Ex Vivo Органоидная модель аденовирусно-cre опосредованных делеций генов в уротелиальных клетках мышей

Резюме

Этот протокол описывает процесс генерации и характеристики уротелиальных органоидов мыши, содержащих делеции в генах, представляющих интерес. Методы включают сбор уротелиальных клеток мыши, трансдукцию ex vivo с аденовирусом, стимулирующим экспрессию Cre с помощью промотора ЦМВ, и характеристику in vitro , а также in vivo .

Аннотация

Рак мочевого пузыря является недостаточно изученной областью, особенно в генетически модифицированных моделях мышей (GEMM). Инбредные GEMM с тканеспецифическими сайтами Cre и loxP были золотыми стандартами для условного или индуцируемого нацеливания генов. Для обеспечения более быстрых и эффективных экспериментальных моделей разработана система культуры органоидов ex vivo с использованием аденовируса Cre и нормальных уротелиальных клеток, несущих множественные аллели loxP супрессоров опухоли Trp53, Pten и Rb1. Нормальные уротелиальные клетки ферментативно отделены от четырех мочевых пузырей мышей с тройным флоксом (Trp53^f/f: Pten^f/f: Rb1^f/f). Уротелиальные клетки трансдуцируются ex vivo с аденовирусом-Cre, приводимым в действие промотором ЦМВ (Ad5CMVCre). Трансдуцированные органоиды мочевого пузыря культивируются, размножаются и характеризуются in vitro и in vivo. ПЦР используется для подтверждения делеций генов в Trp53, Pten и Rb1. Иммунофлуоресцентное (ИФ) окрашивание органоидов демонстрирует положительную экспрессию маркеров уротелиальной линии (CK5 и p63). Органоиды вводятся подкожно мышам-хозяевам для расширения опухоли и последовательных проходов. Иммуногистохимия (IHC) ксенотрансплантатов демонстрирует положительную экспрессию CK7, CK5 и p63 и отрицательную экспрессию CK8 и Uroplakin 3. Таким образом, опосредованная аденовирусом делеция генов из уротелиальных клеток мыши, спроектированных с сайтами loxP, является эффективным методом быстрой проверки опухолевого потенциала определенных генетических изменений.

Введение

Рак мочевого пузыря является четвертым наиболее распространенным раком у мужчин и ежегодно поражает более 80 000 человек в Соединенных Штатах¹. Химиотерапия на основе платины была стандартом ухода за пациентами с прогрессирующим раком мочевого пузыря на протяжении более трех десятилетий. Ландшафт лечения рака мочевого пузыря был революционизирован недавним одобрением Управлением по контролю за продуктами и лекарствами (FDA) иммунотерапии (ингибиторы иммунной контрольной точки анти-PD-1 и анти-PD-L1), эрдафитиниба (ингибитор рецептора фактора роста фибробластов) и энфортумаба ведотина (конъюгат антитело-лекарство)^2,3,4. Тем не менее, клинически одобренные биомаркеры недоступны для прогнозирования ответов на химиотерапию или иммунотерапию. Существует острая необходимость в создании информативных доклинических моделей, которые могут улучшить понимание механизмов, приводящих к прогрессированию рака мочевого пузыря, и разработать прогностические биомаркеры для различных методов лечения.

Основным препятствием в трансляционных исследованиях мочевого пузыря является отсутствие доклинических моделей, которые резюмируют патогенез рака мочевого пузыря человека и ответы на лечение ^5,6. Было разработано несколько доклинических моделей, включая 2D-модели in vitro (клеточные линии или условно перепрограммированные клетки), 3D-модели in vitro (органоиды, 3D-печать) и модели in vivo (ксенотрансплантат, канцероген-индуцированные, генно-инженерные модели и ксенотрансплантат, полученные от пациента)^2,6. Генетически модифицированные мышиные модели (GEMM) полезны для многих применений в биологии рака мочевого пузыря, включая анализ фенотипов опухолей, механистические исследования генов-кандидатов и / или сигнальных путей и доклиническую оценку терапевтических ответов ^6,7. GEMM могут использовать сайт-специфические рекомбиназы (Cre-loxP) для контроля генетических делеций в одном или нескольких генах-супрессорах опухолей. Процесс генерации желаемых GEMM с множественными делециями генов является трудоемким, трудоемким и дорогостоящим⁵. Общей целью этого метода является разработка быстрого и эффективного метода доставки ex vivo Cre для создания моделей тройного нокаута мочевого пузыря (TKO) из нормальных уротелиальных клеток мыши, несущих тройные флоксированные аллели (Trp53, Pten и Rb1)⁸. Основным преимуществом метода ex vivo является быстрый рабочий процесс (1-2 недели вместо лет разведения мышей). В этой статье описывается протокол сбора нормальных уротелиальных клеток с флокированными аллелями, трансдукцией аденовируса ex vivo, органоидными культурами, а также характеристикой in vitro и in vivo у иммунокомпетентных мышей C57 BL/6J. Этот метод может быть дополнительно использован для получения клинически значимых органоидов рака мочевого пузыря у иммунокомпетентных мышей, имеющих любую комбинацию флоксированных аллелей.

протокол

Все процедуры для животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Комплексном онкологическом центре Розуэлл-Парка, Буффало, штат Нью-Йорк (1395M, 180501 и 180502).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните шаги 1–3 в тот же день.

1. Рассечение мочевого пузыря мыши

1. Подготовка к рассечению
   1. Приготовьте все стерильные инструменты, включая ножницы, щипцы, стерильные DPBS в 35-миллиметровой посуде для культивирования, 70% этанол, стерильную марлю и чистые бумажные полотенца. Очистите все поверхности области рассечения. Генерируйте самцов тройных мышей Trp53^f/f: Pten^f/f: Rb1^f/f (4 мыши, 10 недель), как описано ранее в лаборатории доктора Гудрича ⁸.
2. Эвтаназия и разрез
   1. Усыпляют мышей путем удушья_CO2 , используя скорость потока 2,0 л / мин, с последующим вывихом шейки матки. Очистите область рассечения 70% этанолом и накройте чистым бумажным полотенцем.
   2. Поместите мышь на марлю в область рассечения. Распылите 70% этанола на брюшную полость мыши и используйте стерильные ножницы для рассечения, чтобы сделать нижний средний разрез брюшной полости, обнажающий мочевой пузырь.
3. Рассечение мочевого пузыря
   1. Используйте щипцы, чтобы схватить мочевой пузырь и осторожно подтянуть вверх, чтобы были выявлены двусторонние мочеточниковые соединения. Используйте ножницы для удаления глазного дна мочевого пузыря после пограничной линии между двумя отверстиями мочеточника.
   2. Переведите мочевой пузырь в стерильную посуду с 2 мл DPBS. Удалить жировую и соединительную ткань и поместить мочевой пузырь в новую посуду со стерильными 2 мл DPBS. В это время выньте аденовирус из хранилища -80 °C и держите его на льду.

2. Диссоциация уротелиальных клеток

1. Подготовка к диссоциации клеток
   1. Подготовьте все стерильные инструменты, включая щипцы, хирургические скальпели (лезвие размером 10 с ручкой), стерильные DPBS в 35-миллиметровых чашках для культивирования, полную культуральную среду без FBS, очищенную от древесного угля, определяемую как CCM(-), смесь коллагеназы / гиалуронидазы, рекомбинантный фермент для заменителя трипсина, 10% очищенный от древесного угля FBS в DPBS с 10 мкм свежего Y-27632, стерильный клеточный сетчатый фильтр 100 мкм и центрифужную трубку объемом 15 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Полная культуральная среда (CCM) содержит среду роста эпителиальных клеток молочной железы, дополненную предоставленными факторами роста и 5% FBS, очищенным от древесного угля, 1% заменителем L-глутамина, 100 мкг / мл примоцина и 10 мкМ свежего Y-27632.
2. Измельчение и переваривание мочевого пузыря
   1. Переложите и снова промыть мочевой пузырь 2 мл стерильного DPBS в 35-миллиметровой посуде в шкафу для биобезопасности.
   2. Соберите ткани мочевого пузыря от четырех мышей в чашку с 1 мл CCM (-) и измельчите каждый мочевой пузырь на четыре равные части с помощью хирургического лезвия. Используйте щипцы, чтобы развернуть мочевой пузырь, чтобы обнажить поверхность уротелия для среды.
   3. Переместите кусочки мочевого пузыря и среду в центрифужную трубку объемом 15 мл. Вымойте посуду 2 мл CCM(-) 2x и соберите ее в центрифужную трубку общим объемом 5 мл.
   4. Добавьте смесь коллагеназы/гиалуронидазы до конечной концентрации 300 Ед/мл коллагеназы и 100 Ед/мл гиалуронидазы и поместите трубку горизонтально в орбитальный инкубирующий шейкер 37 °C в течение 30 мин при 200 об/мин.
   5. После переваривания тканей добавьте в пробирку равный объем (5 мл) 10% FBS, очищенной от древесного угля в DPBS, и центрифугируйте пробирку при 200 х г в течение 5 мин.
   6. Удалите и выбросьте супернатант. Добавьте 2 мл заменителя трипсина в ячейку гранулы и хорошо перемешайте. Поместите трубку в клеточный инкубатор при 37 °C и 5% CO₂ в течение 4 мин.
   7. После инкубации пипетка вверх и вниз 10x со стандартным наконечником P1000. Добавьте 5 мл 10% FBS, очищенного от древесного угля, в DPBS.
   8. Процедите диссоциированные клетки через 100 мкм стерильного клеточного ситечка. Соберите клеточную суспензию и центрифугу по 200 х г в течение 5 мин.
3. Подсчет и повторное использование ячеек
   1. Удалите и выбросьте супернатант. Повторно суспендировать клеточную гранулу 1 мл СКК.
   2. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра и только пластины 0,5 х 10⁶ клеток в лунку из 24-луночной пластины с 0,5 мл свежего СКК. В это время вынимают матричные экстракты клеток саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (см. Таблицу материалов) из хранения -20 °C и оттаивают на льду. Предварительно нагрейте 6-луночную пластину в клеточном инкубаторе с температурой 37 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Остальные клетки могут быть центрифугированы и заморожены в виде клеточных гранул для контроля невирусной трансдукции.

3. Аденовирусная трансдукция и гальванические органоиды

ВНИМАНИЕ: Пожалуйста, будьте осторожны при обработке аденовируса. Лабораторный персонал должен соблюдать практику биобезопасности уровня 2 и дезинфицировать аденовирус 10% отбеливателем.

1. Добавьте 2 мкл аденовируса (Ad5CMVCre; 1 x 10⁷ PFU/μL) в 24-луночную пластину. Хорошо перемешать с диссоциированными уротелиальными клетками.
2. Для повышения эффективности трансдукции выполняют спинокуляцию путем центрифугирования 24-луночной пластины при 300 х г в течение 30 мин при комнатной температуре. Поместите 24-луночную пластину в клеточный инкубатор при 37 °C и 5% CO₂ в течение 1 ч.
3. Перенесите ячейки и среду из скважины в трубку 15 мл и центрифугу при 200 х г в течение 5 мин. Удалите и выбросьте супернатант, добавьте 50 мкл CCM и хорошо перемешайте с клетками внизу.
4. Добавьте 140 мкл экстракта матрицы и аккуратно перемешайте, чтобы избежать пузырьков воздуха. Быстро добавьте раствор в предварительно нагретую 6-луночную пластину со скоростью 50 мкл/купол, чтобы создать купола для органоидов.
5. Аккуратно переложите пластину в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO₂ и дайте куполам затвердеть в течение 5 минут. Переверните 6-луночную пластину вверх дном и продолжайте затвердевание в течение дополнительных 25 минут.
6. После инкубации добавьте 2,5 мл CCM в каждую лунку и поместите пластину в инкубатор для органоидной культуры.

4. Культивирование и пассаж органоидов

1. Меняйте среду каждые 3-4 дня. Выполняйте культивирование органоидов, пассирование и замораживание, как сообщалось в Lee et ^al.9. Выполняют встраивание органоидов с помощью геля для обработки образцов, как описано в Fujii et ^al.10.
2. Удалите среду и добавьте 1 мл диспазы в каждую лунку. Аккуратно разбейте купол и хорошо перемешайте с наконечником пипетки P1000.
3. Поместите пластину в инкубатор с температурой 37 °C с 5% CO₂ в течение 30 мин. Затем соберите все клетки в центрифужную трубку объемом 15 мл и промыть скважину 4 мл 10% FBS, очищенного от древесного угля, в DPBS. Если органоидные клетки выглядят как большие кластеры, выполните шаг 2.2.6. и этап 2.2.7. чтобы получить диссоциированные клетки.
4. Центрифугируйте трубку при 200 х г в течение 5 мин. Удалите супернатант и промыть клетки 1 мл СКК.
5. Повторно суспендируйте клетки в 70% матричном экстракте и выполните шаги 3.4.-3.6. для культивирования. Альтернативно, криоконсервировать клетки путем повторного использования в 90% FBS, очищенном от древесного угля, и 10% DMSO, дополненном 10 мкМ свежего Y-27632.

5. Имплантация органоидных клеток в подкожную мышь C57BL/6J

1. Подготовка к имплантации
   1. Приготовьте 25 г 1,5 в иглах, шприц 1 мл, диспазу 1 мг/мл, экстракт матрицы, 10% FBS, очищенный от древесного угля, в DPBS с 10 мкМ свежего Y-27632 и 15 мл центрифужной трубки.
2. Коллекция органоидных клеток
   1. После достижения стабильной культуры в течение не менее 5 проходов, соберите расширенные органоидные клетки для инъекции in vivo . Выполните шаги 4.2.-4.4. и повторное суспендирование клеток в 1 мл СКК.
3. Подсчет клеток и подкожные инъекции
   1. Подсчитайте количество клеток с помощью гемоцитометра. После центрифугирования при 200 х г в течение 5 мин повторно суспендируют 2 х 10⁶ клеток в 100 мкл 50% матричного экстракта в DPBS. Поместите суспензию на лед и отнесите ее в кабинет биобезопасности в процедурном кабинете для животных.
   2. Обезболить двух самцов мышей C57BL/6J (10 недель) 4% изофлурана и 1 л/мин O₂ течь в течение примерно 4 мин в камере. После того, как мыши потеряли свой правый рефлекс и их дыхание стало глубже и медленнее, переведите мышей в недыхающую цепь с 2% изофлурана и потоком 1 л / мин O₂ . Нанесите ветеринарную мазь для защиты глаз животных от травматического повреждения.
   3. Побрейте одну область вокруг места инъекции на правом фланге мыши и используйте 70% этанола для очищения, а затем используйте иглу 25 г для непосредственного введения 100-мкл клеточной суспензии в правый бок под анестезией.
   4. После инъекции снимите ингаляционную анестезию и поместите мышей в клетку под тепловую лампу до полного восстановления и мобилизации. Верните мышей для размещения и контролируйте образование опухоли.

6. Сбор опухолей и размножение in vivo

1. Следуйте подготовительному этапу 2.1.1. Усыпляйте мышей асфиксией_CO2 с использованием скорости потока 2,0 л / мин с последующим вывихом шейки матки после образования опухоли диаметром ~ 2,0 см (почти 2-3 недели). Переместите мышей в чистую область рассечения, распылите 70% этанола на область опухоли флакона мыши и используйте стерильные ножницы для рассечения и щипцы, чтобы сделать разрез для отделения опухоли.
2. Вымойте опухоль в 60-миллиметровой посуде с 5 мл DPBS и используйте ножницы для удаления соединительной ткани. Вырежьте один кусочек свежей опухоли и утопите его 4% параформальдегидом в DPBS на 48 ч и отправьте на встраивание парафина и секционирование для гистологического анализа.
3. Обработайте другую половину свежей опухоли для диссоциации клеток. Вкратце измельчите свежую опухоль на 1 мм³ кусочка для диссоциации в 60-миллиметровой посуде с 5 мл CCM(-). Затем, выполнив шаги 2.2.4.-2.2.8., вводите диссоциированные клетки новым мышам C57BL/6J для прохождения in vivo после шага 5.3. или хранить в качестве органоидной культуры in vitro после этапов 3.4.-3.6., или заморозить непосредственно в жидком азоте с использованием 90% очищенного древесного угля FBS и 10% DMSO с 10 мкМ свежего Y-27632.
4. При необходимости восстановите замороженные клетки, быстро разморозив их на водяной бане с температурой 37 °C и промыв с помощью CCM(-). После этого повторно суспендируют их в 100 мкл 50% матричного экстракта в DPBS для прямой инъекции мышам для образования опухоли in vivo . Используйте не менее 2 х 10⁶ размороженных клеток для одной инъекции in vivo .

Результаты

Рабочий процесс опосредованных аденовирусом кре делеций генов в уротелиальных клетках мышей показан на рисунке 1А. Сопроводительное видео демонстрирует, как уротелиальные клетки диссоциируются с глазным дном мочевого пузыря и как тройные флоксированные клетки транс?...

Обсуждение

GEMM были золотыми стандартами для моделирования рака, инициированного из нормальных клеток, что позволяет тщательно тестировать последствия потенциальных онкогенных возмущений (активация онкогенов и / или потеря супрессоров опухоли). Здесь предоставляется быстрый и эффективный прото...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
100 μm sterile cell strainer	Corning	431752
1 mL syringe	BD	309659
25G 1.5 inches needle	EXELINT International	26406
Adenovirus (Ad5CMVCre High Titer, 1E11 pfu/ml)	UI Viral Vector Core	VVC-U of Iowa-5-HT
C57 BL/6J	Jackson Lab	000664
Charcoal-stripped FBS	Gibco	A3382101
Collagenase/hyaluronidase	Stemcell Technologies	07912
Dispase	Stemcell Technologies	07913
DPBS, 1x	Corning	21-031-CV
L-glutamine substitute (GlutaMAX)	Gibco	35-050-061
Mammary Epithelial Cell Growth medium	Lonza	CC-3150
Matrix extracts from Engelbreth–Holm–Swarm mouse sarcomas (Matrigel)	Corning	CB-40234
Monoclonal mouse anti-CK20	DAKO	M7019	IF 1:100
Monoclonal mouse anti-CK7	Santa Cruz Biotechnology	SC-23876	IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-p63	Abcam	ab735	IHC 1:100, IF 1:50
Monoclonal mouse anti-Upk3	Fitzgerald	10R-U103A	IHC 1:50
Monoclonal mouse anti-Vimentin	Santa Cruz Biotechnology	SC-6260	IF 1:100
Monoclonal rat anti-CK8	Developmental Studies Hybridoma Bank	TROMA-I-s	IF 1:100
HERAcell vios 160i CO2 incubator	Thermo Fisher	51033557
Polyclonal chicken anti-CK5	Biolegend	905901	IF 1:500
Primocin	InvivoGen	ant-pm-1
Recombinant enzyme of trypsin substitute (TrypLE Express Enzyme)	Thermo Fisher	12605036
Signature benchtop shaking incubator Model 1575	VWR	35962-091
Specimen Processing Gel (HistoGel)	Thermo Fisher	HG-4000-012
Surgical blade size 10	Integra Miltex	4-110
Sorvall Legend RT	Thermo Fisher	75004377
Sorvall T1 centrifuge	Thermo Fisher	75002383
Y-27632	Selleckchem	S1049