированного изображения Статистические | Подробный | Конкретные значения | Объем.

Результаты

После тройного флуоресцентного окрашивания нервные волокна, кровеносные сосуды и лимфатические сосуды были четко помечены CGRP, фаллоидином и LYVE1, соответственно, в волосистой и блестящей коже (рисунок 3,4). При очищающем лечении CGRP-положительные нервные волокна, ...

Обсуждение

Настоящее исследование обеспечивает подробную демонстрацию кожных нервных волокон в волосистой и блестящей коже с использованием иммунофлуоресценции на более толстых участках тканей с очищающей обработкой и 3D-видом, чтобы лучше понять иннервацию кожи. Важное значение имеет время ин...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1x phosphate-buffered saline	Solarbio Life Sciences	P1020	pH 7.2-7.4, 0.01 Mol
2,2,2-Tribromoethanol	Sigma Life Science	T48402-5G
Confocal fluorescence microscopy	Olympus Corporation	Fluoview FV1200
Donkey anti-mouse IgG H&L Alexa-Flour488	Abcam plc.	ab150105
Donkey anti-sheep IgG H&L Alexa-Flour405	Abcam plc.	ab175676
EP tube	Wuxi NEST Biotechnology Co.	615001	1.5 mL
Freezing stage sliding microtome system	Leica Biosystems	CM1860
Imaris Software	Oxford Instruments	v.9.0.1
IRIS standard scissor	WPI (World Precision Instruments Inc.)	503242
iSpacer	SunJin Lab co.	IS005
Micro forceps-Str	RWD	F11020-11
Mouse monoclonal anti-CGRP antibody	Santa cruz biotechnology, Inc.	sc-57053
Neutral buffered Formalin	Solarbio Life Sciences	G2161	10%
Normal donkey serum	Jackson ImmunoResearch Laboratories	017-000-12	10 mL
Peristaltic pump	Longer Precision Pump Co., Ltd	BT300-2J
Phalloidin Alexa-Fluor 594	Thermo Fisher Scientific	A12381
RapiClear 1.52 solution	SunJin Lab co.	RC152001	10 mL
Regular agarose	Gene Company Limited	G-10
SEMKEN 1 x 2 Teeth Tissue Forceps-Str	RWD	F13038-12
Sheep polyclonal anti-LYVE1 antibody	R&D Systems, Inc.	AF7939
Six-well plate	Corning Incorporated	3335
Sodium azide	Sigma Life Science	S2002	25 g
Sucrose	Sigma Life Science	V900116	500 g
Super Glue	Henkel AG & Co.	Pattex 502
Surgical Handles	RWD	S32003-12
Triton X-100	Solarbio Life Sciences	9002-93-1	100 mL
Urethane	Sigma Life Science	U2500	500 g
VANNAS spring scissors	RWD	S1014-12
Vibratory microtome	Leica Biosystems	VT1200S