Одновременная визуализация и обнаружение на основе проточной цитометрии множественных флуоресцентных маркеров старения в терапевтических стареющих раковых клетках, вызванных терапией

Резюме

Здесь мы представляем метод визуализации и количественной оценки множественных маркеров, связанных со старением, в отдельных клетках.

Аннотация

Химиотерапевтические препараты могут вызывать непоправимое повреждение ДНК в раковых клетках, что приводит к апоптозу или преждевременному старению. В отличие от апоптотической гибели клеток, старение является принципиально иным механизмом, сдерживающим размножение раковых клеток. Десятилетия научных исследований выявили сложные патологические эффекты стареющих раковых клеток в опухолях и микросредах, которые модулируют раковые клетки и стромальные клетки. Новые данные свидетельствуют о том, что старение является мощным прогностическим фактором во время лечения рака, и поэтому быстрое и точное обнаружение стареющих клеток в образцах рака имеет важное значение. В данной работе представлен метод визуализации и выявления вызванного терапией старения (ТИ) в раковых клетках. Диффузные крупные В-клеточные линии лимфомы (DLBCL) обрабатывали мафосфамидом (MAF) или даунорубицином (DN) и исследовали на наличие маркера старения, связанного со старением β-галактозидазы (SA-β-gal), маркера синтеза ДНК 5-этинил-2'-дезоксиуридина (EdU) и маркера повреждения ДНК gamma-H2AX (γH2AX). Визуализация проточного цитометра может помочь генерировать одноклеточные изображения с высоким разрешением за короткий период времени для одновременной визуализации и количественной оценки трех маркеров в раковых клетках.

Введение

Различные стимулы могут вызвать клеточное старение, заставляя клетки входить в состояние остановки стабильного клеточного цикла. Эти стимулы включают внутренние сигнальные изменения или внешние стрессы. Внутренние сигналы включают прогрессирующее укорочение теломер, изменения в структуре теломер, эпигенетическую модификацию, нарушения протеостаза, митохондриальную дисфункцию и активацию онкогенов. Внешние стрессы включают воспалительные сигналы и /или повреждения тканей, радиационную или химическую обработку и лишение питания 1,2,3,4. Среди различных типов старения наиболее часто наблюдаемыми и хорошо изученными являются репликативное старение, онкоген-индуцированное старение (OIS), радиационно-индуцированное старение и старение, вызванное терапией (TIS). ОИС является острым клеточным ответом на генотоксическое повреждение, вызванное репликативным стрессом, вызванным активацией аберрантного онкогена, и может в некоторой степени предотвратить патологическое прогрессирование от пренеопластического поражения до полномасштабной опухоли. ТИС возникает, когда опухолевые клетки подвергаются стрессу химиотерапевтическими препаратами или ионизирующим излучением ^5,6.

Старение считается обоюдоострым мечом в патологии из-за его высокодинамичной природы. Первоначально он был описан как полезный опухолеподавляющий механизм для удаления поврежденных клеток из циркулирующего пула делящихся клеток, защищая нормальную функцию органов и ингибируя рост опухоли ^7,8,9. Тем не менее, новые данные свидетельствуют о темной стороне старения. Стареющие клетки секретируют провоспалительные цитокины, известные как секреторный фенотип, ассоциированный со старением (SASP), что приводит к фиброзу и сбоям в работе органов и способствует инициации и прогрессированию опухоли¹⁰. Кроме того, стареющие раковые клетки подвергаются эпигенетическому и экспрессии генов перепрограммированию параллельно с ремоделированием хроматина и активацией устойчивого ответа на повреждение ДНК (DDR)^11,12, вновь приобретая новые свойства раковых стволовых клеток³. Хотя опухоли, способные к старению, лучше реагируют на терапевтическое вмешательство по сравнению с опухолями, неспособными к старению¹³, персистенция стареющих клеток может привести к плохому долгосрочному прогнозу, если они не будут эффективно идентифицированы и устранены сенолитическими препаратами⁵. В любом случае, надежный метод оценки старения представляет значительный клинический интерес не только для прогноза терапевтического лечения, но и для разработки новых стратегий, нацеленных на стареющие клетки.

Независимо от различных триггеров, стареющие клетки проявляют некоторые общие черты, включая увеличенную, уплощенную, многоядерную морфологию с большими вакуолями, значительно расширенные ядра, образование H3K9me3-богатого старением-ассоциированного гетерохроматина (SAHF) в ядре, стойкое накопление очагов маркера повреждения ДНК γH2AX, активированные p53-p21^CIP1 и Rb-p16^INK4a регуляторные механизмы клеточного цикла, стабильная остановка клеточного цикла G1, массивная индукция SASP и повышенная активность β-галактозидазы (SA-β-gal)¹⁴, связанная со старением. Поскольку ни один маркер не является достаточным для определения старения, ферментативное окрашивание для активности SA-β-gal, которое считается золотым стандартом для обнаружения старения, обычно сочетается с иммуногистохимическим окрашиванием для H3K9me3 и Ki67 для обнаружения TIS¹⁵. Тем не менее, химические хромогенные SA-β-gal трудно поддаются количественной оценке. Здесь мы объединили обнаружение флуоресценции 5-додеканоиламинофлуоресцеин-ди-β-D-галактопиранозида (C₁₂FDG) на основе флуоресценции SA-β-gal (fSA-β-gal) с иммунофлуоресцентным окрашиванием для γH2AX и EdU-интегрированной ДНК для идентификации стареющих клеток C₁₂FDG ⁺ EdU-γH2AX ⁺ с использованием передовой системы визуализации проточного цитометра, которая сочетает в себе скорость, чувствительность и подробные одноклеточные изображения с пространственной информацией, которая не может быть предоставлена проточной цитометрией и микроскопией. Этот метод позволяет быстро генерировать изображения с высоким разрешением, позволяющие позиционировать и количественно оценивать флуоресцентные сигналы в ячейках, одновременно лицензируя быстрый анализ нескольких образцов путем создания стандартных трубопроводов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Клеточные линии DLBCL с лечением мафосфамидом или даунорубицином для индуцирования клеточного старения

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол также работает для адгезивных раковых клеток. В зависимости от размера клетки, семена 1-2 × 10⁵ клеток в одну лунку из 6-луночной пластины и инкубируют пластину в инкубаторе 5% CO₂, 37 °C в течение ночи перед обработкой. Этапы протокола такие же, как и для суспензионных ячеек, но с двумя исключениями. Во-первых, клетки должны быть трипсинизированы с пластины после шага 3.4. Во-вторых, этапы промывки выполняются без центрифугирования перед трипсинизацией.

1. Подсчитайте DLBCL клетки и семена 1 × 10⁶ клеток/мл в 4 мл среды на скважину в 6-луночную культуральную пластину. Культивируют клетки DLBCL в среде RPMI-1640, дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (FBS) и 100 ЕД/мл пенициллина/стрептомицина.
2. Добавьте MAF (5 мкг/мл) или DN (20 нг/мл) в культуру клеток и осторожно качайте пластину для смешивания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: MAF и DN нестабильны. После растворения в ДМСО исходный раствор следует аликвотировать и хранить при -20 °С. Следует избегать циклов замораживания/оттаивания.
3. Инкубируют пластину в 5% CO₂, 37 °C инкубаторе в течение 3 дней.
4. После 3-дневной инкубации собирают клетки DLBCL в 15 мл стерильных центрифужных трубок и вращают при 100 × г, 4 °C в течение 5 мин.
5. Выбросьте супернатант, повторно суспендируйте гранулы клеток с 4 мл свежей среды и добавьте суспензии обратно в 6-луночную пластину.
6. Культивируйте клеточную пластину в инкубаторе 5% CO₂, 37 °C еще за 2 дня до сбора урожая для анализа.

2. Подготовьте растворы для окрашивания (таблица 1)

3. Окрашивание клеток DLBCL различными маркерами старения

ПРИМЕЧАНИЕ: Образцы клеток, окрашенные отдельными маркерами (т.е. тихоокеанским синим EdU, C₁₂FDG или Alexa Fluor 647-γH2AX), подготовлены к созданию компенсационной матрицы для коррекции флуоресцентного побочного эффекта во время измерения. Хотя этот этап настоятельно рекомендуется, он может быть приостановлен при наличии отсутствующего перекрытия (значение коэффициента компенсации ≤ 0,1) спектров излучения между различными флуорофорами. Тем не менее, пользователи должны определить стандартизированные шаги компенсации при использовании различных приборов и флуоресцентных панелей.

1. Добавьте 10 мМ раствора EdU в соотношении 1:1000 в культуру клеток DLBCL, полученную на стадии 1,6 (конечная концентрация EdU составляет 10 мкМ). Аккуратно покачайте пластину, чтобы смешать и инкубировать в инкубаторе 5% CO₂, 37 °C в течение 3 ч.
2. Выньте пластину из инкубатора и добавьте 100 мМ раствора хлорохина до конечной концентрации 75 мкМ (см. обсуждение). Аккуратно покачайте пластину, чтобы смешать и инкубировать в инкубаторе 5% CO₂, 37 °C в течение 30 мин.
3. Выньте пластину из инкубатора и добавьте 20 мМ раствора C₁₂FDG при 1:1000 до конечной концентрации C₁₂FDG 20 мкМ. Аккуратно размажьте пластину для смешивания и инкубации в 5% CO₂, 37 °C инкубаторе в течение 1 ч.
4. Выньте пластину из инкубатора и добавьте 100 мМ 2-фенилэтил-β-D-тиогалактозида (ПЭТГ) раствор в 1:50, чтобы остановить окрашивание fSA-β-gal (конечная концентрация PETG 2 мМ). Аккуратно поверните пластину, чтобы перемешать.
5. Переложите ячейки в 15 мл стерильных центрифужных трубок и вращайте при 100 × г, 4 °C в течение 5 мин. Выбросьте супернатант и промыть клетки 4 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS).
6. Повторите шаг очистки PBS. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 500 мкл 4% раствора для фиксации параформальдегида.
7. После 10 мин инкубации при комнатной температуре центрифугу при 250 × г, комнатной температуры в течение 5 мин. Выбросьте супернатант и промывайте ячейки 4 мл PBS.
8. Повторите шаг очистки PBS. Выбросьте супернатант, повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 мкл буфера пермеабилизации сапонина и перенесите суспензию в новую трубку объемом 1,5 мл. После 10 мин инкубации при комнатной температуре центрифугу при 250 × г, комнатной температуры в течение 5 мин.
9. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 200 мкл раствора первичного антитела (антитело 1:500 γH2AX в инкубационном растворе антител). Инкубировать при 4 °C ночью в темное время суток.
10. Центрифугируют пробирки при 250 × г, 4 °С в течение 5 мин. Выбрасываем супернатант и промываем 100 мкл раствора сапонина для промывки.
11. Повторите этап стирки еще два раза. Отбросьте супернатант и повторно суспендируйте гранулы клеток в 500 мкл коктейля обнаружения EdU.
12. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 мин в темноте. Центрифуга при 250 × г, комнатной температуры 5 мин. Выбросьте надосадочное вещество и промыть 1 мл промывочного раствора сапонина.
13. Повторите этап стирки два раза. Откажитесь от супернатанта и повторно суспендируйте клеточные гранулы в 20-50 мкл PBS. Перейдите к разделу 4 для измерения образцов.

4. Визуализация маркеров старения с помощью системы цитометра потока визуализации

1. Опорожните бутылку с жидкостью для отходов. Проверьте уровни скорости шариков, стерилизатора, очистителя, дебублера, оболочки и реагентов для промывки (деионизированной воды), чтобы обеспечить достаточное количество жидкости перед включением инструмента (см. Таблицу материалов).
2. Включите прибор и программное обеспечение для обработки изображений (см. программный интерфейс на рисунке 1A).
3. Нажмите кнопку «Запуск», чтобы инициализировать флюидику и калибровку системы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура занимает около 45 минут.
4. Установите увеличение в 40 раз, установите низкую скорость флюидики и включите лазеры, необходимые в эксперименте. Включите лазеры 405 нм, 488 нм и 642 нм для измерения EdU-pacific blue, C₁₂FDG и Alexa Fluor 647-γH2AX (или Alexa Fluor 647-Ki67) соответственно. Установите Ch6 для канала рассеяния, а Ch1 и Ch9 для brightfield.
5. Начните с образца, который, как ожидается, будет иметь самую высокую флуоресценцию для настройки интенсивности лазеров. Осторожно переверните пробирку для перемешивания. Откройте крышку трубки и вставьте пробу в док. Нажмите кнопку Загрузить , чтобы начать.
6. Откройте точечную диаграмму и выберите объекты, Area_M01 и аспект Ratio_M01 для осей X и Y соответственно. Установите задворку выше соотношения сторон 0,5, чтобы исключить дублеты и агрегаты ячеек ниже и с правой стороны, а также популяцию бусин скорости с левой стороны (рисунок 1B).
7. Откройте график гистограммы и выберите объект Градиент RMS_M01_Ch01 для оси X. Выберите синглетную популяцию и установите ворота для выбора сфокусированных ячеек (рисунок 1C).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Система визуализации будет автоматически использовать бусины скорости для настройки фокуса для визуализации. Тем не менее, рекомендуется выбрать правильную половину пика гистограммы для наиболее сфокусированной популяции.
8. Откройте график гистограммы и выберите Необработанные максимальные интенсивности пикселей для оси X для каждого цветового канала (Ch2, 7 и 11). Отрегулируйте мощность лазера (например, лазеры 488 нм, 405 нм и 642 нм для Ch2, 7 и 11 соответственно), чтобы каждый фторхром имел значение Raw Max Pixel от 100 до 4000 , чтобы избежать перенасыщения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого эксперимента мощность лазера составляет 50 мВт, 200 мВт и 50 мВт для лазеров 488 нм, 405 нм и 642 нм соответственно.
9. Выберите сфокусированную популяцию для записи и нажмите « Получить », чтобы измерить образцы DLBCL с согласованными настройками. При замене образцов для измерения нажмите « Вернуть», чтобы восстановить пробу. Нажмите кнопку Загрузить , чтобы удалить образец.
10. После того, как все образцы будут измерены, выключите яркое поле и рассейте лазер. Измерьте одноцветные контрольные образцы для создания компенсационной матрицы.
11. Нажмите кнопку Shutdown (Завершение работы ), чтобы закрыть систему обработки изображений.
12. Анализируйте данные в программном обеспечении для анализа изображений.
    1. Используйте инструмент Spot Wizard программного обеспечения для анализа изображений для автоматического подсчета и количественной оценки ядерных очагов γH2AX в изображениях живых клеток. Выберите две популяции клеток (одну с высоким и одну с низким количеством пятен), чтобы обучить мастера спотов дальнейшему автоматическому анализу спотов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Компенсационная матрица была сгенерирована с использованием программного обеспечения для анализа изображений путем загрузки записанных данных одноцветных контрольных образцов. Как показано на дополнительном рисунке S1, при значении коэффициента перекрестных помех 0,248 был ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот метод исследовал способность к проникновению в старение четырех различных клеточных линий DLBCL при химиотерапии с визуализацией яркого поля и количественной оценкой на основе проточной цитометрии. На одноклеточном уровне мы успешно обнаружили основные C₁₂FDG ^{+ EdU-Ki67}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 anti-H2A.X Phospho (Ser139) Antibody	Biolegend	613407
Anti-Ki-67 Mouse Monoclonal Antibody (Alexa Fluor 647)	Biolegend	350509
C12FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranoside)	Fisher Scientific	11590276
Chloroquin -diphosphat	Sigma aldrich	C6628
Cleanser (Coulter Clenz)	Beckman Coulter	8546929
Click-iT EdU Pacific Blue Flow Cytometry Assay Kit	Thermo Scientific	C10418
Daunorubicin	Medchemexpress	HY-13062A
Debubbler (70% Isopropanol)	Millipore	1.3704
Image Analysis software (Amnis IDEAS 6.3)	Luminex	CN-SW69-12
Instrument and imaging software (Amnis ImageStreamX Mk II Imaging Flow Cytometer System and INSPIRE software)	Luminex	100220
KARPAS	DSMZ	ACC 31
mafosfamide cyclohexylamine	Niomech	D-17272
OCI-LY1	DSMZ	ACC 722
Paraformaldehyde	Fisher Scientific	11473704
PETG (2-Phenylethyl-β-D-thiogalactosid)	Sigma aldrich	P4902
saponin	Sigma aldrich	47036
Sheath	Millipore	BSS-1006-B
SpeedBead Kit for ImageStream	Luminex	400041
Sterilizer (0.4-0.7% Hypochlorite)	VWR	JT9416-1
SU-DHL6	DSMZ	ACC 572
WSU-DLCL2	DSMZ	ACC 575