Анализ динамического рассеяния света для определения размера частиц железо-углеводных комплексов

Резюме

Динамическое рассеяние света (DLS) стало подходящим анализом для оценки размера частиц и распределения внутривенно вводимых железо-углеводных комплексов. Однако протоколы не имеют стандартизации и должны быть изменены для каждого анализируемого железо-углеводного комплекса. В настоящем протоколе описывается применение и особенности анализа сахарозы железа.

Аннотация

Внутривенно вводимые железоуглеводные комплексы наночастиц широко используются для лечения дефицита железа. Этот класс включает несколько структурно гетерогенных комплексов наночастиц, которые проявляют различную чувствительность к условиям, необходимым для методологий, доступных для физико-химической характеристики этих агентов. В настоящее время критические качественные характеристики железо-углеводных комплексов до конца не установлены. Динамическое рассеяние света (DLS) стало фундаментальным методом определения размера и распределения неповрежденных частиц. Тем не менее, по-прежнему остаются проблемы, связанные со стандартизацией методологий в разных лабораториях, конкретными модификациями, необходимыми для отдельных железоуглеводных продуктов, и с тем, как лучше всего описать распределение по размерам. Важно отметить, что используемые разбавители и серийные разбавления должны быть стандартизированы. Большие различия в подходах к пробоподготовке и представлению данных ограничивают использование DLS для сравнения железо-углеводных агентов. Здесь мы подробно описываем надежный и легко воспроизводимый протокол для измерения размера и распределения по размерам железо-углеводного комплекса, сахарозы железа, с использованием Z-среднего и индекса полидисперсности.

Введение

Сахароза железа (IS) представляет собой коллоидный раствор, состоящий из наночастиц, состоящих из комплекса полиядерного ядра железо-оксигидроксид и сахарозы. ИИ широко используется для лечения дефицита железа среди пациентов с широким спектром основных заболеваний, которые не переносят пероральные добавки железа или для которых пероральное железо неэффективно¹. IS относится к классу комплексных лекарств, как определено Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA), который представляет собой класс лекарств со сложным химическим составом, соизмеримым с биологическими препаратами². Регуляторная оценка сложных лекарственных препаратов может потребовать дополнительных ортогональных физико-химических методов и/или доклинических или клинических исследований для точного сравнения последующих комплексных лекарственных средств ^3,4. Это важно, потому что в нескольких исследованиях сообщалось, что использование ИИ по сравнению с последующим продуктом ИИ не дает одинаковых клинических результатов. Это подчеркивает важность использования новых и ортогональных методов определения характеристик, которые подходят для выявления различий в физико-химических свойствах между продуктами ИС ^5,6.

Точное выяснение размера и распределения по размерам ИИ имеет клиническое значение, поскольку размер частиц является основным фактором, влияющим на скорость и степень опсонизации - первого критического шага в биораспределении этих сложных препаратов ^7,8. Даже незначительные изменения в размерах частиц и распределении частиц по размерам были связаны с изменениями фармакокинетического профиля комплексов наночастиц железа и оксида железа ^9,10. Недавнее исследование, проведенное Brandis et al., показало, что размер частиц, измеренный с помощью DLS, значительно различался (14,9 нм ± 0,1 нм против 10,1 нм ± 0,1 нм, p < 0,001) при сравнении референтного лекарственного средства и непатентованного продукта глюконата натрия железа, соответственно¹¹. Стабильное качество, безопасность и эффективность железоуглеводных продуктов от партии к партии полностью зависят от масштабирования производственного процесса, и необходимо тщательно учитывать потенциальный производственный дрейф⁹. Производственный процесс может привести к образованию остаточной сахарозы, и это будет варьироваться в зависимости от производителя¹². Любые изменения в переменных производственного процесса могут привести к существенным изменениям в конечном комплексном лекарственном препарате в отношении структуры, стабильности комплекса и диспозиции in vivo ⁹.

Для оценки консистенции лекарственного средства и прогнозирования его поведения in vivo необходимы современные ортогональные аналитические методики для определения физико-химических свойств сложных нанолекарственных средств. Вместе с тем отсутствует стандартизация методологий, что может привести к высокой степени межлабораторных различий в представлении результатов¹³. Несмотря на признание этих проблем глобальными регулирующими органами и научным^{сообществом14}, большинство физико-химических характеристик ИС остаются плохо определенными, а полный набор критических атрибутов качества в контексте имеющихся нормативных руководящих документов^{не определен 15}. Проекты руководящих документов по конкретным продуктам, выпущенные FDA для железо-углеводных комплексов, предлагают DLS в качестве процедуры оценки размера и распределения по размерам последующих продуктов^16,17.

В нескольких публикациях подробно описаны установленные протоколы DLS для определения размеров наночастиц IS^13,18. Однако, поскольку пробоподготовка, условия процедуры, контрольно-измерительные приборы и параметры настройки контрольно-измерительных приборов различаются между опубликованными методами, результаты DLS не могут быть напрямую сопоставлены в отсутствие стандартизированного метода интерпретации результатов^13,18. Разнообразие методологий и подходов к представлению данных ограничивает надлежащую оценку этих характеристик для целей сопоставления¹⁹. Важно отметить, что многие из протоколов DLS, ранее опубликованных для оценки ИС, не учитывают эффект диффузии сахарозы в суспензии из-за присутствия свободной сахарозы, которая, как было показано, значительно повышает Z-средние расчетные гидродинамические радиусы наночастиц в коллоидных растворах^13,18. Настоящий протокол направлен на стандартизацию методологии измерения размера частиц и распределения ИС. Метод был разработан и валидирован для этой цели.

протокол

1. Эксплуатация машины

1. Запуск машины и программного обеспечения
   ПРИМЕЧАНИЕ: На дополнительном рисунке S1A-D показаны шаги по запуску машины и программного обеспечения.
   1. Включите прибор не менее чем за 30 минут до начала измерений, а затем запустите ПК.
   2. Дважды щелкните значок программного обеспечения прибора , чтобы запустить программу.
   3. Введите логин и пароль в окне входа. Убедитесь, что у каждого пользователя есть собственная учетная запись.
   4. Подождите, пока все три черные полосы в правом нижнем углу не загорятся зеленым, указывая на то, что устройство готово к работе.
   5. В случае длительных периодов бездействия, когда пользователь автоматически выходит из системы, в разделе « Безопасность» нажмите « Войти» и повторно введите пароль.
2. Создание файла измерений
   ПРИМЕЧАНИЕ: Новый файл измерений создается в начале каждого дня измерения. Все измерения перечисляются и сохраняются в файле измерений. Для получения подробной информации об этой процедуре см. дополнительный рисунок S2A-B.
   1. Создайте новый файл измерения, нажав « Файл» | Новинки | Файл измерений. В открывшемся окне выберите место хранения и назовите файл измерения. Подтвердите данные, нажав « Сохранить».
   2. Чтобы открыть файл, нажмите «Файл» | Открыть | Файл измерений. Выберите файл измерения в открывшемся окне, подтвердите детали, нажав « Открыть», выберите имя файла и нажмите « Сохранить».
3. Печать результатов
   1. Распечатайте или сохраните результаты испытания системы на пригодность (SST) (см. этап 1.5) и среднее значение измерения образца в соответствии с дополнительным рисунком S3.
   2. Отметьте измерения в представлении «Записи » файла измерения.
   3. Щелкните правой кнопкой мыши « Пакетная печать» и подождите, пока откроется еще одно небольшое окно.
   4. Выберите отчет об интенсивности PSD из вариантов и подтвердите его, нажав «ОК».
4. Общая процедура начала измерения
   ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура начала измерения описана на дополнительном рисунке S4A-D. Следуйте по пути, описанному ниже, для необходимого файла параметров устройства (называемого СОП):
   1. Выберите нужную СОП из выпадающего списка. Поскольку в списке отображаются последние использованные СОП, если требуется более старая СОП, выберите «Обзор СОП» и подтвердите, щелкнув зеленую стрелку. Как только место хранения СОП откроется, перейдите к шагу 1.4.2.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о важных параметрах системы, характерных для сахарозы железа (например, время уравновешивания аттенюатора), см. Таблицу 1.
   2. В открывшемся окне внесите необходимые записи в поля « Имя образца » и «Примечания». Подтвердите, нажав « ОК», и дождитесь автоматического открытия окна измерения.
   3. Начните измерение, нажав на зеленую кнопку «Пуск ».
   4. Как только в конце измерения раздастся звуковой сигнал, закройте окно измерения .
5. Измерение теста пригодности системы (SST)
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к нижней части кюветы (зоне измерения). В начале и в конце последовательности измерьте стандарт частиц 20 нм.
   1. Залейте ~ 1 мл стандарта неразбавленных частиц в полистирольную кювету и закройте крышкой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавленный стандарт, приготовленный на этапе 1.5.1, можно использовать в течение 1 месяца.
   2. После наполнения закройте кювету и проверьте, нет ли пузырьков воздуха. Удалите пузырьки воздуха, слегка постучав по кювете.
   3. Поместите кювету в держатель ячейки прибора так, чтобы стрелка была направлена вперед, и закройте крышку измерительной камеры.
   4. Загрузите СОП с параметрами объекта и введите в стартовом окне следующие данные:
      Название образца: Стандарт частиц SST 20 нм
      Затем добавьте примечание: идентификационный номер и срок действия стандарта
   5. Начните измерение.
   6. После окончания измерения, когда прозвучит звуковой сигнал, закройте окно измерения.
   7. Распечатайте отчет (см. пункт 1.1.3).
      ПРИМЕЧАНИЕ: SST сдается, если размер частиц Z-average соответствует значению сертификата анализа ± 10%.
6. Измерение раствора сахарозы железа
   1. Пипетку 0,5 мл раствора ИС с содержанием железа 2% м/В мерную колбу объемом 25 мл и наполнить до метки водой с низким содержанием частиц (например, свежедеионизированной и отфильтрованной [размер пор 0,2 мкм]); этот раствор содержит 0,4 мг Fe / мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пробоподготовка на этапе 1.6.1. При этом специфическое разбавление было установлено при разработке метода, и это было определено как оптимальное разведение для этой цели.
   2. Для предварительной очистки наполните полистирольную кювету приготовленным мерным раствором примерно на 3/4, аккуратно перемешайте, а затем опорожните как можно полнее.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не прикасайтесь к нижней части кюветы (зоне измерения) и избегайте пузырьков воздуха, не встряхивая кювету.
   3. Для измерения пипеткой наберите 1 мл мерного раствора в кювету и накройте крышкой.
   4. Проверьте измерительный раствор в кювете на наличие пузырьков воздуха. Если есть пузырьки воздуха, удалите их, слегка постукивая по кювете.
7. Выполнение измерения
   1. Поместите пластиковую кювету с измерительным раствором в прибор так, чтобы стрелка была направлена вперед, и закройте крышку.
   2. Загрузите параметр SOP (см. этап 1.4.1) и введите в стартовом окне следующие данные:
      Имя образца: Номер партии
   3. Начните измерение.
   4. После окончания измерения, когда прозвучит звуковой сигнал, закройте окно измерения .
   5. Рассчитайте среднее значение шести отдельных измерений в соответствии с дополнительным рисунком S5. Отметьте отдельные измерения в представлении записей файла измерений, щелкните правой кнопкой мыши « Создать средний результат», добавьте имя среднего значения в поле « Имя образца» и подтвердите, нажав « ОК».
   6. Подождите, пока программа создаст новую запись в конце списка, и найдите введенное имя и усредненный результат в этой записи.
   7. Распечатайте отчет (см. этап 1.1.3).

Результаты

Описанный метод был валидирован в соответствии с ICH Q2(R1)²⁰, который включал измерение тестовых растворов в различных условиях. Точность составила всего 0,5% RSD для среднего размера Z, в то время как для PDI было рассчитано максимум 3,5% RSD. Средние результаты от разных аналитиков и д...

Обсуждение

DLS стал фундаментальным анализом для определения размера и распределения наночастиц по размерам для применения в разработке лекарств и нормативной оценке. Несмотря на прогресс в методах DLS, все еще существуют методологические проблемы, связанные с выбором разбавителя и подготовкой пр...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Zetasizer Nano ZS	Malvern	NA	equipped with Zetasizer software 7.12, Helium Neon laser (633 nm, max. 4 mW) and 173° backscattering geometry
Materials
Disposable plastic cuvettes
LLG-Disposable plastic cells	LLG labware	LLG-Küvetten, Makro, PS; Order number 9.406011
low-particle water			(The use of freshly deionized and filtered (pore size 0.2 μm) water is recommended).
Microlitre pipette
Venofer 100 mg/5 mL	Vifor Pharma
Volumetric flask 25 mL
Nanosphere	Thermo	3020A	Particle Standard
Software
Origin Pro v.8.5	Origin Lab Corporation