JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот метод биохимической очистки с протеомным анализом на основе масс-спектрометрии облегчает надежную характеристику амилоидных фибровых ядер, что может ускорить идентификацию мишеней для профилактики болезни Альцгеймера.

Аннотация

Белковые фибриллярные включения являются ключевыми патологическими признаками множественных нейродегенеративных заболеваний. На ранних стадиях болезни Альцгеймера (БА) бета-амилоидные пептиды образуют протофибриллы во внеклеточном пространстве, которые действуют как семена, которые постепенно растут и созревают в большие амилоидные бляшки. Несмотря на это базовое понимание, современные знания о структуре, составе и моделях осаждения амилоидных фибрилов в мозге ограничены. Одним из основных препятствий была неспособность выделить высокоочищенные амилоидные фибриллы из экстрактов мозга. Подходы на основе аффинной очистки и лазерного захвата на основе микродиссекции ранее использовались для выделения амилоидов, но ограничены небольшим количеством материала, который может быть восстановлен. Этот новый, надежный протокол описывает биохимическую очистку ядер амилоидных бляшек с использованием солюбилизации додецилсульфата натрия (SDS) с ультрацентрифугированием и ультразвуком градиента плотности сахарозы и дает высокочистые фибриллы от пациентов с БА и тканей мозга модели АД. Протеомный анализ очищенного материала на основе масс-спектрометрии (MS) представляет собой надежную стратегию идентификации почти всех первичных белковых компонентов амилоидных фибрилл. Предыдущие протеомные исследования белков в амилоидной короне выявили неожиданно большую и функционально разнообразную коллекцию белков. Примечательно, что после уточнения стратегии очистки количество белков совместной очистки сократилось более чем в 10 раз, что указывает на высокую чистоту изолированного нерастворимого материала SDS. Отрицательное окрашивание и иммунозолотая электронная микроскопия позволили подтвердить чистоту этих препаратов. Необходимы дальнейшие исследования, чтобы понять пространственные и биологические атрибуты, которые способствуют отложению этих белков в амилоидные включения. Взятые вместе, эта аналитическая стратегия имеет хорошие возможности для повышения понимания биологии амилоида.

Введение

Амилоид является чрезвычайно стабильным супрамолекулярным расположением, которое содержится в разнообразной панели белков, некоторые из которых приводят к патологическим изменениям1. Накопление внутри- или внеклеточных амилоидных агрегатов наблюдается при нескольких нейродегенеративных заболеваниях2. Амилоидные агрегаты неоднородны и обогащены большим количеством белков и липидов3. В последние годы интерес к амилоидному протеому вызвал значительный интерес среди базовых и трансляционных нейробиологов. Было разработано несколько методов извлечения и очистки амилоидных агрегатов из тканей мозга мыши и посмертного вскрытия человека. Микродиссекция лазерного захвата, иммунопреципитация, децеллюляризация и биохимическая изоляция амилоидных агрегатов являются широко используемыми методами извлечения и очистки амилоидных бляшек, фибрилл и олигомеров 4,5,6,7. Многие из этих исследований были сосредоточены на определении белкового состава этих плотно упакованных фибриллярных отложений с использованием полуколичественного РС. Тем не менее, имеющиеся результаты противоречивы, и удивительно большое количество совместно очищающих белков, о которых сообщалось ранее, трудно интерпретировать.

Основным ограничением существующей литературы, описывающей протеом амилоидного ядра в мозге мышиных моделей AD и AD, является то, что очищенный материал содержит неуправляемое количество совместно очищающих белков. Общая цель этого метода состоит в том, чтобы преодолеть это ограничение и разработать надежную биохимическую очистку для выделения амилоидных фибрильных кернов. Эта стратегия использует ранее описанный биохимический метод ультрацентрифугирования на основе ультрацентрифугирования градиента плотности сахарозы для выделения нерастворимых амилоидных фракций SDS из посмертных тканей мозга человека и мыши 8,9. Этот метод основан на существующей литературе, но идет дальше с ультразвуком и промывкой SDS для удаления большинства слабо связанных амилоид-ассоциированных белков, что приводит к выделению высокоочищенных амилоидных фибрилл (рисунок 1). Фибриллы, очищенные этим протоколом, преодолевают несколько существующих проблем, часто встречающихся в структурных исследованиях амилоидных фибрилл, выделенных из экстрактов мозга. Визуализация этих фибрилл с помощью просвечивающей электронной микроскопии (ТЭМ) подтверждает целостность и чистоту очищенного материала (рисунок 2). В этом исследовании изолированные фибриллы солюбилизируются и перевариваются до пептидов с трипсином, а анализ РС без меток может легко выявить идентичность белков, образующих ядро фибрилл. Примечательно, что некоторые из этих белков имеют врожденную тенденцию к образованию супрамолекулярных сборок в немембранных органеллах. Кроме того, многие из белков, идентифицированных при анализе бета-амилоидных (Aβ) фибрилл, также связаны с другими нейродегенеративными заболеваниями, предполагая, что эти белки могут играть ключевую роль в множественных протеинопатиях.

Этот метод SDS/ультразвука вряд ли изменит или нарушит структуру фибрилловых сердечников. Очищенный материал также подходит для широкого спектра подходов к протеомному анализу сверху вниз и снизу вверх и дополнительных стратегий структурного анализа на основе MS, таких как химическое сшивание или водородно-дейтериевый обмен. Общее восстановление с использованием этого метода относительно высокое и, таким образом, подходит для подробных структурных исследований, которые требуют от микрограммов до миллиграммов очищенного материала. Очищенный материал также подходит для структурных исследований с использованием криоЭМ и атомно-силовой микроскопии. Этот протокол в сочетании со стабильной изотопной маркировкой млекопитающих может облегчить исследования твердотельного ядерного магнитного резонанса (ЯМР) амилоидной структуры10.

протокол

Этот протокол предполагает использование тканей мозга человека или позвоночных. Все исследования проводились в соответствии с утвержденными институциональными руководящими принципами Северо-Западного университета. Текущий рабочий процесс стандартизирован с использованием APP-knock in (AppNL-G-F/NL-G-F) мышей мозг коры мозга и гиппокампаобласти мозга 11. Этот протокол был оптимизирован для извлечения мозга у мышей в возрасте 6-9 месяцев, и он может эффективно очищать амилоиды как от самцов, так и от самок животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Для лучшего понимания общей экспериментальной процедуры см. схему рабочего процесса на рисунке 1 .

1. Сбор тканей и очистка амилоида

ПРИМЕЧАНИЕ: В идеале амилоидные фибриллы должны быть изолированы от свежерассеченных областей мозга. Тем не менее, этот метод также хорошо работает с замороженными тканями мозга. Ниже приведен краткий обзор замороженных тканей мозга для хранения для использования в более позднее время.

  1. Сбор и хранение мозговой ткани: рассекайте мозг мыши и быстро собирайте области, насыщенные амилоидом (т. Е. Кору и гиппокамп), с последующим замораживанием в жидком азоте или спиртовой ванне с сухим льдом.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Мгновенное замораживание помогает сохранить структурные атрибуты компонентов ткани. Мышей усыпляют изофлураном и вывихом шейки матки12,13. Рекомендуется избегать использования CO2, так как это может поставить под угрозу целостность протеома мозга.
  2. После вскрытия, разрезайте и храните свежие ткани небольшими блоками (например, 5 мм х 5 мм), так как это способствует более эффективной гомогенизации перед экстракцией амилоида. Перенесите ткань в стерильный криогенный флакон, затяните его колпачок и быстро погружайтесь.
  3. Храните ткани замороженными в ультрахолодных условиях (т.е. -80 °C или жидкий азот). Если экстракция должна быть выполнена через несколько дней, храните ткани при -20 ° C и избегайте циклов замораживания и оттаивания. Разморозьте замороженные ткани на влажном льду, когда они будут готовы к извлечению и очистке.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Прямой контакт тканей с жидким азотом может привести к повреждению тканей и белка. Обратите внимание, что спиртовая ванна может удалить постоянные маркеры с этикеток тюбиков.

2. Обогащение нерастворимого материала SDS

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните все шаги на льду и центрифуге при 4 °C, если не указано иное. Подробная информация обо всех буферах и решениях, используемых в этом протоколе, приведена в дополнительном файле 1. Производители и каталожные номера химикатов и приборов приведены в Таблице материалов.

  1. Начните со свежерассеченных или замороженных участков мозговой ткани (размороженных на льду), помещенных в трубку объемом 2 мл, содержащую 6-8 керамических шариков и свежеприготовленный ледяной буфер гомогенизации (1 мл на 0,25-1 г влажной тканевой массы).
  2. Перенесите трубки на гомогенизатор шариковой мельницы и измельчите содержимое ткани при 4000 об/мин, с двумя циклами по 30 с каждый и интервалом 30 с между ними.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Альтернативно, моторизованные системы мешалки или гомогенизатора могут быть использованы для измельчения и гомогенизации тканей.
  3. Добавьте 9 мл буфера гомогенизации ледяного холода к 1 мл гомогената всей ткани мозга в пробирках по 15 мл, запечатайте полосками лабораторной восковой пленки и вращайте от начала до конца на ночь при 4 °C, чтобы обеспечить надежную солюбилизацию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы удалить нежелательный крупный клеточный мусор и липиды, на следующее утро раскрутите трубки при 800 х г при 4 °C в течение 10 минут и соберите супернатант в свежую трубку. Повторно суспендируют оставшуюся гранулу в 2 мл ледяного буфера гомогенизации, хорошо перемешивают, снова вращают в течение 10 мин при 4 °C и объединяют два супернатанта.
  4. Медленно добавляют твердую сахарозу к суспензии тканевого экстракта до конечной концентрации 1,2 М, хорошо перемешивают и центрифугируют при 250 000 х г в течение 45 мин при 4 °C.
  5. Осторожно удалите и выбросьте супернатант с помощью пипетки. Повторно суспендируют гранулу в 2 мл гомогенизационного буфера, содержащего 1,9 М сахарозы, путем тритурации с последующим центрифугированием при 125 000 х г в течение 45 мин при 4°С.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем буфера может быть отрегулирован в зависимости от количества материала, извлеченного из предыдущего шага. В общем, 10 объемов буфера гомогенизации (V / V) идеально подходят для этого этапа.
  6. Соберите верхний белый твердый слой с помощью пипетки, переложите его в свежую трубку и солюбилизируйте в 1 мл ледяного буфера промывки путем пипетки вверх и вниз несколько раз, без введения пузырьков воздуха.
  7. Помимо верхнего слоя, гранула также обогащена амилоидными фибриллами. Для получения более высокой урожайности соедините две фракции и продолжайте. Аккуратно снимите средний водный слой с помощью пипетки и выбросьте.
  8. Центрифугировать комбинированные фракции при 8000 х г в течение 20 мин при 4 °C. Выбросьте супернатант.
  9. Добавьте 1 мл ледяного буфера пищеварения к промытым гранулам, повторно суспендируйте и инкубируйте при комнатной температуре (RT) в течение 3 ч.
  10. Центрифугу при 8000 х г в течение 20 мин при 4 °C и удалите супернатант с помощью пипетки.
  11. Повторно суспендировать и промыть (аналогично этапу 2.8.) переваренную гранулу два раза в 1 мл ледяного буфера Tris.
  12. Повторно суспендируют промытую гранулу в 1 мл солюбилизационного буфера, содержащего 1% SDS и 1,3 М сахарозы, путем пипетки вверх и вниз. Центрифуга быстро при 200 000 х г в течение 60 мин при 4 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя амилоидные фибриллы обладают высокой устойчивостью к моющим средствам и денатурантам, очень длительное воздействие моющего средства (1% SDS) может повлиять на целостность фибрилл или удалить плотно связанные белки, что поставит под угрозу последующий анализ. Поэтому сразу после повторного использования гранул приступают к центрифугированию.
  13. Сохраните гранулу и увеличьте объем оставшегося супернатанта путем добавления 50 мМ буфера Триса (в соотношении 1:0,3) для снижения концентрации сахарозы с 1,3 до 1 М и центрифуги еще раз при 200 000 х г в течение 45 мин при 4 °С.
  14. Растворите две гранулы в 100 мкл буфера Tris, содержащего 0,5% SDS и пул для очистки амилоида. Видимые гранулы маленькие и должны казаться непрозрачными и белыми (см. Рисунок 2А).

3. Очистка амилоида

ПРИМЕЧАНИЕ: Соедините две гранулы, солюбилизируйте путем пипетки до получения однородного раствора и приступайте к следующим этапам очистки амилоида.

  1. Для полной солюбилизации богатого амилоидом материала, присутствующего в гранулах, подвергните трубку механической сдвигу, производимой ультразвуковыми волнами в устройстве обработки ультразвуком в ванне, работающем в течение 30 с ON и 30 s OFF на средней частоте в течение 20 циклов.
  2. Немедленно центрифугируют материал при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C и повторно саспендируют гранулу в 500 мкл 0,5% буфера SDS Tris.
  3. Повторите шаг 3.1. и шаг 3.2. четыре раза в общей сложности пять стирок. Количество стирок можно увеличить для улучшения чистоты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этапы обработки ультразвуком и промывки оптимизированы при 0,5% SDS, поскольку более высокие концентрации могут повлиять на структуру, целостность или белковый состав фибрилл. Увеличивать концентрацию SDS на этом этапе не рекомендуется.
  4. После заключительной стадии центрифугирования промыть гранулу в 200 мкл сверхчистой воды и центрифугу при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C, чтобы удалить все оставшиеся моющие средства. Промытые гранулы, содержащие очищенные амилоидные фибриллы, кажутся полупрозрачными по цвету и иногда их трудно увидеть.
  5. Растворить конечную гранулу, содержащую очищенные амилоидные фибриллы, в 100 мкл сверхчистой воды. Немедленно перейдите к следующему шагу для последующей обработки или сохраните фибрюшную суспензию при -20 °C для дальнейшего анализа. Если замерзли, оттаивайте на льду перед началом осадков.

4. Осаждение хлороформа метанола

ПРИМЕЧАНИЕ: Если конечной целью является проведение анализа белка, рекомендуется обессолить и удалить дополнительные небелковые примеси.

  1. Добавьте 400 мкл метанола к очищенным 100 мкл амилоидных фибрилл в пробирке объемом 1,5 мл и вихревой лунке.
  2. Добавьте 100 мкл хлороформа в трубку и вихревой колодец.
  3. Добавьте 300 мкл сверхчистой воды и тщательно вихрь. Это делает смесь мутной из-за осаждения белка.
  4. Центрифуга при 12 000 х г в течение 2 мин при РТ.
  5. Аккуратно удалите водный слой (т.е. верхний), не нарушая интерфейсный слой, содержащий белковую чешуйку.
  6. Снова добавьте тот же объем метанола и центрифугу при 12 000 х г в течение 2 мин при РТ.
  7. Выбросьте супернатант с помощью пипетки и высушите гранулы на воздухе в RT. Избегайте пересушки; амилоидную фракцию трудно повторно рассасывать при пересушивании.

5. Переваривание трипсина

  1. Растворите гранулы в 50 мкл буфера гуанидина гидрохлорида (GuHCl). Настаивайте ультразвуком на ледяной водяной бане и нагревайте при 95 °C в течение 5 мин, если это необходимо.
  2. Тщательно вихрь на RT в течение 45 мин до 1 ч, чтобы растворить его полностью. Гранула не будет видна после этого шага, а раствор выглядит прозрачным на вид.
  3. Добавьте такой же объем 0,2% раствора поверхностно-активного вещества. Солюбилизируют при РТ с вихрем в течение 60 мин. Этот шаг усиливает ферментативную активность трипсина.
  4. Добавьте 1 мкл трис-2-карбоксиэтилфосфина (TCEP) из исходного раствора 500 мМ. Инкубировать в течение 60 мин.
  5. Добавить 2 мкл 500 мМ йодоацетамида (ИАА) и инкубировать в темноте в течение 20 мин.
  6. Гасит IAA 5 мкл раствора TCEP в течение 15 мин.
  7. Добавьте в пробирку необходимый объем 50 мМ раствора бикарбоната аммония для снижения концентрации гуанидина до 1,5 М.
  8. Добавьте в пробирку 1% раствор поверхностно-активного вещества (1 мкл/50 мкг белка).
  9. Добавьте трипсин (1 мкг/100 мкг белка) и оставьте трубку перемешивать при 37 °C на ночь.

6. Пептидная очистка

  1. На следующее утро подкислите переваренный раствор пептида, понизив рН до 2,0 путем добавления муравьиной кислоты.
  2. Активируйте спиновую колонку C18 (n-октадецил) в трубке приемника объемом 2 мл путем добавления 200 мкл 50% раствора метанола и отжима при 1500 х г в течение 2 мин при RT. Повторите этап активации.
  3. Уравновешивайте слои смолы C18 путем добавления 200 мкл буфера равновесия и вращения в течение 2 мин с теми же условиями. Повторите этот шаг.
  4. Загрузите подкисленный пептидный раствор на колонну C18 и центрифугу при 1500 х г в течение 2 мин при RT. Соберите проточную трубу и перезагрузите ее еще раз. Отбросьте второй сквозной поток.
  5. Промыть пептиды, связанные со смолой C18, с помощью промывочного буфера 2x, как это сделано на шаге 6.3. Используйте тот же буфер равновесия для промывки колонны.
  6. Элюируют пептиды путем добавления 40 мкл буфера элюирования с последующим центрифугированием при 1500 х г, в течение 2 мин при RT. Повторите стадию элюирования три раза, чтобы увеличить выход восстановленных пептидов.
  7. Высушите пептиды в быстром вакуумном концентраторе путем выпаривания водного раствора. Сухие пеллеты могут быть сохранены при -20 °C в течение нескольких недель до анализа MS.

7. Настройка масс-спектрометра для пептидного анализа

ПРИМЕЧАНИЕ: Параметры MS см. в Дополнительном файле 1 (адаптированном из предыдущей публикации из лаборатории)14.

  1. Перед загрузкой пептидных образцов для анализа MS растворите сухие пептидные гранулы в 20 мкл буфера загрузки образца и выполните микро BCA для количественной оценки концентрации восстановленных пептидов.
  2. Перенесите растворенные пептиды в стеклянный флакон и загрузите 3 мкг (количественно из микро BCA) пептидов в автосэмплер системы UPLC.
  3. Загрузите образцы в вентилируемую колонку ловушки (колонна C18 HPLC, 0,075 мм x 20 мм) со скоростью потока 250 нЛ/мин.
  4. Расположите колонну ловушки на одной линии с аналитической колонной (0,075 мкм х 500 мм) и соберите наконечник излучателя к источнику электрораспылительной ионизации (ESI), подвергающемуся воздействию напряжения распыления 2000 В.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании выполняется ESI, в котором подвижная фаза подвергается высоковольтной ионизации в газовую фазу. Созданный этим спрей направляется в вакуумную камеру МС через нагретый капилляр. Находясь под вакуумом, десоляция капель и выброс ионов происходит в присутствии тепла и напряжения. После этого ионы ускоряются к анализатору массы в присутствии высоковольтной среды.
  5. Проанализируйте образцы с помощью 2-х часовых прогонов сбора. Это исследование проводится с использованием зависимого от данных сбора с наиболее интенсивной парадигмой отбора топ-20 ионов-предшественников.
    ПРИМЕЧАНИЕ: При получении, зависящем от данных, ограниченное число пептидов-предшественников обнаруживается при сканировании MS1 и подвергается фрагментации для анализа MS2. Однако динамическое исключение здесь проблематично, поскольку высокообильные пептиды Aβ будут опущены для фрагментации и приведут к занижению их количества.
  6. Для абсолютной количественной оценки пептидов Aβ запустите те же образцы еще раз, используя целевой метод MS / MS. Для этого исследования подготовлен исчерпывающий список всех соотношений m/z для различных возможных триптических пептидов Aβ для моделей мышей APP (см. Дополнительную таблицу 1). Другие группы должны подготовить аналогичный список в соответствии с имеющейся моделью мыши и возможными пептидами, полученными из интересующего белка (например, Aβ для AD).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для решения проблемы исключения высокообильных пептидов используйте целевой подход, предоставив список выбранных значений m/z, соответствующих триптическим пептидам Aβ. Этот подход решает проблему зависящего от данных исключения пептидов Aβ и может количественно оценить абсолютные количества различных мономеров (пептидов Aβ38, 40 и 42) с высоким разрешением.
  7. Масс-спектрометр генерирует MS-спектры образцов пептидов и сохраняет необработанные файлы данных в целевом каталоге. Используйте этот файл для выполнения спектрального сопоставления с использованием хорошо зарекомендовавших себя статистических и биоинформатических инструментов. Доступно несколько интерактивных и автономных инструментов поиска и анализа баз данных.

8. Анализ данных MS

  1. Извлеките файлы MS1 и MS2 с помощью автономного инструмента Rawconverter (http://www.fields.scripps.edu/rawconv/).
  2. Выполните идентификацию, количественную оценку и подробный анализ данных в веб-поисковой системе ms data. В данном исследовании использовался интегрированный протеомический конвейер - IP2 (Bruker: http://www.integratedproteomics.com/).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Доступно несколько других онлайн и оффлайн инструментов анализа данных MS, которые также могут быть использованы, такие как MaxQuant (https://www.maxquant.org/).
  3. После загрузки файлов MS1 и MS2 выберите обновленную базу данных протеомов мыши. Здесь для идентификации пептидов с использованием алгоритмов11 ProLuCId и SEQUEST выбрана обновленная база данных мыши, содержащая дополнительные мутации, специфичные для приложения.
  4. В системе анализа IP2 выберите параметры по умолчанию и измените их в соответствии с экспериментальными требованиями. В этом исследовании используется толерантность к массе пептида 50 ppm для предшественника и 600 ppm для фрагментов (см. Дополнительный файл 1 для других параметров, используемых в IP2).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Исследователи могут изменять параметры поиска в соответствии с экспериментальными целями. Например, для идентификации посттрансляционных модификаций добавьте дифференциальные значения модификации для различных ПТМ (например, убиквитинирование, СУМОилирование, фосфорилирование).

Результаты

Здесь обобщен подробный способ выделения и очистки амилоидных фибрилл с использованием модифицированного метода ультрацентрифугирования ультрацентрифугирования с градиентом плотности сахарозы (см. фиг.1). Инновацией в этом методе является включение этапов стирки на ...

Обсуждение

Разработка четкого понимания структуры и состава амилоида является сложной задачей для структурных биологов и биохимиков из-за биологических сложностей и экспериментальных ограничений в извлечении очищенных фибрилл из тканей мозга AD16,17. Амилоидные фи...

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантом NIH R01AG061865 R.J.V. и J.N.S. Авторы благодарят членов исследовательской группы Вассара и Саваса в Северо-Западном университете за их вдумчивые дискуссии. Мы также искренне благодарим д-ра(ов). Ансгар Займер и Ральф Ланген из Университета Южной Калифорнии за их важный вклад. Мы благодарим доктора Фариду Корабову за подготовку образцов и электронную микроскопию с отрицательным окрашиванием в Центре передовой микроскопии Северо-Западного университета.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Acclaim PepMap 100 C18 HPLC column 0.075 mm x 20 mmThermo Scientific164535Alternative instruments, chemicals and antibodies from other manufacturers can be used
Ammonium bicarbonateSigma-Aldrich9830
anti-amyloid beta (1-16) 6E10 antibodyBiolegend803001
anti-amyloid beta (17-24) 4G8 antibodyBiolegend800701
anti-amyloid beta (N terminus 82E1) antibodyIBL America10323
anti-amyloid fibril LOC antibody EMD MilliporeAB2287
BCA kitThermo Fisher Scientific23225
Bioruptor Pico PlusDiagenodeB01020001
Calcium ChlorideSigma-Aldrich C1016
CollagenaseSigma-AldrichC0130
Complete  Protease Inhibitor CocktailSigma-Aldrich11697498001
Dnase IThermo Fisher ScientificEN0521
EDTASigma-AldrichEDS
Guanidine hydrochlorideSigma-AldrichG4505
HyperSep C18 CartridgesThermo Fisher Scientific60108-302
Integrated Proteomics Pipeline - IP2 http://www.integratedproteomics.com/
Iodoacetamide (IAA)Sigma-AldrichI1149
K54 Tissue Homogenizing System MotorCole ParmerGlas-Col 099C
MaxQuanthttps://www.maxquant.org/
Micro BCA kitThermo Fisher Scientific23235
Nanoviper 75 μm x 50 cmThermo Scientific164942
Optima L-90K UltracentrifugeBeckman CoulterBR-8101P-E
Orbitrap Fusion TribridMass SpectrometerThermo ScientificIQLAAEGAAPFADBMBCX
Pierce C18 Spin ColumnsThermo Fisher Scientific89870
Precellys 24 tissue homogenizerBertin InstrumentsP000062-PEVO0-A
ProteaseMAX(TM) Surfactant Trypsin EnhancerPromegaV2072
RawConverterhttp://www.fields.scripps.edu/rawconv/
Sodium azideVWR97064-646
Sodium dodecyl sulfate (SDS)Sigma-Aldrich74255
Sorvall Legend Micro 21R MicrocentrifugeThermo Fisher Scientific75002446
Speed Vaccum ConcentratorLabconco7315021
Tris-2-carboxyethylphosphine (TCEP)Sigma-AldrichC4706-2G
Tris-HClThermo Fisher Scientific15568025
Trypsin Gold-Mass spec gradePromegaV5280
UltiMate 3000 RSLCnano SystemThermo ScientificULTIM3000RSLCNANO

Ссылки

  1. Willbold, D., Strodel, B., Schröder, G. F., Hoyer, W., Heise, H. Amyloid-type protein aggregation and prion-like properties of amyloids. Chemical Reviews. 121 (13), 8285-8307 (2021).
  2. Rambaran, R. N., Serpell, L. C. Amyloid fibrils: abnormal protein assembly. Prion. 2 (3), 112-117 (2008).
  3. Upadhyay, A., et al. Complex inclusion bodies and defective proteome hubs in neurodegenerative disease: New clues, new challenges. The Neuroscientist. , (2021).
  4. Greiner, E. R., Kelly, J. W., Palhano, F. L. Immunoprecipitation of amyloid fibrils by the use of an antibody that recognizes a generic epitope common to amyloid fibrils. PLOS ONE. 9 (8), 105433 (2014).
  5. Kourelis, T. V., et al. A proteomic atlas of cardiac amyloid plaques. JACC: CardioOncology. 2 (4), 632-643 (2020).
  6. Mangione, P. P., et al. Increasing the accuracy of proteomic typing by decellularisation of amyloid tissue biopsies. Journal of Proteomics. 165, 113-118 (2017).
  7. Rostagno, A., Neubert, T. A., Ghiso, J. Unveiling brain Aβ heterogeneity through targeted proteomic analysis. Methods in Molecular Biology. 1779, 23-43 (2018).
  8. Roher, A. E., et al. Morphology and toxicity of Aβ-(1-42) dimer derived from neuritic and vascular amyloid deposits of Alzheimer's disease. Journal of Biological Chemistry. 271 (34), 20631-20635 (1996).
  9. Lu, J. -. X., et al. Molecular structure of β-amyloid fibrils in Alzheimer's disease brain tissue. Cell. 154 (6), 1257-1268 (2013).
  10. Tycko, R. Solid-state NMR studies of amyloid fibril structure. Annual Review of Physical Chemistry. 62, 279-299 (2011).
  11. Saito, T., et al. Single App knock-in mouse models of Alzheimer's disease. Nature Neuroscience. 17 (5), 661-663 (2014).
  12. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (168), e61941 (2021).
  13. Spijker, S., Li, K. Dissection of Rodent Brain Regions. Neuroproteomics. Neuromethods. 57, (2011).
  14. Hark, T. J., et al. Pulse-chase proteomics of the App knockin mouse models of Alzheimer's disease reveals that synaptic dysfunction originates in presynaptic terminals. Cell Systems. 12 (2), 141-158 (2021).
  15. Liu, S., et al. Highly efficient intercellular spreading of protein misfolding mediated by viral ligand-receptor interactions. Nature Communications. 12 (1), 5739 (2021).
  16. Toyama, B. H., Weissman, J. S. Amyloid structure: conformational diversity and consequences. Annual Review of Biochemistry. 80, 557-585 (2011).
  17. Sundaria, N., et al. Neurodegeneration & imperfect ageing: Technological limitations and challenges. Mechanisms of Ageing and Development. 200, 111574 (2021).
  18. Cendrowska, U., et al. Unraveling the complexity of amyloid polymorphism using gold nanoparticles and cryo-EM. Proceedings of the National Academy of Sciences. 117 (12), 6866-6874 (2020).
  19. Seuring, C., et al. Amyloid fibril polymorphism: almost identical on the atomic level, mesoscopically very different. The Journal of Physical Chemistry B. 121 (8), 1783-1792 (2017).
  20. Close, W., et al. Physical basis of amyloid fibril polymorphism. Nature Communications. 9 (1), 699 (2018).
  21. Tycko, R. Amyloid polymorphism: Structural basis and neurobiological relevance. Neuron. 86 (3), 632-645 (2015).
  22. Konstantoulea, K., et al. Heterotypic Amyloid β interactions facilitate amyloid assembly and modify amyloid structure. The EMBO Journal. 41, 108591 (2022).
  23. Hondius, D. C., et al. Proteomics analysis identifies new markers associated with capillary cerebral amyloid angiopathy in Alzheimer's disease. Acta Neuropathologica Communications. 6 (1), 1-19 (2018).
  24. Luo, J., Wärmländer, S. K., Gräslund, A., Abrahams, J. P. Cross-interactions between the Alzheimer disease amyloid-β peptide and other amyloid proteins: a further aspect of the amyloid cascade hypothesis. Journal of Biological Chemistry. 291 (32), 16485-16493 (2016).
  25. Hosp, F., et al. Spatiotemporal proteomic profiling of Huntington's disease inclusions reveals widespread loss of protein function. Cell Reports. 21 (8), 2291-2303 (2017).
  26. Wallace, E. W. J., et al. Reversible, specific, active aggregates of endogenous proteins assemble upon heat stress. Cell. 162 (6), 1286-1298 (2015).
  27. Darling, A. L., Liu, Y., Oldfield, C. J., Uversky, V. N. Intrinsically disordered proteome of human membrane-less organelles. Proteomics. 18 (5-6), 1700193 (2018).
  28. Kepchia, D., et al. Diverse proteins aggregate in mild cognitive impairment and Alzheimer's disease brain. Alzheimer's Research & Therapy. 12 (1), 1-20 (2020).
  29. Espay, A. J., et al. Revisiting protein aggregation as pathogenic in sporadic Parkinson and Alzheimer diseases. Neurology. 92 (7), 329-337 (2019).
  30. Fändrich, M., Schmidt, M., Grigorieff, N. Recent progress in understanding Alzheimer's β-amyloid structures. Trends in Biochemical Sciences. 36 (6), 338-345 (2011).
  31. Bonnin, E. A., Fornasiero, E. F., Lange, F., Turck, C. W., Rizzoli, S. O. NanoSIMS observations of mouse retinal cells reveal strict metabolic controls on nitrogen turnover. BMC Molecular and Cell Biology. 22 (1), 1-10 (2021).
  32. Michno, W., et al. Following spatial Aβ aggregation dynamics in evolving Alzheimer's disease pathology by imaging stable isotope labeling kinetics. Science Advances. 7 (25), (2021).
  33. Toyama, B. H., et al. Identification of long-lived proteins reveals exceptional stability of essential cellular structures. Cell. 154 (5), 971-982 (2013).
  34. Bomba-Warczak, E., Edassery, S. L., Hark, T. J., Savas, J. N. Long-lived mitochondrial cristae proteins in mouse heart and brain. Journal of Cell Biology. 220 (9), 202005193 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

182

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены