JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В этой работе описывается протокол для генетического скрининга мультикопийного супрессора в Schizosaccharomyces pombe. Этот экран использует библиотеку плазмид для всего генома для идентификации клонов-супрессоров фенотипа потери функции, связанного с мутантным штаммом запроса. Новые генетические супрессоры нулевого мутанта ell1 были идентифицированы с помощью этого экрана.

Аннотация

Идентификация генетических взаимодействий является мощным инструментом для расшифровки функций гена (генов), предоставляя представление об их функциональных отношениях с другими генами и организации биологических путей и процессов. Хотя большинство генетических скринингов были первоначально разработаны в Saccharomyces cerevisiae, дополнительная платформа для проведения этих генетических скринингов была предоставлена Schizosaccharomyces pombe. Одним из распространенных подходов, используемых для идентификации генетических взаимодействий, является чрезмерная экспрессия клонов из общегеномной библиотеки плазмид с высоким числом копий в мутанте с потерей функции с последующим отбором клонов, которые подавляют фенотип мутанта.

В этой статье описывается протокол для проведения этого генетического скрининга на основе «подавления мультикопии» у S. pombe. Этот скрининг помог идентифицировать мультикопийный супрессор (ы) генотоксического стресс-чувствительного фенотипа, связанного с отсутствием фактора удлинения транскрипции Ell1 у S. pombe. Экран был инициирован преобразованием нулевого мутантного штамма запроса ell1 с библиотекой плазмид s. pombe cDNA с высоким числом копий и выбором супрессоров на пластинах EMM2, содержащих 4-нитрохинолин 1-оксид (4-NQO), генотоксическое стресс-индуцирующее соединение. Впоследствии плазмиду выделяли из двух колоний-супрессоров и переваривали ферментами рестрикции для высвобождения вставленной ДНК. Плазмиды, высвобождающие вставной фрагмент ДНК, были ретрансформированы в штамм делеции ell1 , чтобы подтвердить способность этих клонов плазмиды-супрессора восстанавливать рост мутанта делеции ell1 в присутствии 4-NQO и других генотоксических соединений. Те плазмиды, которые показали спасение фенотипа делеции, были секвенированы для идентификации гена (генов), ответственного за подавление генотоксического стресс-чувствительного фенотипа, связанного с делецией ell1 .

Введение

Сети генетических взаимодействий предоставляют функциональную информацию о генах и очерчивают пути и биологические процессы, в которых эти гены могут быть вовлечены in vivo. Кроме того, они также могут дать представление о том, как различные гены взаимодействуют друг с другом, что приводит к определенному фенотипу 1,2,3. На протяжении многих лет исследователи разрабатывали различные генетические скрининги, чтобы ответить на фундаментальные биологические вопросы и изучить болезни человека. Скрининги для идентификации генетических взаимодействий могут быть выполнены несколькими способами. Генетические взаимодействия, идентифицированные в различных генетических скринингах, могут представлять собой различные механистические отношения между генами. Кроме того, исследования показали, что общий набор генетических взаимодействий разделяют гены, которые кодируют белки, принадлежащие к одному и тому же пути или комплексу 4,5. Таким образом, сети генетического взаимодействия могут быть использованы для установления функциональной организации в клетке, в которой гены, разделяющие наиболее похожие профили, принадлежат к одному и тому же комплексу или пути, эти гены, имеющие несколько менее похожие профили, принадлежат к одному и тому же биологическому процессу, а те гены, которые демонстрируют перекрывающиеся, но более разнообразные профили, отражают членов, принадлежащих к одному и тому же клеточному компартменту6.

Скрининги генетического взаимодействия, основанные на подавлении дозы («подавление высокой копии или мультикопии»), являются одним из широко используемых подходов. Эти экраны могут быть выполнены путем преобразования мутантного штамма запроса с помощью геномной библиотеки или библиотеки кДНК с высоким числом копий, за которой следуют подходящие анализы / методы отбора для выявления подавляющих или усиливающих генетических взаимодействий 7,8,9. Чтобы обеспечить всесторонний охват всего генома, эти скрининги также проводились путем сверхэкспрессии конкретного гена, представляющего интерес, в коллекции мутанта потери функции по всему геному или путем чрезмерной экспрессии геномной библиотеки с высоким числом копий плазмид или кДНК в мутанте запроса на потерю функции 9,10,11,12,13,14,15 . Стратегия мультикопии может также работать с использованием подхода доминанты/сверхвыражения с использованием регулируемого промотора.

Основные преимущества использования скринингов на основе супрессоров заключаются в том, что подавление ранее существовавшего фенотипа в мутантном штамме другим геном устанавливает генетическую связь между этими двумя генными продуктами, которая, возможно, не была продемонстрирована с использованием других подходов. Во-вторых, было замечено, что наличие ранее существовавшей мутации сенсибилизирует определенный путь, позволяя идентифицировать дополнительные компоненты этого пути путем выделения супрессоров, которые, возможно, не были идентифицированы более прямым генетическим отбором. Более того, этот экран может быть использован для идентификации подавителей, которые имеют различные механизмы подавления16. Супрессорные взаимодействия обычно происходят между генами, которые функционально связаны и могут быть использованы для выяснения иерархий в путях. Точный основной механизм подавления может отличаться в зависимости от нескольких факторов, включая тип мутанта запроса, используемого на экране, экспериментальные условия и уровень экспрессии генов. Один из распространенных механизмов подавления дозы включает гены, кодирующие продукты, которые функционируют вместе в одном комплексе или параллельно в одном и том же клеточном / биологическом процессе. Результаты таких скринингов в более простых модельных организмах, таких как дрожжи, могут быть распространены на высшие эукариотические организмы, поскольку большинство фундаментальных биологических путей и процессов сохраняются на протяжении всей эволюции.

Эти генетические экраны также могут быть модифицированы несколькими способами, чтобы ответить на различные биологические вопросы. Например, могут быть идентифицированы ортологичные гены разных организмов, которые могут подавлять фенотип мутантного штамма. Он также был использован для определения потенциальных механизмов резистентности и определения белковых мишеней новых антибактериальныхсоединений 17,18, противогрибковых19,20, противопаразитарных21 и противоопухолевыхсоединений 22. Этот экран также был использован для выявления супрессоров активности фармацевтических препаратов, механизм действия которых неизвестен. Таким образом, в принципе, эти мультикопийные супрессорные экраны могут быть оптимизированы и использованы в различных приложениях в различных организмах. Хотя большинство генетических скринингов, используемых исследователями дрожжей, были первоначально разработаны в S. cerevisiae, S. pombe появился как дополнительная модельная система для проведения различных генетических скринингов и анализов23. Кроме того, геномная организация и биологические процессы у S. pombe, такие как встречаемость интронов в большем количестве генов, сложность происхождения репликации ДНК, структура центромеры, организация клеточного цикла и наличие механизма RNAi, показывают большее сходство между S. pombe и высшими эукариотами23,24, подчеркивая важность разработки и использования генетических инструментов в S. pombe.

В этой статье описывается протокол идентификации генетических интеракторов на основе «подавления дозы» мутантного фенотипа с потерей функции у S. pombe. Основой этого протокола является то, что это быстрый и эффективный метод скрининга библиотеки кДНК, чрезмерно экспрессирующей гены дикого типа либо на мультикопийной плазмиде, либо на сильном промоторе. Этот протокол состоит из четырех основных этапов: преобразование библиотеки в мутантный штамм запроса, выбор плазмидных клонов, которые подавляют желаемый фенотип мутантного штамма запроса, извлечение плазмиды (плазмид) из этих клонов-супрессоров и идентификация гена, ответственного за подавление фенотипа. Как и для любого метода, основанного на выборе и идентификации cDNAs из библиотеки, успех экрана зависит от использования высококачественной и сложной библиотеки, поскольку экран может извлекать только те клоны кДНК, которые присутствуют в библиотеке.

Используя этот протокол, мы успешно идентифицировали два новых супрессора генотоксического стресс-чувствительного фенотипа запроса S. pombe ell1 нулевого мутанта. Семейство факторов удлинения транскрипции ELL (Eleven Nineteen Lysine Rich Leukemia) подавляет преходящую паузу РНК-полимеразы II на шаблонах ДНК в биохимических анализах in vitro и сохраняется в различных организмах, от дрожжей деления до людей25. Более ранняя работа предоставила доказательства того, что нулевой мутант S. pombe ell1 демонстрирует генотоксическую стрессовую чувствительность в присутствии 4-нитрохинолина 1-оксида (4-NQO) и метилметансульфоната (MMS)26. Поэтому мы преобразовали мультикопийную библиотеку кДНК, кодируемую плазмидой S. pombe , в нулевой мутант S. pombe ell1 и идентифицировали два предполагаемых клона, которые продемонстрировали способность подавлять генотоксическую стрессовую чувствительность нулевого мутанта S. pombe ell1 в присутствии 4-NQO, соединения, которое индуцирует поражения ДНК. Последующее секвенирование вставки, присутствующей в плазмидных клонах, показало, что гены, кодирующие rax2+ и osh6+, были ответственны за подавление генотоксической стрессовой чувствительности нулевого мутанта ell1 при сверхэкспрессии в нулевом мутанте ell1.

протокол

1. Преобразование библиотеки кДНК в запрос S. pombe мутантного штамма для скрининга мультикопийных супрессоров

ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартный литий-ацетатный метод27 использовался для преобразования библиотеки s. pombe cDNA в запрос S. pombe ell1Δ штамм с несколькими модификациями:

  1. Вырастите штамм S. pombe ell1Δ при 32 °C на ye-среде (таблица 1), дополненной 225 мкг/мл аденина, лейцина и урацила. Инокулируют петлю, полную инокулята штамма ell1Δ из вышеуказанной пластины в 15-20 мл YE-среды, дополненной 225 мкг/мл аденина, лейцина и урацила. Высиживать его в течение ночи при 32 °C с встряхиванием (200-250 об/мин).
  2. На следующий день разводят культуру на ночь в 100 мл свежей среды YE с желаемыми добавками до OD600 нм (оптическая плотность при 600 нм) 0,3 и инкубируют ее при 32 °C с встряхиванием при 200-250 об/мин до тех пор, пока OD600 нм не достигнет средней фазы log.
  3. Разделите культуру 100 мл на две 50 мл центрифужные трубки с последующим центрифугированием при комнатной температуре в течение 10 мин при 4000 × г.
  4. Откажитесь от надосадочного вещества и промыть ячейку гранулы 1 мл стерильной воды, т.е. повторно суспендировать клетки в 1 мл стерильной воды и центрифугу при 4000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре.
  5. Откажитесь от надосадочного вещества и промыть каждую ячейку гранулы 1 мл 1x LiAc-TE (100 мМ ацетата лития, 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5), как описано на этапе 1.4.
  6. Удалите супернатант и повторно суспендируйте каждую ячейку гранулы в 250 мкл 1x LiAc-TE. Используйте эти S . pombe компетентные клетки (500 мкл) для трансформации с интересующей ДНК. Переведите 125 мкл компетентных клеток в четыре различные стерильные микроцентрифужные трубки для последующих стадий трансформации.
  7. Отварите ДНК носителя из яичек лосося или спермы сельди в течение 1 мин и сразу же поместите на лед. Для каждой трансформации добавляйте 10 мкл 10 мг/мл денатурированной одноцепочечной НЕСУЩЕЙ ДНК в микроцентрифужную трубку, содержащую 125 мкл компетентных клеток, с последующим мягким перемешиванием с использованием наконечника микропипетки. Впоследствии добавьте 50 мкг библиотеки кДНК S. pombe в компетентную клетку-носительную смесь ДНК-содержащую микроцентрифужную трубку.
  8. Инкубируют микроцентрифужные трубки при комнатной температуре в течение 10 мин, а затем добавляют в трубки 260 мкл раствора полиэтиленгликоля-ацетата лития (40% [мас./об.] ПЭГ 4000, 100 мМ ацетата лития, 10 мМ Tris-HCl, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5) и аккуратно перемешивают с помощью наконечника микропипетки.
  9. Инкубировать микроцентрифужные трубки, содержащие трансформационную смесь при 32 °С, в течение 2 ч без встряхивания. Добавьте 43 мкл предварительно расплавленного диметилсульфоксида (ДМСО) в микроцентрифужную трубку и аккуратно перемешайте. Впоследствии подвергайте трубки тепловому удару при 42 °C в течение 5 мин.
  10. Гранулируют ячейки по 4000 × г в течение 5 мин при комнатной температуре. Выбросьте супернатант и удалите остаточный раствор PEG-LiAc-TE с помощью наконечника микропипетки.
  11. Повторно суспендируют клетки в 100 мкл стерильной воды и пластине на одной пластине EMM2 (таблица 1) (150 мм) с необходимыми добавками и 0,2 мкг/мл 4-NQO.
  12. Инкубируйте пластины при 32 °C в течение 5-6 дней, чтобы на пластинах появились колонии. Проведите полученные колонии на той же средней пластине в присутствии 0,2 мкг/мл 4-NQO и используйте для дальнейшего скрининга.
  13. Для одного эксперимента по преобразованию библиотеки используйте 500 мкл компетентных клеток (125 мкл компетентных ячеек x 4 микроцентрифужных трубки) для преобразования, как описано на этапах 1.8-1.14 выше.
  14. В качестве контрольной пластины 1/10-й трансформационной смеси на одной пластине EMM2 (150 мм) с необходимыми добавками, но не имеющей 4-NQO, вычисляют общее количество клонов библиотеки, полученных после преобразования библиотеки, и экран для выделения клонов-супрессоров.

2. Протестируйте и подтвердите спасение/подавление фенотипа, связанного с мутантным штаммом запроса предполагаемым супрессором

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы точечного напряжения проводились, как описано ниже, для проверки и проверки спасения/подавления ell1-ассоциированной с делецией чувствительности к стрессу 4-NQO предполагаемым супрессором (супрессорами).

  1. Добавьте 100-200 мкл стерильной воды в каждую из различных скважин стерильной 96-луночной микротитровой пластины.
  2. Выберите небольшое количество инокулята из каждой из различных колоний, полученных после преобразования библиотеки кДНК на пластине, содержащей 4-NQO, с помощью стерильной зубочистки или наконечника микропипетки объемом 20-200 мкл. Добавьте инокулят из каждой из различных колоний в отдельные независимые лунки микротитровой пластины, содержащие 100-200 мкл стерильной воды. Тщательно перемешать.
  3. Поместите 3 мкл клеточной суспензии из каждой скважины на агаровые пластины EMM2, содержащие аденин (225 мкг/мл) и урацил (225 мкг/мл), но лишенные лейцина (выбираемый ауксотрофный маркер, присутствующий на плазмидном векторе, используемом для построения библиотеки, используемой в этой работе). Добавьте соответствующие концентрации 4-NQO к пластинам по мере необходимости.
  4. Инкубируйте пластины при 32 °C в течение 3-4 дней, чтобы клетки росли. Определите колонии, которые показывают рост в присутствии различных концентраций 4-NQO в качестве предполагаемых супрессоров.
  5. Для дальнейшей проверки супрессоров выращивают выбранные супрессоры вместе с соответствующими контрольными штаммами в течение ночи при 32 °C с встряхиванием (200-250 об/мин) в среде EMM2, содержащей по 225 мкг/мл аденина и урацила, но лишенной лейцина.
  6. На следующий день разводят клетки до OD600 нм 0,3 в свежей среде EMM2 и выращивают их при 32 °C с встряхиванием до середины фазы (приблизительно OD600 нм 0,6-0,8).
  7. Выявляйте соответствующие последовательные разведения (1:10 или 1:5) культур на пластинах EMM2 с необходимыми добавками, содержащими либо 0,4 мкМ 4-NQO, либо 0,01% MMS. Для контроля определите штаммы на пластине EMM2 с необходимыми добавками, но без какого-либо агента, повреждающего ДНК.
  8. Инкубируйте пластины при 32 °C в течение 3-5 дней для мониторинга роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подходящие анализы, основанные на фенотипе, связанном с мутантным штаммом запроса, должны использоваться для проверки спасения или подавления фенотипа. Например, если необходимо идентифицировать супрессоры холодочувствительного фенотипа мутантного штамма запроса, анализ для тестирования и валидации клонов супрессора будет включать выращивание трансформантов при низкой температуре.
  9. Обнаружите мутантные штаммы, преобразованные полноразмерным геном интереса (в данном случае Spell1 ) или пустым вектором в качестве положительного и отрицательного элементов управления, соответственно, вместе с библиотекой трансформантов.

3. Выделение плазмиды из клонов супрессора S. pombe

ПРИМЕЧАНИЕ: Выделение плазмид из S. pombe осуществляли по протоколу, описанному в делении дрожжей: лабораторное руководство28 с несколькими модификациями.

  1. Инокулируют одну колонию дрожжей в среде EMM2, содержащей 225 мкг/мл аденина и урацила, и выращивают клетки в течение ночи при 32 °C с встряхиванием при 200-250 об/мин. На следующий день собирают 5 O.D. клеток (т.е. 10 мл культуры O.D. 0.5) путем центрифугирования в течение 2 мин при 4000 × г при комнатной температуре.
  2. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 0,2 мл лизисного буфера (2% Triton X-100, 1% SDS, 100 мМ NaCl, 10 мМ Tris HCl (рН 8,0) и 1 мМ Na2ЭДТА).
  3. Добавьте 0,2 мл фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1) и 0,3 г промытых кислотой стеклянных шариков в микроцентрифужную трубку. Вращайте трубку микроцентрифуги в течение 2 мин при 4 °C и насиживайте на льду в течение 1 мин. Повторите этот шаг 6x.
  4. Центрифугируйте пробирку при 10 000 × г в течение 15 мин при комнатной температуре. Переложите верхний водный слой в свежую микроцентрифужную трубку и добавьте 200 мкл фенола:хлороформа:изоамилового спирта (25:24:1).
  5. Центрифугируйте пробирку при 10 000 × г в течение 10 мин. Переложите верхний водный слой в свежую трубку и добавьте в трубку два объема 100% этанола (~400 мкл) и 1/10 объема ацетата натрия (3 М, рН 5,8) (~20 мкл). Инкубировать микроцентрифужную трубку -70 °C в течение 1 ч.
  6. Осаждение ДНК центрифугированием при 10 000 × г в течение 15 мин при 4 °C и удаление супернатанта. Вымойте гранулу ДНК 70% этанолом (~500 мкл) и держите ее при комнатной температуре до высыхания на воздухе.
  7. Повторное суспендирование ДНК в 20 мкл стерильной воды. Используйте 2-5 мкл плазмидной ДНК для трансформации компетентных клеток кишечной палочки .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида также может быть выделена из дрожжевых клеток с использованием любого из коммерчески доступных наборов для выделения плазмиды дрожжей.

4. Идентификация гена, закодированного клоном-супрессором

  1. Трансформируют изолированные плазмиды дрожжей в штамм E. coli Top10 [F-mcrA (mrr-hsdRMS-mcrBC) 80LacZM15 lacX74 recA1 ara139 (ara-leu)7697 galUgalKrpsL (StrR) endA1 nupG] с использованием стандартного протокола29 и распределяют клетки на пластины LB (Luria Broth) с необходимыми антибиотиками.
  2. Выделяют плазмиду (плазмиды) из трансформантов E. coli с использованием стандартного протоколащелочного лизиса 29 и следуют соответствующим комбинациям ферментов рестрикции для проверки высвобождения вставленного фрагмента ДНК путем рестрикционного пищеварения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Супрессорная плазмида 84 переваривалась ферментом рестрикции BamHI, а плазмида-супрессор 104 переваривалась ферментами рестрикции PstI/BamHI.
  3. Ретрансформировать плазмиды, показывающие высвобождение вставки после рестрикции пищеварения в штамме ell1Δ, чтобы проверить их способность спасать генотоксический стресс-чувствительный фенотип штамма ell1Δ.
  4. Выберите плазмидные клоны, показывающие подавление генотоксической чувствительности к стрессу, и секвенируйте вставленный фрагмент ДНК, присутствующий в этих плазмидных клонах, используя векторно-специфические прямые и обратные праймеры.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В данном исследовании использовалась универсальная передняя грунтовка для промотора adh1 (5'CATTGGTCCCCCGCTCCG 3')30.
  5. Чтобы идентифицировать ген, ответственный за подавление, выровняйте последовательность, полученную с помощью нуклеотидного бласта NCBI (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastn&BLAST_SPEC=GeoBlast&PAGE_TYPE=BlastSearch) или инструмента выравнивания последовательности Pombase (https://fungi.ensembl.org/Schizosaccharomyces_pombe/Tools/Blast?db=core). Выберите последовательность, показывающую максимальное выравнивание, и определите ее как ген плазмиды мультикопийного супрессора.

Результаты

Скрининг мультикопийного супрессора (подавителей) генотоксической стресс-ассоциированной чувствительности к ell1 у S. pombe
Мы провели генетический скрининг с использованием протокола, описанного выше, для идентификации мультикопийных суп...

Обсуждение

Дрожжи широко используются для исследования основных биологических процессов и путей, которые эволюционно сохраняются в эукариотических организмах. Наличие генетических и геномных инструментов наряду с их пригодностью к различным биохимическим, генетическим и молекулярным процеду...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа финансировалась за счет исследовательского гранта Департамента биотехнологии правительства Индии (грант No. BT/PR12568/BRB/10/1369/2015) — Нимише Шарме. Авторы благодарят профессора Чарльза Хоффмана (Бостонский колледж, США) за дар библиотеки кДНК S. pombe и профессора Сьюзан Форсбург за дрожжевые плазмиды.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
4-NQOSigmaN8141
Acetic Acid, glacialSigma1371301000
Adenine SulphateHimediaGRM033
AgarHimediaGRM026
AgaroseLonza50004L
Ammonium ChlorideHimediaMB054
BamHIFermentasER0051
BiotinHimediaRM095
Boric AcidHimediaMB007
Calcium Chloride SigmaC4901
Chloroform:Isoamyl alcohol 24:1SigmaC0549
Citric AcidHimediaRM1023
Disodium hydrogen phospahte anhydrousHimediaGRM3960
single stranded DNA from Salmon testesSigmaD7656
EDTA disodiumSigma324503
Ferric Chloride HexahydrateHimediaRM6353
GlucoseAmresco188
IonositolHimediaGRM102
IsopropanolQualigenQ26897
LeucineHimediaGRM054
Lithium AcetataeSigma517992
Magnesium Chloride HexahydrateHimediaMB040
Molybdic AcidHimediaRM690
Nicotinic AcidHimediaCMS177
PEG, MW 4000Sigma81240
Pentothinic AcidHimediaTC159
PhenolHimediaMB082
Plasmid Extraction KitQiagen27104
Potassium ChlorideSigmaP9541
Potassium hydrogen PthallateMercDDD7D670815
Potassium iodideHimediaRM1086
RNAseFermentasEN0531
SDSHimediaGRM205
Sodium HydroxideHimediaGRM1183
Sodium SulphateHimediaRM1037
Tris free BaseHimediaMB209
UracilHimediaGRM264
Yeast Extract PowderHimediaRM668
Zinc Sulphate HeptahydrateMercDJ9D692580

Ссылки

  1. Zuk, O., Hechter, E., Sunyaev, S. R., Lander, E. S. The mystery of missing heritability: Genetic interactions create phantom heritability. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (4), 1193-1198 (2012).
  2. Bloom, J. S., Ehrenreich, I. M., Loo, W. T., Lite, T. -. L. V., Kruglyak, L. Finding the sources of missing heritability in a yeast cross. Nature. 494 (7436), 234-237 (2013).
  3. Bloom, J. S., et al. Genetic interactions contribute less than additive effects to quantitative trait variation in yeast. Nature Communications. 6 (1), 8712 (2015).
  4. Tong, A. H. Y., et al. Global mapping of the yeast genetic interaction network. Science. 303 (5659), 808-813 (2004).
  5. Costanzo, M., et al. The genetic landscape of a cell. Science. 327 (5964), 425-431 (2010).
  6. Costanzo, M., et al. A global genetic interaction network maps a wiring diagram of cellular function. Science. 353 (6306), (2016).
  7. Mullen, J. R., Kaliraman, V., Ibrahim, S. S., Brill, S. J. Requirement for three novel protein complexes in the absence of the Sgs1 DNA helicase in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 157 (1), 103-118 (2001).
  8. Kaplan, Y., Kupiec, M. A role for the yeast cell cycle/splicing factor Cdc40 in the G1/S transition. Current Genetics. 51 (2), 123-140 (2007).
  9. Carlsson, M., Hu, G. -. Z., Ronne, H. Gene dosage effects in yeast support broader roles for the LOG1, HAM1 and DUT1 genes in detoxification of nucleotide analogues. PLOS One. 13 (5), 0196840 (2018).
  10. Sopko, R., et al. Mapping pathways and phenotypes by systematic gene overexpression. Molecular Cell. 21 (3), 319-330 (2006).
  11. Duffy, S., et al. Overexpression screens identify conserved dosage chromosome instability genes in yeast and human cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (36), 9967-9976 (2016).
  12. Appling, D. R. Genetic approaches to the study of protein-protein interactions. Methods (San Diego, Calif). 19 (2), 338-349 (1999).
  13. Forsburg, S. L. The art and design of genetic screens: yeast. Nature Reviews. Genetics. 2 (9), 659-668 (2001).
  14. Kitazono, A. A., Tobe, B. T. D., Kalton, H., Diamant, N., Kron, S. J. Marker-fusion PCR for one-step mutagenesis of essential genes in yeast. Yeast (Chichester, England). 19 (2), 141-149 (2002).
  15. Boone, C., Bussey, H., Andrews, B. J. Exploring genetic interactions and networks with yeast. Nature Reviews. Genetics. 8 (6), 437-449 (2007).
  16. Prelich, G. Suppression mechanisms: themes from variations. Trends in Genetics. 15 (7), 261-266 (1999).
  17. Li, X., et al. Multicopy suppressors for novel antibacterial compounds reveal targets and drug efflux susceptibility. Chemistry & Biology. 11 (10), 1423-1430 (2004).
  18. Apfel, C. M., et al. Peptide deformylase as an antibacterial drug target: Target validation and resistance development. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 45 (4), 1058-1064 (2001).
  19. Tsukahara, K., et al. Medicinal genetics approach towards identifying the molecular target of a novel inhibitor of fungal cell wall assembly. Molecular Microbiology. 48 (4), 1029-1042 (2003).
  20. Calabrese, D., Bille, J., Sanglard, D. A novel multidrug efflux transporter gene of the major facilitator superfamily from Candida albicans (FLU1) conferring resistance to fluconazole. Microbiology. 146 (11), 2743-2754 (2000).
  21. Cotrim, P. C., Garrity, L. K., Beverley, S. M. Isolation of genes mediating resistance to inhibitors of nucleoside and ergosterol metabolism in leishmania by overexpression/selection. Journal of Biological Chemistry. 274 (53), 37723-37730 (1999).
  22. Nodake, Y., Yamasaki, N. Some properties of a macromolecular conjugate of lysozyme prepared by modification with a monomethoxypolyethylene glycol derivative. Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry. 64 (4), 767-774 (2000).
  23. Sunnerhagen, P. Prospects for functional genomics in Schizosaccharomyces pombe. Current Genetics. 42 (2), 73-84 (2002).
  24. Hoffman, C. S., Wood, V., Fantes, P. A. An ancient yeast for young geneticists: A primer on the Schizosaccharomyces pombe model system. Genetics. 201 (2), 403-423 (2015).
  25. Sharma, N. Regulation of RNA polymerase II-mediated transcriptional elongation: Implications in human disease. IUBMB Life. 68 (9), 709-716 (2016).
  26. Sweta, K., Dabas, P., Jain, K., Sharma, N. The amino-terminal domain of ELL transcription elongation factor is essential for ELL function in Schizosaccharomyces pombe. Microbiology. 163 (11), 1641-1653 (2017).
  27. Murray, J. M., Watson, A. T., Carr, A. M. Transformation of Schizosaccharomyces pombe: Lithium acetate/dimethyl sulfoxide procedure. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (4), 090969 (2016).
  28. Hagan, I., Carr, A. M., Grallert, A., Nurse, P. . Fission yeast: a laboratory manual. , (2016).
  29. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation and transformation of competent E. coli using calcium chloride. Cold Spring Harbor Protocols. 2006 (1), 3932 (2006).
  30. Janoo, R. T., Neely, L. A., Braun, B. R., Whitehall, S. K., Hoffman, C. S. Transcriptional regulators of the Schizosaccharomyces pombefbp1 gene include two redundant Tup1p-like corepressors and the CCAAT binding factor activation complex. Genetics. 157 (3), 1205-1215 (2001).
  31. Sambrook, J., Russell, D. W. Preparation of plasmid DNA by alkaline lysis with SDS: Maxipreparation. CSH Protocols. 2006 (1), 4090 (2006).
  32. Choi, E., Lee, K., Song, K. Function of rax2p in the polarized growth of fission yeast. Molecules and Cells. 22 (2), 146-153 (2006).
  33. Eisenreichova, A., Różycki, B., Boura, E., Humpolickova, J. Osh6 revisited: Control of PS transport by the concerted actions of PI4P and Sac1 phosphatase. Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 747601 (2021).
  34. Botstein, D., Chervitz, S. A., Cherry, J. M. Yeast as a model organism. Science. 277 (5330), 1259-1260 (1997).
  35. Forsburg, S. L. The yeasts Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe: models for cell biology research. Gravitational and Space Biology Bulletin: Publication of the American Society for Gravitational and Space Biology. 18 (2), 3-9 (2005).
  36. Botstein, D., Fink, G. R. Yeast: an experimental organism for 21st Century biology. Genetics. 189 (3), 695-704 (2011).
  37. Jones, G. M., et al. A systematic library for comprehensive overexpression screens in Saccharomyces cerevisiae. Nature Methods. 5 (3), 239-241 (2008).
  38. Kitada, K., Johnson, A. L., Johnston, L. H., Sugino, A. A multicopy suppressor gene of the Saccharomyces cerevisiae G1 cell cycle mutant gene dbf4 encodes a protein kinase and is identified as CDC5. Molecular and Cellular Biology. 13 (7), 4445-4457 (1993).
  39. Melnykov, A. V., Elson, E. L. . MCH4 is a multicopy suppressor of glycine toxicity in Saccharomyces cerevisiae. , 653444 (2019).
  40. Kosodo, Y., et al. Multicopy suppressors of the sly1 temperature-sensitive mutation in the ER-Golgi vesicular transport in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 18 (11), 1003-1014 (2001).
  41. Nakamura, T., Takahashi, S., Takagi, H., Shima, J. Multicopy suppression of oxidant-sensitive eos1 mutation by IZH2 in Saccharomyces cerevisiae and the involvement of Eos1 in zinc homeostasis: Eos1 involvement in zinc homeostasis. FEMS Yeast Research. 10 (3), 259-269 (2010).
  42. Hernández-López, M. J., García-Marqués, S., Randez-Gil, F., Prieto, J. A. Multicopy suppression screening of Saccharomyces cerevisiae identifies the ubiquitination machinery as a main target for improving growth at low temperatures. Applied and Environmental Microbiology. 77 (21), 7517-7525 (2011).
  43. Sweta, K., Sharma, N. Functional interaction between ELL transcription elongation factor and Epe1 reveals the role of Epe1 in the regulation of transcription outside heterochromatin. Molecular Microbiology. 116 (1), 80-96 (2021).
  44. Kim, D. -. U., et al. Analysis of a genome-wide set of gene deletions in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe. Nature Biotechnology. 28 (6), 617-623 (2010).
  45. Adames, N. R., Gallegos, J. E., Peccoud, J. Yeast genetic interaction screens in the age of CRISPR/Cas. Current Genetics. 65 (2), 307-327 (2019).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

187Schizosaccharomyces pombeEll1

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены