Простой протокол анализа ям для визуализации и количественной оценки остеокластической резорбции in vitro

Резюме

Здесь мы представляем простую и эффективную процедуру анализа резорбционных ям с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция.

Аннотация

Зрелые остеокласты представляют собой многоядерные клетки, которые могут разлагать кости за счет секреции кислот и ферментов. Они играют решающую роль при различных заболеваниях (например, остеопорозе и раке костей) и поэтому являются важными объектами исследований. In vitro их активность может быть проанализирована путем образования резорбционных ямок. В этом протоколе мы описываем простой метод анализа с использованием пластин клеточных культур, покрытых фосфатом кальция (CaP), которые можно легко визуализировать и количественно оценить. Предшественники остеокластов, полученные из мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs), культивировали на покрытых пластинах в присутствии остеокластогенных стимулов. После 9 дней инкубации остеокласты были зафиксированы и окрашены для флуоресцентной визуализации, в то время как покрытие CaP было противопоставлено кальцеину. Для количественной оценки рассасываемой области покрытие CaP на пластинах окрашивали 5% AgNO₃ и визуализировали с помощью визуализации brightfield. Площадь резорбционной ямы была количественно определена с помощью ImageJ.

Введение

Остеокласты (OC) представляют собой тканеспецифические макрофаги, полученные из гемопоэтических стволовых клеток (HSC), играющие ключевую роль в ремоделировании кости вместе с остеобластами¹. Вызванные половыми гормонами, иммунологические и злокачественные заболевания костей, которые разрушают кости системно или локально, обусловлены избыточной остеокластической активностью, включая остеопороз, связанный с менопаузой², ревматоидный артрит³, пародонтоз^{4, заболевание кости} миеломы⁵ и остеолитическое метастазирование в кости⁶. Напротив, дефекты образования и функции OC также могут вызывать остеопетроз⁷. ГСК подвергаются дифференцировке в предшественники OC при стимуляции макрофагов колониестимулирующим фактором (M-CSF, символ гена ACP5). В присутствии как M-CSF, так и рецепторного активатора лиганда NF-κB (RANKL, символ гена TNFSF11), предшественники OC дифференцируются далее в мононуклеарные OC и впоследствии сливаются, чтобы стать многоядерными^{OC 8,9,10}. Оба цитокина M-CSF и RANKL незаменимы и достаточны для индукции остеокластических маркеров, таких как рецептор кальцитонина (CT), активатор рецептора ядерного фактора κ B (RANK), протонная помпа V-АТФазы, альфа-субъединица хлоридного канала 7 (CIC-7), интегрин β3, тартраторезистентная кислая фосфатаза (TRAP, символ гена ACP5), лизосомальный цистеинпротеазный катепсин K (CTSK) и матрикс металлопептидаза 9 (MMP9). Активированные ОС образуют зону уплотнения на поверхности кости путем образования актинового кольца с взъерошенной границей^11,12. В пределах зоны уплотнения ОС опосредуют резорбцию путем секреции протонов через протонный насос V-АТФазы ^12,13, MMP9¹⁴ и CTSK¹⁵, что приводит к образованию лакун.

Для экспериментов in vitro предшественники OC могут быть получены путем расширения макрофагов костного мозга из бедренной и большеберцовой^{костей мышей 16,17}, а также путем выделения мононуклеарных клеток периферической крови человека (PBMCs) из образцов крови и пышных покрытий 18,19,20 или путем дифференцировки увековеченных мышиных моноцитарных клеток RAW 264,7 ^21,22.

В настоящем протоколе мы описываем остеокластический резорбционный анализ в пластинах клеточных культур, покрытых CaP, с использованием OC, полученных из первичных PBMCs. Используемый здесь метод клеточных культуральных пластин с покрытием CaP принят и усовершенствован из метода, описанного ранее Patntirapong et ^al.17 и Maria et ^al.21. Для получения предшественников OC PBMC выделяют центрифугированием градиента плотности и расширяют, как описано ранее²⁰.

протокол

Протокол был рассмотрен и одобрен местным комитетом по этике (номер одобрения 287/2020B02).

1. Приготовление пластин для культивирования клеток, покрытых фосфатом кальция

1. Приготовление раствора кальция (25 мМ CaCl₂·2H₂O, 1,37 мМ NaCl, 15 мМ MgCl₂·6H₂O в буфере Tris)
   1. Подготовьте буфер 1,0 М Трис и отрегулируйте рН до 7,4 с помощью 1 М HCl.
   2. Установите стеклянный стакан на магнитную мешалку и добавьте 100 мл буфера 1,0 М Tris.
   3. Вегетируют 0,368 г CaCl₂·2H₂O, 8,0 г NaCl и 0,305 г MgCl₂·6H_2Oи растворяют в буфере Tris один за другим.
   4. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 1 M HCl. Хранить при комнатной температуре.
2. Приготовление фосфатного стоковой раствора (11,1 мМ Na₂HPO₄· H₂O, 42 мМ NaHCO₃ в буфере Tris)
   1. Установите стеклянный стакан на магнитную мешалку и добавьте 100 мл буфера 1,0 М Tris.
   2. Вес 0,158 г Na₂HPO₄· _H2Oи 0,353 г NaHCO₃ растворяют в буфере Tris один за другим.
   3. Отрегулируйте pH до 7,4 с помощью 1 M HCl. Хранить при комнатной температуре.
3. Предварительная кальцификация 96-луночных пластин для культивирования клеток
   1. Готовят 30 мл рабочего раствора, смешивая 15 мл буфера 1,0 М Триса, 7,5 мл раствора запаса кальция (стадия 1.1.4) и 7,5 мл раствора фосфатного сырья (стадия 1.2.3). Отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм.
   2. Подготовьте 96-луночную пластину для культивирования клеток с плоским дном. Пипетка 300 мкл раствора фосфата кальция (стадия 1.3.1.) в каждую лунку. Накройте пластину крышкой и инкубируйте пластину при 37 °C в течение 3 дней.
4. Приготовление раствора фосфата кальция (2,25 мМ Na₂HPO₄· H₂O, 4 мМ CaCl₂·2H₂O, 0,14 M NaCl, 50 мМ Tris основания в ddH₂O)
   1. Добавьте 2 мл 1 M HCl к 40 мл деионизированной воды в стакан с магнитным перемешивающим шариком и растворите 0,016 г Na₂HPO₄· _H2O, 0,0295 г CaCl₂·2H₂O, 0,409 г NaCl и 0,303 г основания Tris один за другим.
   2. Отрегулируйте pH до 7,4, используя 1 M HCl. Добавьте деионизированную воду, чтобы заполнить объем до 50 мл. Отфильтруйте раствор с помощью фильтра 0,2 мкм.
5. Кальцификация пластин для культивирования клеток из 96 лунок
   1. Аспирировать раствор предварительной кальцификации из предварительно кальцинированных 96-луночных пластин для культивирования клеток и добавлять 300 мкл раствора фосфата кальция (стадия 1.4.2) в каждую лунку. Накройте пластины крышкой и высиживайте при 37 °C в течение 1 дня.
   2. Переверните тарелку, чтобы вылить раствор, и тщательно вымойте тарелку три раза деионизированной водой. Немедленно высушите пластину с помощью фена или сжатого газа CO₂ или N₂ для поддержания однородной поверхности.
   3. Стерилизуйте покрытую пластину УФ-излучением в чистом стенде в течение 1 ч. Немедленно используйте пластину с покрытием или запечатайте пластину парапленкой и храните ее при комнатной температуре.

2. Выделение ПБМК из периферической крови человека

1. Взять 15 мл крови из вены после получения письменного информированного согласия от донора крови (этическое голосование: 287/2020B02).
2. Разбавьте 15 мл свежей крови с равным объемом PBS и перемешайте, перевернув трубку несколько раз или втянув смесь в пипетку и выйдя из нее.
3. Приготовьте коническую трубку объемом 50 мл, содержащую 15 мл раствора градиента плотности (например, Ficoll, Table of Materials) на пробирку. Наклоните пробирку и аккуратно наложите 30 мл разбавленного образца крови на 15 мл раствора градиента плотности (разбавленный образец крови: раствор градиента плотности, соотношение 1:0,5-1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: При наложении образца обратите внимание на то, чтобы не смешивать раствор градиента плотности с разбавленным образцом крови.
4. Центрифуга при 810 х г в течение 20 мин при 20 °C в поворотном роторе без тормоза.
5. Аспирировать верхний слой, оставляя мононуклеарный клеточный слой (лимфоциты, моноциты и тромбоциты) нетронутым в интерфазе.
6. Аккуратно переложите слой мононуклеарной клетки на новую коническую трубку объемом 50 мл.
7. Заполните трубку PBS, перемешайте и центрифугу при 300 x g в течение 10 мин при 20 °C (тормоз можно использовать с этой стадии).
8. Осторожно удалите супернатант полностью. Повторно суспендируют ячейку гранулы в 50 мл PBS и центрифугу при 300 х г в течение 10 мин при 20 °C. Осторожно удалите супернатант полностью.
9. Для удаления тромбоцитов повторно суспендируют ячейку гранулы в 50 мл PBS и центрифугу при 200 х г в течение 10 мин при 20 °C. Осторожно удалите супернатант полностью.
10. Перенос ресуспендированных клеток в колбы клеточных культур для расширения предшественников OC.

3. Расширение предшественников OC

1. Повторное суспендирование МПК в полном α-MEM (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% амфотерицин B), содержащих 20 нг/мл M-CSF. Семена НБМК при плотности 2,5 х 10⁵ клеток/^см2. Обычно клетки, выделенные из 15-20 мл свежей крови, можно посеять в одну колбу^{размером 75 см2} (1,5-2 х 10⁷ клеток).
2. Кормите клетки свежим полным α-MEM, содержащим 20 нг/мл M-CSF каждый третий день, пока прикрепленные клетки не достигнут желаемого слияния. Типичные выходы составляют 1,5-2 х 10⁶ клеток / колба, когда ячейки на 95% сливаются. Обычно период расширения длится 6 дней.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Остеокластогенный потенциал предшественников может снижаться при длительном времени культивирования.

4. Индукция остеокластогенеза в пластинах, покрытых CaP

1. Для облегчения клеточной адгезии инкубируют пластины, покрытые CaP, 50 мкл FBS в течение 1 ч в инкубаторе с температурой 37 °C.
2. Чтобы отсоединить предшественники OC, дважды промойте колбу с PBS, чтобы удалить мертвые или неадгезивные клетки. Добавить 4 мл трипсина (Таблица материалов) на 75^см2 колбы, в течение 30 мин.
   1. Добавьте 4 мл полной α-MEM, чтобы остановить пищеварение, аккуратно отсоедините клетки с помощью клеточного скребка и перенесите клетки в трубку объемом 50 мл.
   2. Определите общее число ячеек с помощью камеры Нойбауэра или аналогичной камеры.
3. Гранулируйте ячейки центрифугированием в течение 7 мин при 350 х г. Повторно суспендируют гранулу в достаточном полном α-MEM, содержащем 20 нг/мл M-CSF и 20 нг/мл RANKL для получения концентрации 1 х 10⁶ клеток/мл.
4. Раствор аспирата FBS из 96-луночной пластины с покрытием CaP и пипетки 200 мкл клеточной суспензии на лунку (2 x 10⁵ ячеек/лунка).
5. Инкубируйте предшественники OC в течение желаемого периода времени или с желаемыми реагентами, относящимися к экспериментальной конструкции. Обычно большое количество крупных и многоядерных ОК может наблюдаться через 6 дней и при формировании ям рекорбции. Питательные ячейки со свежей полной средой α-MEM, содержащей 20 нг/мл M-CSF и 20 нг/мл RANKL каждый третий день.
6. В конце инкубации дважды промыть клетки PBS, зафиксировать 4% параформальдегидом в течение 10 мин и снова промыть PBS.
7. Используйте фиксированные OC непосредственно для флуоресцентного окрашивания или храните при температуре 4 °C.

5. Флуоресцентное окрашивание ОК и CaP покрытия

1. Инкубируют фиксированные клетки с буфером пермеабилизации (0,1% тритона в PBS) в течение 5 мин.
2. Окрашивание актиновых нитей 100 мкл меченого раствора фаллоидина AlexaFluor 546 в PBS в течение 30 мин и аспирация окрашивающего раствора. Добавьте 100 мкл окрашивающего раствора Hoechst 33342 (10 мкг/мл в PBS) в течение 10 мин для окрашивания ядер. DaPI также можно использовать.
3. Окрашивание CaP-покрытия 100 мкл 10 мкМ кальциина в PBS в течение 10 мин. Трижды вымойте PBS и сделайте снимки.
4. После флуоресцентной визуализации одни и те же пластины могут быть использованы для количественной оценки площади резорбционной ямки путем окрашивания фон Косса. Для этого дважды промыть тарелки деионизированной водой.

6. Количественная оценка общей площади карьера резорбции

1. Для окрашивания CaP-покрытия окрашиванием фон Косса инкубируют с 50 мкл 5% AgNO₃ в деионизированной воде на скважину под УФ-излучением в течение 1 ч, пока покрытие на дне скважин не станет коричневым.
2. Трижды вымойте тарелку деионизированной водой и сделайте яркие снимки. Объектив с небольшим увеличением, такой как объектив 1,25x, может быть использован для захвата всей скважины на одном изображении. Это облегчает последующий анализ изображений. Могут применяться альтернативные методы захвата всей площади скважины.
3. Откройте файл изображения с помощью ImageJ: файл | Открыть | Изображение | Тип | 8-бит. Проверьте единицу масштабирования в правом нижнем углу изображения, используя прямую линию | Анализ | Установите масштаб. Введите длину в поле «Известное расстояние», введите новую единицу масштабирования в поле Единица длины и установите флажок Глобальный.
4. Список параметров измерения, подлежащих анализу: Анализ | Установка измерений. В окне Задание измерений установите флажки Область и Ограничить пороговыми значениями.
5. Измерение площади ям: изображение | Отрегулируйте | Порог. В окне Порог установите флажок Темный фон и нажмите кнопку Авто. Площадь ям становится красной. Закройте окно Пороговое значение и выберите Анализировать | Мера. Сохраните результирующий файл: файл | Сохранить как.

7. Количественная оценка количества и размера ОС, а также нормированная площадь резорбционной ямы

1. Откройте флуоресцентное изображение остеокластов с помощью ImageJ и проверьте единицу масштабирования (см. шаг 6.3).
2. Список параметров измерения, подлежащих анализу: Анализ | Установка измерений. В окне Задание измерений установите флажок Область .
3. Структурирование операционных систем с помощью выбора ROI Manager и Polygon: анализ | Инструменты | Менеджер по окупаемости инвестиций. Щелкните Выделения полигона в наборе инструментов, наметьте один OC (ячейки с актиновым кольцом и ≥ тремя ядрами) и нажмите кнопку Добавить [t] в окне МЕНЕДЖЕРА ROI. Повторяйте структурирование до тех пор, пока не будут включены все операционные системы.
4. Измерение количества и размера операционных систем: выберите все элементы в ДИСПЕТЧЕРЕ ОКУПАЕМОСТИ инвестиций и нажмите кнопку Измерить. Сохраните результирующий файл: | Сохранить как (рисунок 3E).
5. Измерьте площадь ямы флуоресцентных изображений. Откройте флуоресцентное изображение покрытия, коррелирующее с изображением на шаге 7.3, и проверьте единицу измерения масштаба (см. шаг 6.3).
   1. Перечислите параметры измерения, подлежащие анализу (см. шаг 6.4). Выберите | изображений Отрегулируйте | Порог. В окне Пороговое значение снимите все флажки и нажмите кнопку Авто. Площадь ям становится красной. Закройте окно Пороговое значение и выберите Анализ | Мера. Сохраните файл результатов.
6. Рассчитайте нормированную площадь карьера по номеру OC.

Результаты

Покрытие фосфатом кальция на дне пластин клеточной культуры выполняли в два этапа покрытия, включающих 3-дневную предварительную кальцификацию и 1-дневную стадию кальцификации. Как показано на фиг.1, равномерно распределенный фосфат кальция получали на дне 96-луночных п?...

Обсуждение

Здесь мы описываем простой и надежный метод анализа остеокластической резорбции с использованием OC, полученных и расширенных in vitro из PBMCs. Используемые пластины для культивирования клеток с покрытием CaP могут быть легко подготовлены и визуализированы с использованием лабораторны...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AgNO3	SERVA Electrophoresis GmbH	35110	Silver nitrate
a-MEM	Gibco	32561-029	MEM alpha, GlutaMAX, no nucleosides
amphotericin B	Biochrom	03-028-1B	Amphotericin B Solution
CaCl2	Sigma-Aldrich	21097-50G	Calcium chloride Dihydrate
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875	Calcein
FBS	Sigma-Aldrich	F7524	fetal bovine serum
Ficoll	Cytiva	17144002	Ficoll Paque Plus
Fixation buffer	Biolegend	420801	Paraformaldehyde
HCl	Merk	1.09057.1000	Hydrochloric acid
Hoechst 33342	Promokine	PK-CA707-40046	Hoechst 33342
M-CSF	PeproTech	300-25	Recombinant Human M-CSF
MgCl2	Sigma-Aldrich	7791-18-6	Magnesium chloride
Na2HPO4	AppliChem GmbH	A2943,0250	di- Sodium hydrogen phosphate anhydrous
NaCl	Merk	S7653-250G	Sodium chloride
NaHCO3	Merk	K15322429	Bicarbonate of Soda
PBS	Lonza	17-512F	Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1X), DBPS without Calcium and Magnesium
Pen-Strep	Lonza	DE17-602E	Penicillin-Streptomycin Mixture
Phalloidin-Alexa Fluor 546	Invitrogen	A22283	Alexa Fluor 546 Phalloidin
RANKL	PeproTech	310-01	Recombinant Human sRANK Ligand (E.coli derived)
Tris	Sigma-Aldrich	93362	Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Alkyl Phenyl Polyethylene Glycol
TrypLE Express	Gibco	12605010	Recombinant cell-dissociation enzymes