JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этом исследовании подробно описывается очистка KIF1A (1-393LZ), члена семейства кинезин-3, с использованием системы экспрессии Sf9-бакуловируса. Анализ одномолекулярного и многомоторного скольжения in vitro этих очищенных двигателей показал надежные свойства подвижности, сопоставимые с двигателями из лизата клеток млекопитающих. Таким образом, Sf9-бакуловирусная система поддается экспрессии и очистке интересующего моторного белка.

Аннотация

Сложная клеточная среда создает проблемы для анализа подвижности одной молекулы. Тем не менее, прогресс в методах визуализации улучшил исследования одной молекулы и приобрел огромную популярность в обнаружении и понимании динамического поведения флуоресцентных помеченных молекул. Здесь мы описываем подробный метод одномолекулярных исследований in vitro двигателей семейства кинезин-3 с использованием микроскопии тотальной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF). Кинезин-3 - это большое семейство, которое играет решающую роль в клеточных и физиологических функциях, начиная от внутриклеточного транспорта груза до деления клеток и развития. Ранее мы показали, что конститутивно активные двигатели димерного кинезина-3 демонстрируют быструю и сверхпроцессорную подвижность с высоким сродством микротрубочек на одномолекулярном уровне с использованием клеточных лизатов, полученных путем экспрессии мотора в клетках млекопитающих. Наша лаборатория изучает двигатели кинезин-3 и их регуляторные механизмы с использованием клеточного, биохимического и биофизического подходов, и такие исследования требуют очищенных белков в больших масштабах. Экспрессия и очистка этих двигателей с использованием клеток млекопитающих были бы дорогостоящими и трудоемкими, тогда как экспрессия в системе экспрессии прокариот привела бы к значительно агрегированному и неактивному белку. Чтобы преодолеть ограничения, связанные с системами бактериальной очистки и лизатом клеток млекопитающих, мы создали надежную систему экспрессии Sf9-бакуловируса для экспрессии и очистки этих двигателей. Двигатели кинезин-3 имеют С-концевую маркировку 3-тандемными флуоресцентными белками (3xmCitirine или 3xmCit), которые обеспечивают улучшенные сигналы и уменьшенное фотоотбеливание. Анализ очищенных белков Sf9 in vitro с одной молекулой и несколькими двигателями скольжения показывает, что двигатели кинезин-3 быстры и сверхпроцессорны, сродни нашим предыдущим исследованиям с использованием лизатов клеток млекопитающих. Другие приложения, использующие эти анализы, включают подробное знание олигомерных условий двигателей, конкретных партнеров связывания, параллельных биохимическим исследованиям, и их кинетического состояния.

Введение

Чрезвычайно переполненная клеточная среда создает много проблем при сортировке предназначенных белков и молекул. Этой интенсивной нагрузке на организацию и пространственно-временное распределение молекул внутри цитоплазмы способствуют молекулярные моторы и цитоскелетные следы. Молекулярные двигатели - это ферменты, которые гидролизуют энергетические валюты, такие как АТФ, и используют эту энергию во время движения и генерации силы1. Основываясь на сходстве аминокислотных последовательностей, кинезины сгруппированы в 14 семейств, и, несмотря на это сходство, каждый двигатель вносит уникальный вклад в функционирование клетки. Двигатели семейства Kinesin-3 составляют один из крупнейших, включающий пять подсемейств (KIF1, KIF13, KIF14, KIF16 и KIF28)2, связанных с различными клеточными и физиологическими функциями, включая перенос пузырьков, сигнализацию, митоз, ядерную миграцию и развитие 3,4,5. Нарушение транспортной функции кинезин-3 связано со многими нейродегенеративными расстройствами, дефектами развития и онкологическими заболеваниями 6,7,8,9.

Недавняя работа показала, что двигатели кинезин-3 являются мономерами, но подвергаются димеризации, вызванной грузом, и приводят к быстрой и сверхпроцессорной подвижности по сравнению с обычным кинезином 10,11,12,13. Их биохимическая и биофизическая характеристика нуждается в большом количестве очищенных, активных белков. Однако их производство в системе прокариотической экспрессии приводило к неактивным или агрегированным двигателям, предположительно из-за несовместимых механизмов синтеза, сворачивания и модификации белка 14,15,16,17,18. Чтобы обойти такие ограничения и увеличить урожайность, здесь мы создали надежную систему экспрессии Sf9-бакуловируса для экспрессии и очистки этих двигателей.

Система экспрессии бакуловируса использует клеточные линии насекомых Sf9 в качестве системы-хозяина для высокопроизводительной экспрессии эукариотического рекомбинантного белка19,20. Бакуловирус обладает сильным промотором многогранника, который помогает в гетерологичной экспрессии генов и производстве растворимых рекомбинантных белков17. Благодаря своей экономической эффективности, безопасности в обращении и большому количеству активной экспрессии белка, он стал мощным инструментом21. Чтобы выразить интересующий белок, ключевым шагом является генерация рекомбинантного bacmid. Поскольку коммерчески доступные комплекты генерации bacmid стоят дорого, и мы будем работать с большим количеством образцов, мы разработали собственный протокол для больших и маленьких вставок двигателей kinesin-3 в bacmids. Sf9-очищенные кинезин-3 двигатели были использованы для характеристики свойств скольжения in vitro одномолекулярных и многомоторных микротрубочек с использованием флуоресцентной микроскопии полного внутреннего отражения (TIRF). Двигатели имеют С-концевую маркировку 3-тандемными флуоресцентными молекулами (3xmCit) для обеспечения улучшенного сигнала и снижения фотоотбеливания. Благодаря повышенному соотношению сигнал/шум, меньшей фототоксичности и селективной визуализации очень небольшой области, близкой к крышке, визуализация TIRF широко используется для визуализации динамики белка на одномолекулярном уровне in vivo и in vitro.

В этом исследовании обсуждается очистка двигателей кинезин-3 с использованием системы экспрессии Sf9-бакуловируса и визуализации in vitro с одной молекулой и многомоторного скользящего анализа двигателей с использованием микроскопии TIRF. В целом, это исследование показывает, что свойства подвижности очищенных двигателей Sf9 идентичны свойствам двигателей, полученных из лизатов клеток млекопитающих. Следовательно, мы считаем, что система Sf9-бакуловируса может быть адаптирована для экспрессии и очистки любого моторного белка, представляющего интерес.

протокол

1. Культура Sf9, трансфекция и генерация вирусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Поддерживать клетки Sf9 в 30 мл среды Sf-900/SFM в 100 мл стерильной, одноразовой конической колбы без какого-либо антибиотика/антимикотика при 28 °C. Храните культуру суспензии в орбитальном шейкере при 90 об/мин. Подача CO2 и поддержание влажности не требуется. Клетки обычно субкультивируют каждый четвертый день путем инокуляции 0,5 х 106 клеток / мл, чтобы достичь плотности 2,0 х 106 клеток / мл на четвертый день.

  1. Генерация запасов вирусов P0
    1. Для трансфекции семена клеток в 35-миллиметровую чашку с конфьюностью 4,5 х 105 клеток/мл и выдерживают при 28 °C без встряхивания.
    2. Через 24 ч, как только клетки прикрепятся и выглядеть здоровыми, приступайте к трансфекции, как описано ниже.
      1. Трубка A: Смешайте 1 мкг кодирования ДНК bacmid для конститутивно активного двигателя KIF1A(1-393LZ)-3xmCit-FLAG, специфического кинезин-3, со 100 мкл недополняемой среды Грейс.
      2. Трубка B: Смешайте 6 мкл трансфекционного реагента со 100 мкл недополнимой среды Грейс.
      3. Осторожно перенесите содержимое трубки A в трубку B и тщательно перемешайте, пипеткой вверх и вниз (примерно 20 раз).
      4. Инкубировать смесь ~45 мин при комнатной температуре.
    3. После завершения инкубации добавьте 0,8 мл недополнимой среды Грейс к вышеуказанной смеси и медленно перемешайте путем пипетирования.
    4. Осторожно аспирировать среду Sf-900/SFM из клеток (чтобы удалить любые следы сыворотки, которые могут повлиять на эффективность трансфекции).
    5. Добавляют трансфекционную смесь со стадии 1.1.3 по каплям на верхнюю часть клеток и инкубируют пластину в течение 6 ч при 28°С.
    6. После инкубации осторожно удаляют трансфекционную смесь, добавляют 2 мл среды Sf-900/SFM и инкубируют далее в течение 48 ч при 28 °C.
    7. Проверьте экспрессию моторного белка под инвертированным флуоресцентным микроскопом. Моторный белок помечен флуоресцентным белком, mCitrine, вариантом желтого флуоресцентного белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Трансфектированные клетки визуализировались под перевернутым микроскопом, оснащенным дифференциальным интерференционным контрастом (ДВС-синдромом) и эпифлуоресцентной подсветкой с 20-кратным объективом (200-кратное увеличение), ртутной лампой и камерой EM-CCD. Проверьте эффективность генерации вируса и инфекции путем мониторинга экспрессии моторов, помеченных цитрином, в клетках через возбуждение митрина и куб эмиссионного фильтра. Кроме того, проверьте наличие морфологических изменений инфицированных клеток, таких как увеличенные клетки / ядра (рисунок 1A-C).
    8. Опять же, проверьте клетки через 72 ч после заражения. Обычно клетки начинают отделяться от поверхности (рисунок 2).
    9. Если >5% клеток отделились от поверхности, собирают среду с инфицированными клетками в 1,5 мл стерильных микроцентрифужных трубках и вращают в течение 5 мин при 500 х г.
    10. Соберите супернатант и заморозьте аликвоты 1 мл в жидком азоте и храните в виде запаса P0 при -80 °C или используйте его для генерации запаса вируса P1.
  2. Генерация запасов вирусов P1
    1. Чтобы еще больше усилить запасы бакуловируса P0 и подтвердить экспрессию белка, выращивайте клетки Sf9 в культуре жидкой суспензии.
    2. В стерильную коническую колбу объемом 100 мл добавьте 10 мл среды Sf-900/SFM с плотностью клеток 2 x 106 клеток/мл и 1 мл вирусного материала P0. Инкубировать при 28 °C с постоянным встряхиванием при 90 об/мин.
    3. После 72 ч инфекции проверьте экспрессию белка, как описано ранее (шаг 1.1.7). Если экспрессия белка хорошая (>90% клеток показывают яркий сигнал флуоресценции мцитрина) и показывает значительную гибель клеток (примерно 10%-15%), вращайте клетки в 15 мл стерильной конической трубке при 500 х г в течение 5 мин.
    4. Соберите супернатант, заморозьте аликвоты 1 мл (P1) в жидком азоте и храните при -80°C или приступайте к крупномасштабной инфекции и очистке белка.
  3. Крупномасштабная инфекция
    1. Для крупномасштабной экспрессии белка заражают 30 мл культуры суспензии при плотности 2 х 106 клеток/мл с 1 мл запаса вируса Р1 и инкубируют при 28 °C с постоянным встряхиванием при 90 об/мин.
    2. Через ~ 72 ч после заражения проверьте экспрессию белка (в целом, максимальная экспрессия белка достигается между 65-75 часами после заражения).
    3. Если >90% клеток показывают яркий флуоресцентный сигнал с минимальной гибелью клеток (<5%), соберите клетки в стерильную коническую трубку объемом 50 мл и вращайтесь вниз при 500 х г при 4 °C в течение 15 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Должна быть минимальная гибель клеток (<5%), потому что мертвые клетки высвобождают клеточное содержимое в среду, что приводит к потере экспрессированного белка.
    4. Выбросьте супернатант, соберите гранулу клетки и приступайте к очистке белка.

2. Sf9 очистка двигателей кинезин-3

  1. К вышеуказанной клеточной грануле добавьте 3 мл ледяного лизисного буфера (Дополнительная таблица 1), только что дополненного 5 мМ DTT, 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл лейпептина и 5 мкг/мл PMSF, и лизируйте клетки путем пипетирования 20-25 раз без образования пузырьков воздуха. Для всех буферных композиций и реагентов, пожалуйста, обратитесь к Дополнительной таблице 1.
  2. Раскрутите клеточный лизат при 150 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
  3. Соберите супернатант в свежую стерильную трубку и смешайте с ~40 мкл 50% анти-FLAG M2 аффинной смолы. Инкубировать смесь в течение 3 ч при 4 °C с сквозным кувырканием.
  4. После инкубации гранулируют смолу FLAG путем прядения при 500 х г в течение 1 мин при 4 °C. Аккуратно аспирируйте супернатант, не нарушая гранулу, иглой 26 г и выбросьте.
  5. Промыть гранулу смолы FLAG три раза с помощью буфера для промывки холодным льдом (Дополнительная таблица 1), только что дополненной 2 мМ DTT, 5 мкг/мл апротинина, 5 мкг/мл лейпептина и 5 мкг/мл PMSF. Гранулировать бусины прядением при 500 х г в течение 1 мин при 4 °С в каждой стирке.
  6. После третьей промывки тщательно процедите буфер для стирки как можно больше, не нарушая гранулу. Для элюирования белка добавьте ~70 мкл промывочного буфера, содержащего 100 мкг/мл пептида FLAG, к грануле смолы и инкубируйте в течение ночи при 4 °C с сквозным кувырканием.
  7. На следующий день открутите смолу при 500 х г в течение 1 мин при 4 °C. Соберите супернатант, содержащий очищенный белок, в свежую пробирку и добавьте 10% глицерина. Заморозьте аликвоты по 5 мкл в жидком азоте и храните при -80 °C до дальнейшего использования.
  8. Запустите гель SDS-PAGE, чтобы определить концентрацию белка и выход. Наряду с очищенным белком, представляющим интерес, стандартный контроль белка, BSA известных концентраций в диапазоне от 0,2 мкг, 0,4 мкг, 0,6 мкг, 0,8 мкг и 1 мкг загружаются для создания стандартной кривой. Окрасьте гель голубым цветом Coomassie Brilliant (рисунок 3).
  9. Анализируйте гель с помощью встроенного инструмента количественной оценки геля в программном обеспечении ImageJ. Во-первых, измерьте интенсивность диапазона известных концентраций BSA и сгенерируйте стандартную кривую. Затем измерьте интенсивность очищенной белковой полосы и определите концентрацию белка. Для этого откройте программное обеспечение Image J, нажмите на опцию Analyze в строке меню и выберите Gels в раскрывающемся меню.

3. Анализ подвижности одной молекулы in vitro с использованием Sf9-очищенных кинезин-3 двигателей

ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные Sf9 двигатели кинезин-3 могут быть использованы для изучения биохимических и биофизических свойств, таких как скорость оборота АТФ, сродство микротрубочек, скорость, длина пробега, размер шага и генерация силы. Здесь описан подробный протокол анализа подвижности одной молекулы in vitro KIF1A(1-393LZ) с использованием микроскопии тотальной флуоресценции внутреннего отражения (TIRF). Для всех буферных составов и реагентов, пожалуйста, обратитесь к Дополнительной таблице 1.

  1. Полимеризация микротрубочек
    1. В предварительно охлажденной микроцентрифужной трубке объемом 0,5 мл готовят полимеризационную смесь путем пипетирования в следующем порядке: 12,0 мкл буфера BRB80, рН 6,9; 0,45 мкл 100 мМMgCl2, 1 мкл 25 мМ ГТФ.
    2. Достаньте 10 мкл аликвоты 10 мг/мл тубулина, хранящегося в жидком азоте, немедленно разморозьте и добавьте в вышеуказанную полимеризационную смесь. Аккуратно перемешать, пипетировав 2-3 раза, не создавая пузырьков воздуха.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выполняйте вышеуказанные шаги быстро и строго на льду.
    3. Оставьте вышеуказанную смесь на льду в течение 5 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Это критический шаг для предотвращения денатурации тубулина или для предотвращения образования коротких семян микротрубочек.
    4. Переложите трубку в предварительно нагретый при 37 °C тепловой блок/водяную баню и инкубируйте в течение 30 мин для полимеризации микротрубочек.
    5. Пока микротрубочки полимеризуются, разморозьте аликвоту буфера P12 и доведите ее до комнатной температуры.
    6. Перед завершением 30-минутной инкубации начните подготовку стабилизационного буфера MT путем пипетирования 100 мкл буфера P12 в свежую микроцентрифужную трубку. К этому добавляют 1 мкл таксола 1 мМ и сразу же вихрь смеси.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Начните подготовку стабилизационного буфера MT примерно за 5 мин до завершения инкубации на этапе 3.1.4. Таксол стабилизирует полимеризованные микротрубочки путем связывания с β-тубулином.
    7. Нагрейте буфер стабилизации микротрубочек в течение 2-3 мин при 37 °C и аккуратно добавьте его к полимеризованным микротрубочкам, не нарушая полимеризационную смесь на дне.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Нагревание стабилизационного буфера приведет его к той же температуре, что и полимеризационная смесь.
    8. Не постукивайте смесью и не пипеткой и не инкубируйте далее при 37 °C в течение 5 минут.
    9. Осторожно постучите по смеси и смешайте ее со скошенным наконечником (емкость 200 мкл) медленно с помощью пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: С этого момента всегда обращайтесь с микротрубочками со скошенным вырезанным наконечником, чтобы избежать сдвига микротрубочек.
    10. Возьмите 10-15 мкл полимеризованных микротрубочек в проточной ячейке, чтобы проверить правильную полимеризацию микротрубочек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно визуализировать немаркированные микротрубочки, используя установку микроскопии DIC.
    11. Если микротрубочки сконцентрированы, разбавляют их в буфере Р12, дополненном таксолом 10 мкМ.
  2. Подготовка камеры подвижной проточной ячейки
    1. Подготовьте камеру подвижности с помощью стеклянной горки, двусторонней ленты и стеклянной крышки (22 мм х 30 мм).
    2. Возьмите стеклянную горку, поместите каплю (~ 70 мкл) деионизированной дистиллированной воды в середину и протрите ее папиросной бумагой без ворса.
    3. Вырежьте две полоски двусторонней ленты (~35 х 3 мм) и плотно приклейте их к стеклянному слайду параллельно, оставив ~4-5 мм зазор между двумя полосами, чтобы создать узкий проход.
    4. Затем возьмите крышку и добавьте каплю (~ 20 мкл) деионизированной дистиллированной воды в середину. Поместите полоску безворсовой очищающей папиросной бумаги на каплю воды, пока она не впитает воду. Затем медленно сдвиньте его к одному концу крышки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка должна быть полностью сухой. На крышке не должно быть видно воды.
    5. Поместите крышку на двусторонние полоски, приклеенные к слайду, и равномерно нажмите на крышку вдоль полосок, чтобы она прочно приклеилась.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пожалуйста, убедитесь, что очищенная сторона крышки обращена к стеклянному слайду.
    6. Убедитесь, что вместе это создает узкую камеру емкостью 10-15 мкл для выполнения анализа подвижности (рисунок 4A).
  3. Анализ подвижности одной молекулы in vitro
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения одномолекулярных свойств подвижности двигателей на основе микротрубочек микротрубочки необходимо адсорбировать на поверхности крышки в камере подвижности.
    1. Разбавляют полимеризованные таксоло-стабилизированные микротрубочки в буфере P12, дополненном 10 мкМ таксолом в соотношении 1:5, и смешивают путем медленной пипетки скошенным наконечником.
    2. Держите проточную камеру в наклонном положении (~15-20°). Пропустите 30 мкл разбавленного раствора микротрубочек через проточную камеру с верхнего конца, сохраняя безворсовую папиросную бумагу на нижнем конце для поглощения жидкости. Это создает силу сдвига для выравнивания микротрубочек в направлении потока и помогает адсорбировать микротрубочки прямо и выравнивать параллельно.
    3. Оставьте небольшую каплю жидкости на обоих концах камеры и держите проточную ячейку в перевернутом положении (крышка, обращенная к дну) в закрытой, влажной камере, чтобы предотвратить высыхание камеры подвижности.
    4. Дайте ему постоять в течение ~ 30 минут, чтобы микротрубочки адсорбировались на поверхности покровного листа внутри камеры подвижности.
    5. Тем временем готовят блокирующий буфер, смешивая 500 мкл буфера P12-BSA с 5 мкл таксола 1 мМ.
    6. Продуть 40-50 мкл блокирующего буфера и инкубировать слайд в перевернутом положении в течение 10 мин во влажной камере.
    7. Готовят смесь подвижности путем пипетирования следующих компонентов в стерильную микроцентрифужную трубку емкостью 500 мкл в следующем порядке: 25 мкл буфера P12 с таксолом, 0,5 мкл 100 мМ MgCl2, 0,5 мкл 100 мМ DTT, 0,5 мкл 20 мг/мл глюкозооксидазы, 0,5 мкл 8 мг/мл каталазы, 0,5 мкл 2,25 М глюкозы и 1,0 мкл 100 мМ АТФ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Флуоресцентная визуализация широко используется для биологических применений 22,23,24,25,26. Фотовозбуждение флуоресцентных белков генерирует активные формы кислорода (АФК), которые могут вызывать фотоотбеливание флуоресцентных белков и повреждение биологических образцов27,28. Поглотители кислорода, такие как глюкоза, глюкозооксидаза и каталаза, обычно используются в анализах подвижности для ограничения фотоповреждений и продления времени отбеливания флуоресцентных белков.
    8. Наконец, добавьте 1 мкл очищенного двигателя к вышеупомянутой смеси подвижности и хорошо перемешайте, прежде чем влиться в камеру подвижности.
    9. Запечатайте оба конца камеры подвижности жидким парафиновым воском и немедленно сделайте изображение под освещением TIRF с использованием объектива 100X TIRF 1,49 NA с 1,5-кратным увеличением.
    10. Чтобы сфокусировать поверхность крышки, сначала сосредоточьтесь на одном из внутренних краев двусторонней ленты в камере подвижности при дифференциальном интерференционном контрастном (ДВС-подсветке).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Яркая и неровная поверхность будет видна.
    11. Затем переместите фокус в камеру моторики. Используя тонкую регулировку, сфокусируйте поверхность крышки и найдите микротрубочки, адсорбированные на поверхности крышки.
    12. После того, как микротрубочки сфокусированы, переключитесь на освещение TIRF с помощью лазера возбуждения 488 нм и отрегулируйте глубину освещения, изменив угол луча возбуждения, чтобы получить наилучшее и равномерное освещение TIRF (рисунок 4B).
    13. Сфокусируйте отдельные двигатели с метками mCitrine, движущиеся процессно вдоль поверхности микротрубочек с экспозицией 100 мс, и запишите движение с помощью камеры EM-CCD.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Хотя анализы подвижности проводились на немаркированных микротрубочках, функция z-проекции максимальной интенсивности может быть использована для выявления контура дорожки микротрубочек. Предпочтительно, события на длинных дорожках микротрубочек рассматривались для анализа отслеживания.
    14. Вручную отслеживайте положение флуоресцентно помеченных отдельных двигателей, идущих по длинным дорожкам микротрубочек кадр за кадром, используя специально написанный плагин в программном обеспечении ImageJ (nih.gov), как описано ранее29.
    15. Генерируйте гистограммы скорости и длины пробега для моторной популяции, отображая количество событий в каждой корзине. Подогнать эти гистограммы к одной пиковой функции Гаусса для получения средней скорости и длины пробега12 (рисунок 4C-E).

4. Скольжение микротрубочек in vitro

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы понять коллективное поведение двигателей кинезин-3, был проведен анализ скольжения микротрубочек in vitro 18,30,31. Там, где двигатели иммобилизуются на крышку в перевернутом положении и при добавлении микротрубочек в камеру, микротрубочки приземляются на двигатели и скользят, когда двигатели пытаются ходить по ним (рисунок 5A, B).

  1. Флуоресцентная полимеризация микротрубочек: Полимеризовать микротрубочки в соответствии с протоколом, описанным ранее, за исключением смешивания меченого родамином тубулина (3 мг/мл) с немаркированным тубулином (10 мг/мл) в соотношении 1:10.
  2. После 30 мин полимеризации осторожно добавляют 30 мкл предварительно нагретого стабилизационного буфера микротрубочек и инкубируют далее в течение 5 мин при 37 °C.
  3. Далее срезают микротрубочки путем пипетки капиллярно-нагружающим наконечником (~25-30 раз).
  4. Подготовьте камеру потока подвижности, как описано выше, протейте 50 мкл очищенных Sf9 нанотел GFP (2,5 мкл 100 нМ, разбавленных в 50 мкл буфера P12) и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре с крышкой, обращенной вниз во влажную камеру.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Двигатели C-терминалы помечены mCitrine. Нанотела GFP используются для иммобилизации двигателей из-за их низкой константы диссоциации32.
  5. Блокируйте поверхность покрова, вливая 50 мкл блочного буфера в проточную камеру для предотвращения неспецифической адсорбции белка и инкубируйте в течение 5 мин.
  6. Подготовьте моторную смесь путем пипетирования 50 мкл блочного буфера, 1 мкл 100 мМ АТФ и 5 мкл 100 нМ Sf9-очищенных двигателей кинезин-3. Осторожно перемешайте перед вливанием в камеру и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре во влажной камере.
  7. Дважды промыть камеру 50 мкл казеина P12.
  8. В стерильной микроцентрифужной трубке готовят скользящую пробирную смесь в следующем порядке: 45 мкл P12-казеина с 10 мкМ таксола, 1 мкл 100 мМ АТФ, 0,5 мкл 8 мг/мл каталазы, 0,5 мкл 20 мг/мл глюкозооксидазы, 0,5 мкл 2,25 М глюкозы и 1 мкл срезанных флуоресцентных микротрубочек. Аккуратно перемешайте содержимое, прежде чем влиться в камеру подвижности, и запечатайте концы камеры жидким парафиновым воском.
  9. Изображение микротрубочек скользит под подсветкой TIRF при экспозиции 100 мс и захват изображений с помощью прилагаемой камеры EM-CCD.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Средняя скорость скольжения микротрубочек была определена путем ручного отслеживания примерно 100 отдельных микротрубочек кадр за кадром с использованием специально написанного плагина в ImageJ29. Определите среднюю скорость скольжения микротрубочек, сгенерировав гистограмму и подогнав ее к функции Гаусса (рисунок 5C,D).

Результаты

Для экспрессии и очистки активных и функциональных рекомбинантных моторных белков в больших масштабах с использованием экспрессии Sf9-бакуловируса системе необходима генерация вирусных частиц, стабильно несущих кодирующую последовательность для заражения клеток Sf9. Для достижения э?...

Обсуждение

Система экспрессии Sf9-бакуловируса является одним из наиболее универсальных и успешных методов высокопроизводительного производства белка 19,36,37. Способность к посттрансляционной модификации клеток Sf9 очень сопоставима с системой

Раскрытие информации

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов, которые можно было бы декларировать.

Благодарности

V.S. и P.S. благодарят профессора Кристен Дж. Верхи (Мичиганский университет, Анн-Арбор, Мичиган, США) и профессора Роопа Маллика (Индийский технологический институт Бомбея (IITB), Мумбаи, Индия) за их безусловную поддержку на протяжении всего исследования. P.S. благодарит доктора Сиваприю Кирубакаран за поддержку на протяжении всего проекта. V.S. признает финансирование через DBT (Грант No: BT/PR15214/BRB/10/1449/2015 и BT/RLF/Re-entry/45/2015) и DST-SERB (Грант No: ECR/2016/000913). P.K.N признает ICMR за финансирование (Грант No 5/13/13/2019/NCD-III). P.S. признает финансирование из DST (Грант No: SR/WOS-A/LS-73/2017). D.J.S признает стипендию от IIT Gandhinagar.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Sf9 culture and transfection materials
anti-FLAG M2 affinityBiolegend651502For protein purification
AprotininSigmaA6279For protein purification
CellfectinInvitrogen10362100For Sf9 transfection
DTTSigmaD5545For motility assays and protein purification
FLAG peptideSigmaF3290For protein purification
GlycerolSigmaG5516To freeze the protein
HEPESSigmaH3375For Sf9 lysis buffer
IGEPAL CA 630SigmaI8896For Sf9 lysis buffer
KClSigmaP9541For buffers preparation
LeupeptinSigmaL2884For protein purification
MgCl2SigmaM2670For buffers preparation
NaClSigmaS7653For preparing lysis buffer
PMSFSigmaP7626For protein purification
Sf9 cellsKind gift from Dr. Thomas Pucadyil (Indian Institute of Science Education and Research, Pune, India).For baculovirs expression and protein purification
Sf9 culture bottlesThermo Scientific4115-0125For suspension culture
Sf-900/SFM medium (1X)Thermo Scientific10902-096 -500mlFor culturing Sf9 cells
SucroseSigmaS1888Preparing lysing buffer for Sf9 cells
Unsupplemented Grace’s mediaThermo Scientific11595030 -500mlFor Sf9 transfection
Mirotubule Polymerization and Single molecule assay materails
ATPSigmaA2647For motility and gliding assay
BSASigmaA2153For blocking motility chamber
CatalaseSigmaC9322For motility and gliding assay
DMSOSigmaD5879For dissolving Rhodamine
EGTASigma3777For preparing buffers
GlucoseSigmaG7021For motility and gliding assay
Glucose oxidaseSigmaG2133For motility and gliding assay
GTPSigmaG8877For microtubule polymerization
KOHSigmaP1767Preparing PIPES buffer pH 6.9
PIPESSigmaP6757For preparing motility and gliding assay buffers
Microtubule gliding assay materials
26G  needleDispovanFor shearing microtubules
CaseinSigmaC3400For microtubule glidning assay
GFP nanobodiesGift from Dr. Sivaraj Sivaramakrishnan (University of Minnesota, USA)For attaching motors to the coverslip
RhodamineThermo Scientific46406For preparing labelling tubulin
Microscope and other instruments
0.5ml, 1.5 and 2-ml microcentrifuge tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ml  disposable sterile pipettesEppendorfFor Sf9 culture and purification
10ul, 200ul, 1ml micropipette tipsEppendorfFor Sf9 culture and purification
15ml concal tubesEppendorfFor Sf9 culture and purification
35mm cell culture dishCole Palmer15179-39For Sf9 culture
BalanceSartorious0.01g-300g
Benchtop orbial shaking incubatorREMIFor Sf9 suspenculture at 28oC
CameraEMCCD Andor iXon Ultra 897For TIRF imaging and acquesition
Double sided tapeScotchFor making motility chamber
Glass coverslipFisherfinest12-548-5Asize; 22X30
Glass slideBlue StarFor making motility chamber
Heating blockNeuationDissolving paraffin wax
Inverted microscopeNikon Eclipse Ti- UTo check protein expression
Lasers488nm (100mW)For TIRF imaging
Liquid nitrogenFor sample freezing and storage
Microcapillary loading tipEppendorfEP022491920For shearing microtubules
MicroscopeNikon Eclipse Ti2-E with DIC set upFor TIRF imaging
Mini spinGenetix, BiotechAsia Pvt.LtdFor quick spin
Objective100X TIRF objective with 1.49NA oil immersionFor TIRF imaging
Optima UltraCentrifuge XEBeckman CoulterFor protein purification
ParafilmEppendorf
pH-meterCorningCoring 430To adjust pH
Pipette-boyVWRFor Sf9 culture and purification
Sorvall Legend Micro 21Thermo ScientificFor protein purification
Sorvall ST8R centrifugeThermo ScientificProtein purification
ThermoMixerEppendorfFor microtubule polymerization
Ultracentrifuge rotorBeckman coulterSW60Ti rotor
Ultracentrifuge tubesBeckman5 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 13 x 51mm
Vortex mixerNeuationSample mixing
WaxSigmaV001228To seal motility chamber

Ссылки

  1. Vale, R. D. The molecular motor toolbox for intracellular transport. Cell. 112, 467-480 (2003).
  2. Miki, H., Okada, Y., Hirokawa, N. Analysis of the kinesin superfamily: insights into structure and function. Trends in Cell Biology. 15 (9), 467-476 (2005).
  3. Hirokawa, N., Niwa, S., Tanaka, Y. Molecular motors in neurons: transport mechanisms and roles in brain function, development, and disease. Neuron. 68 (4), 610-638 (2010).
  4. Hirokawa, N., Takemura, R. Molecular motors and mechanisms of directional transport in neurons. Nature Reviews Neuroscience. 6 (3), 201-214 (2005).
  5. Patel, N. M., et al. KIF13A motors are regulated by Rab22A to function as weak dimers inside the cell. Scientific Advances. 7 (6), (2021).
  6. Franker, M. A., Hoogenraad, C. C. Microtubule-based transport - basic mechanisms, traffic rules and role in neurological pathogenesis. Journal of Cellular Science. 126, 2319-2329 (2013).
  7. Gunawardena, S., Anderson, E. N., White, J. Axonal transport and neurodegenerative disease: vesicle-motor complex formation and their regulation. Degernative Neurological and Neuromuscular Disease. 4, 29-47 (2014).
  8. Rath, O., Kozielski, F. Kinesins and cancer. Nature Reviews Cancer. 12 (8), 527-539 (2012).
  9. Wang, Z. Z., et al. KIF14 promotes cell proliferation via activation of Akt and is directly targeted by miR-200c in colorectal cancer. International Journal of Oncology. 53 (5), 1939-1952 (2018).
  10. Guo, S. K., Shi, X. X., Wang, P. Y., Xie, P. Run length distribution of dimerized kinesin-3 molecular motors: comparison with dimeric kinesin-1. Scientific Reports. 9 (1), 16973 (2019).
  11. Scarabelli, G., et al. Mapping the processivity determinants of the Kinesin-3 motor domain. Biophysical Journal. 109 (8), 1537-1540 (2015).
  12. Soppina, V., et al. Dimerization of mammalian kinesin-3 motors results in superprocessive motion. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (15), 5562-5567 (2014).
  13. Soppina, V., Verhey, K. J. The family-specific K-loop influences the microtubule on-rate but not the superprocessivity of kinesin-3 motors. Molecular Biology Cell. 25 (14), 2161-2170 (2014).
  14. Soppina, V., et al. Kinesin-3 motors are fine-tuned at the molecular level to endow distinct mechanical outputs. BMC Biology. , (2022).
  15. Korten, T., Chaudhuri, S., Tavkin, E., Braun, M., Diez, S. Kinesin-1 Expressed in insect cells improves microtubule in vitro gliding performance, long-term stability and guiding efficiency in nanostructures. IEEE Transactions on Nanobioscience. 15 (1), 62-69 (2016).
  16. Schmidt, F. R. Recombinant expression systems in the pharmaceutical industry. Applied Microbiology and Biotechnology. 65 (4), 363-372 (2004).
  17. Kurland, C., Gallant, J. Errors of heterologous protein expression. Current Opinions in Biotechnology. 7 (5), 489-493 (1996).
  18. Tao, L., Scholey, J. M. Purification and assay of mitotic motors. Methods. 51 (2), 233-241 (2010).
  19. Kost, T. A., Condreay, J. P., Jarvis, D. L. Baculovirus as versatile vectors for protein expression in insect and mammalian cells. Nature Biotechnology. 23 (5), 567-575 (2005).
  20. Felberbaum, R. S. The baculovirus expression vector system: A commercial manufacturing platform for viral vaccines and gene therapy vectors. Biotechnology Journal. 10 (5), 702-714 (2015).
  21. Kumar, N., Pandey, D., Halder, A., Kumar, D., Gong, C. . Trends in Insect Molecular Biology and Biotechnology. , 163-191 (2018).
  22. Nagano, T. Development of fluorescent probes for bioimaging applications. Proceedings of the Japan Academy. Series B. Physical and Biological Sciences. 86 (8), 837-847 (2010).
  23. Hassan, M., Klaunberg, B. A. Biomedical applications of fluorescence imaging in vivo. Comparative Medicine. 54 (6), 635-644 (2004).
  24. Yang, Z., Samanta, S., Yan, W., Yu, B., Qu, J. Super-resolution microscopy for biological imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 3233, 23-43 (2021).
  25. Ettinger, A., Wittmann, T. Fluorescence live cell imaging. Methods in Cell Biology. 123, 77-94 (2014).
  26. Waters, J. C. Live-cell fluorescence imaging. Methods in Cell Biology. 114, 125-150 (2013).
  27. Zheng, Q., Jockusch, S., Zhou, Z., Blanchard, S. C. The contribution of reactive oxygen species to the photobleaching of organic fluorophores. Photochemistry and Photobiology. 90 (2), 448-454 (2014).
  28. Wojtovich, A. P., Foster, T. H. Optogenetic control of ROS production. Redox Biology. 2, 368-376 (2014).
  29. Cai, D., Verhey, K. J., Meyhofer, E. Tracking single Kinesin molecules in the cytoplasm of mammalian cells. Biophysical Journal. 92 (12), 4137-4144 (2007).
  30. Bohm, K. J., Stracke, R., Baum, M., Zieren, M., Unger, E. Effect of temperature on kinesin-driven microtubule gliding and kinesin ATPase activity. FEBS Letters. 466, 59-62 (2000).
  31. Porter, M. E., et al. Characterization of the microtubule movement produced by sea urchin egg kinesin. The Journal of Biological Chemistry. 262 (6), 2794-2802 (1987).
  32. Muyldermans, S. Nanobodies: natural single-domain antibodies. Annual Review of Biochemistry. 82, 775-797 (2013).
  33. Verma, S., Kumar, N., Verma, V. Role of paclitaxel on critical nucleation concentration of tubulin and its effects thereof. Biochemical and Biophysical Research Communications. 478 (3), 1350-1354 (2016).
  34. Parness, J., Horwitz, S. B. Taxol binds to polymerized tubulin in vitro. Journal of Cell Biology. 91 (2), 479-487 (1981).
  35. Schiff, P. B., Fant, J., Horwitz, S. B. Promotion of microtubule assembly in vitro by taxol. Nature. 277 (5698), 665-667 (1979).
  36. Kato, T., Kageshima, A., Suzuki, F., Park, E. Y. Expression and purification of human (pro)renin receptor in insect cells using baculovirus expression system. Protein Expression and Purification. 58 (2), 242-248 (2008).
  37. Liu, F., Wu, X., Li, L., Liu, Z., Wang, Z. Use of baculovirus expression system for generation of virus-like particles: successes and challenges. Protein Expression and Purification. 90 (2), 104-116 (2013).
  38. Terpe, K. Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Applied Microbiology and Biotechnology. 60 (5), 523-533 (2003).
  39. Huang, S. T., et al. Liposomal paclitaxel induces fewer hematopoietic and cardiovascular complications than bioequivalent doses of Taxol. International Journal of Oncology. 53 (3), 1105-1117 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

185

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены