Новая высокопроизводительная модель раны овечьей кожи Ex Vivo для тестирования новых антибиотиков

Резюме

Протокол описывает пошаговый метод создания модели поврежденной овец ex vivo , инфицированной золотистым стафилококком. Эта высокопроизводительная модель лучше имитирует инфекции in vivo по сравнению с обычными методами микробиологии и предоставляет исследователям физиологически значимую платформу для проверки эффективности новых противомикробных препаратов.

Аннотация

Разработка противомикробных препаратов является дорогостоящим процессом со все более низкими показателями успеха, что делает дальнейшие инвестиции в исследования по обнаружению противомикробных препаратов менее привлекательными. Открытие противомикробных препаратов и последующая коммерциализация могут стать более прибыльными, если подход «быстро и безотказно дешево» может быть реализован на этапах оптимизации лидов, где исследователи имеют больший контроль над дизайном и формулированием лекарств. В этой статье описана установка модели поврежденной овец ex vivo , инфицированной золотистым стафилококком, которая является простой, экономически эффективной, высокопроизводительной и воспроизводимой. Бактериальная физиология в модели имитирует, что во время инфекции бактериальная пролиферация зависит от способности патогена повреждать ткани. Установление раневой инфекции подтверждается увеличением жизнеспособного количества бактерий по сравнению с инокулятом. Эта модель может быть использована в качестве платформы для проверки эффективности новых противомикробных препаратов на этапе оптимизации лидов. Можно утверждать, что доступность этой модели предоставит исследователям, разрабатывающим противомикробные препараты, модель «быстро и без сбоев», которая поможет повысить показатели успеха в последующих испытаниях на животных. Модель также будет способствовать сокращению и совершенствованию использования животных для исследований и в конечном итоге позволит быстрее и экономичнее переводить новые противомикробные препараты для инфекций кожи и мягких тканей в клинику.

Введение

Кожные инфекции являются важной глобальной проблемой, с большими экономическими издержками для поставщиков медицинских услуг во всем мире. Развитие множественной лекарственной устойчивости и образование биопленки патогенами играет ключевую роль в распространенности незаживающих ран 1,2,3,4. В результате этого инфекции кожи и мягких тканей являются одной из наиболее распространенных причин длительной госпитализации и последующей реадмиссии⁵. Задержки в заживлении ран являются дорогостоящими как для пациента, так и для медицинских работников, причем, по некоторым оценкам, около 6,5 миллионов пациентов ежегодно страдают в США. В Великобритании кожные инфекции и связанные с ними осложнения приводят к примерно 75 000 смертей ежегодно ^2,4,6.

Золотистый стафилококк (S. aureus) является грозным раневым возбудителем, часто выделяемым из ран пациента ^2,7. Скорость появления множественной лекарственной устойчивости резко возросла в 2000-х годах. В течение этого времени около 60% острых бактериальных инфекций кожи и структуры кожи были положительными для метициллин-резистентного S. aureus¹. Растущее число штаммов с множественной лекарственной устойчивостью среди стафилококков, да и других патогенов, в течение последних 2 десятилетий указывает на острую необходимость быстрой разработки антибиотиков с новыми способами действия, которые могут преодолеть резистентность.

Тем не менее, с начала 2000-х годов в программах открытия антибиотиков доминировало более длительное время разработки и низкие показатели успеха, и только 17% новых антибиотиков, поступающих в клинические испытания в США, достигли одобрения рынка⁸. Это говорит о несоответствии между результатами тестирования in vitro новых антибиотиков и их клиническими результатами. Можно утверждать, что это несоответствие во многом связано с различиями в физиологии бактерий во время инфекций in vivo и во время обычных микробиологических методов при тестировании эффективности антибиотиков на доклинических стадиях in vitro . Поэтому новые лабораторные методы, которые более репрезентативны для бактериальной физиологии во время инфекции, необходимы для улучшения показателей успеха в программах открытия антибиотиков.

Современные методы изучения кожных инфекций включают исследования на живых животных (например, мышах), моделях кожи ex vivo (например, свиней) и 3D-тканеинженерных моделях кожи (например, человека)9,10,11,12. Исследования на живых животных строго регламентированы и имеют относительно низкую пропускную способность. На животных моделях раны и инфекции вызывают значительные страдания у животных и вызывают этические проблемы. Модели кожи человека, ex vivo или тканевые, требуют этического одобрения, соблюдения местного и глобального законодательства (Закон о тканях человека, Хельсинкская декларация), и существуют трудности с приобретением тканей, причем для выполнения некоторых запросов требуются годы для выполнения^13,14. Оба типа моделей являются трудоемкими и требуют значительных знаний для обеспечения успеха экспериментов. Некоторые современные модели инфекции кожи ex vivo требуют предварительно инокулированных дисков и добавок для раневого ложа, чтобы обеспечить инфекцию; хотя эти модели невероятно полезны, существуют ограничения в процессе заражения, поскольку добавки ограничивают использование раневого ложа в качестве источника питательных веществ 10,15,16,17. Модель, описанная в этом исследовании, не использует никаких добавок к раневому слою, что гарантирует, что патология инфекции и количество жизнеспособных клеток являются результатом прямого использования раневого ложа в качестве единственного источника питательных веществ.

Учитывая необходимость новых лабораторных методов, была разработана новая высокопроизводительная модель овец ex vivo для использования при оценке эффективности новых антибиотиков. Исследования кожных инфекций сталкиваются со многими проблемами - высокими затратами, этическими проблемами и моделями, которые не показывают полной картины^20,21. Модели ex vivo и 3D-модели эксплантата позволяют лучше визуализировать процесс заболевания и влияние, которое лечение может оказать от более клинически значимой модели. Здесь описана установка новой модели овечьей кожи, которая проста, воспроизводима и клинически значима и имеет высокую пропускную способность. Овечья кожа была выбрана, поскольку овцы являются одним из крупных млекопитающих, обычно используемых для моделирования реакций на инфекции in vivo. Кроме того, они легко доступны со скотобоен, обеспечивая постоянный запас кожи для исследований, а их туши не ошпариваются, обеспечивая хорошее качество тканей. В этом исследовании в качестве примера патогена использовался S. aureus; однако модель хорошо работает с другими микроорганизмами.

протокол

Головы ягнят из скотобойни R.B Elliott и Son Abattoir были использованы в качестве источника образцов кожи в этом проекте. Всех ягнят забивали для потребления в пищу. Вместо того, чтобы отбрасывать головы, они были перепрофилированы для исследований. Этическое одобрение не требовалось, поскольку ткань была получена из отходов, выброшенных со скотобоен.

1. Стерилизация

1. Дезинфицируйте щипцы перед сбором головок, взяв чистые щипцы и выполнив сухую тепловую стерилизацию в духовке при 200 °C в течение 1 ч. Автоклав всей стеклянной посуды при 121 °C в течение 15 мин перед использованием.
2. Выполняйте все описанные работы в микробиологическом кабинете класса 2. Подготовьте все реагенты в соответствии с инструкциями производителя.

2. Сбор образцов

1. На скотобойне ягнят Swaledale забивали с помощью электричества или пистолета с затвором в неволе и экссангировали. Собирайте головки ягнят не более 4 ч после убоя.

3. Подготовка руководителей

1. Продезинфицируйте участок лба баранины, вылив примерно 100 мл раствора диоксида хлора 200 ppm на область образца. Сбрить лоб головы с помощью электрических клиперов и промыть участок 200 мл раствора диоксида хлора 200 ppm.
2. Протрите область этанолом и синим рулетом и накройте область образца кремом для удаления волос в течение 35 минут. Аккуратно соскоблите крем для удаления волос с помощью инструмента для соскабливания и оцените площадь образца. Если осталось значительное количество волос, повторите процесс удаления волос.
3. Используйте еще 200 мл раствора диоксида хлора, чтобы промыть область, а затем промыть этанолом и протереть синим рулоном.
4. Используя стерильный 8-мм биопсийный перфоратор, вырежьте образцы кожи диаметром 8 мм из подготовленного участка. Удалите образцы с помощью стерильных щипцов и скальпеля с 15 лезвиями, гарантируя, что весь кожный жир удален.
5. Поместите образцы в стерильную банку объемом 0,5 л, заполненную стерильным фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), а затем переложите их в стерильные пробирки объемом 50 мл с 50 мл раствором диоксида хлора 200 ppm, дважды инвертируйте и оставьте стерилизовать в течение 30 мин.
6. Извлеките образцы из раствора диоксида хлора и промыть их, поместив их в 50 мл пробирку, заполненную 40 мл стерильного PBS. После мытья поместите каждый отдельный образец кожи в отдельный колодец из 24-луночной пластины.
7. Добавьте 350 мкл предварительно нагретой среды, сохраняя образец на границе раздела воздух-жидкость. Состав среды следующий: MK media (Medium 199 с солями Хэнкса, L-глутаматом и 1,75 мг/мл бикарбоната натрия) и Ham's F12 в соотношении 1:1, с добавлением FBS (10% v/v), EGF (10 нг/мл), инсулина (5 мкг/мл), пенициллина-стрептомицина (100 Ед/мл) и амфотерицина B (2,5 мкг/мл).
8. Запечатайте пластины из 24 скважин газопроницаемой пластиной и инкубируйте при 37 °C в увлажненном 5% CO₂ тканевом инкубаторе на срок до 24 ч.

4. Уход за образцами кожи

1. После инкубации удаляют питательную среду и промывают образцы в 500 мкл стерильного PBS. Добавляют среду без антибиотиков в каждый образец и инкубируют при 37 °C в увлажненном 5% тканевом инкубаторе_CO2 в течение 24 ч для удаления остаточных антибиотиков в образце.
2. Если мутность или грибковая инфекция развиваются в среде без антибиотиков через 24 ч, то выбросьте образец.

5. Приготовление инокулята

1. Приготовьте пробирку объемом 50 мл с 10 мл стерильного триптического соевого бульона. Возьмите свежую агаровую тарелку S. aureus и используйте тампон для переноса нескольких колоний в бульон. Инкубировать в течение 18 ч при 37 °C при 150 об/мин.
2. Центрифуга при 4 000 х г в течение 3 мин. Удалите супернатант и повторно суспендируйте клеточную гранулу в 10 мл стерильного PBS. Повторите дважды, чтобы обеспечить адекватное промывание клеток.
3. Отрегулируйте инокулятор до 0,6 OD₆₀₀ в стерильном PBS. Подтвердите нагрузку инокулята, выполнив ручной подсчет жизнеспособных пластин.

6. Инфицирование образцов кожи

1. Приготовьте свежую 24-луночную пластину с 400 мкл предварительно нагретой среды, не содержащей антибиотиков, и добавьте в 24-луночные вставки с помощью стерильных щипцов.
2. Извлеките носитель из образцов кожи, промойте 500 мкл стерильного PBS и удалите стирку. Используйте стерильные щипцы, чтобы аккуратно удерживать образец на дне колодца.
3. Используйте 4-миллиметровую пункционную биопсию, чтобы сделать центральный раневой лоскут, прокалывающий на грубую глубину 1-2 мм. Затем используйте скальпель с 15 лезвиями и стерильные зубчатые щипцы для удаления верхнего слоя раневого лоскута. Изменчивость размеров раны может повлиять на исход инфекции и конечную точку колониеобразующих единиц (КОЕ).
4. После того, как все образцы будут ранены, переложите их на 24-луночные вставки с помощью стерильных щипцов. Пипетка 15 мкл бактериального инокулята в раневое ложе. Затем инкубируют в течение 24 ч при 37 °C в увлажненном 5%_CO2 тканевом инкубаторе.
5. Если необходимы более длительные инкубационные периоды, удалите среду и замените ее свежей средой каждые 24 ч и инкубируйте в тех же условиях.

7. Определение бактериальной нагрузки

1. Удалите носитель со дна скважин. С помощью стерильных щипцов переложите каждый образец в отдельную трубку объемом 50 мл, заполненную 1 мл стерильного PBS.
2. Используйте гомогенизатор с тонким наконечником для гомогенизации поверхности образца. Позаботьтесь о том, чтобы раневое ложе находилось в непосредственном контакте с кончиком гомогенизатора.
3. Гомогенизируйте каждый образец в течение 35 с на среднем/высоком уровне. Гомогенизатор отделяет бактерии от поверхности раневого ложа, чтобы обеспечить перечисление бактериальной нагрузки.
4. После того, как все образцы обработаны, вихрь каждого образца, в свою очередь, перед пипеткой. Это делается для того, чтобы бактериальный гомогенат был смешан.
5. Пипетка 20 мкл вихревого гомогената в соответствующую скважину 96-луночной пластины, содержащей 180 мкл стерильного PBS.
6. Последовательно разбавляйте каждый образец гомогената до 1 х 10⁻⁷ и пипетки 10 мкл разбавленного гомогената на триптическую соевую агаровую пластину в трех экземплярах.
7. Инкубировать агаровую пластину в течение 18 ч при температуре 37 °C. Затем подсчитайте количество колоний, чтобы определить КОЕ для каждого образца.

Результаты

Определение пути стерилизации кожи перед созданием модели раневой инфекции было сложной задачей. Задача заключалась в стерилизации кожи без повреждения различных слоев кожи, что затем может иметь непреднамеренные последствия в результате инфекции. Чтобы определить подходящий режим ...

Обсуждение

Разработка противомикробных препаратов является важным, но дорогостоящим предприятием, которое, по оценкам, стоит около 1 миллиарда долларов и занимает около 15 лет. Более 90% открытий противомикробных препаратов и доклинических исследований эффективности противомикробных препаратов ?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24 Well Companion Plate	SLS	353504
4 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7484
50 ml centrifuge tubes	Fisher Scientific	10788561
8 mm Biopsy Punch	Williams Medical	D7488
Amphotericin B solution, sterile	Sigma	A2942
Colour Pro Style Cordless Hair Clipper	Wahl	9639-2117X	Hair Clippers
Dual Oven Incubator	SLS	OVe1020	Sterilising oven
Epidermal growth factor	SLS	E5036-200UG
Ethanol	Honeywell	458600-2.5L
F12 HAM	Sigma	N4888
Foetal bovine serum	Labtech International	CA-115/500
Forceps	Fisher Scientific	15307805
Hair Removal Cream	Veet	Not applicable
Heracell VIOS 160i	Thermo Scientific	15373212	Tissue culture incubator
Heraeus Megafuge 16R	VWR	521-2242	Centrifuge
Homogenizer 220, Handheld	Fisher Scientific	15575809
Homogenizer 220, plastic blending cones	Fisher Scientific	15585819
Insert Individual 24 well 0.4um membrane	VWR International	353095
Insulin, recombinant Human	SLS	91077C-1G
Medium 199 (MK media)	Sigma	M0393
Microplate, cell culture Costar 96 well	Fisher Scientific	10687551
Multitron	Infors	Not applicable	Bacterial incubator
PBS tablets	Sigma	P4417-100TAB
Penicillin-Streptomycin	SLS	P0781
Plate seals	Fisher Scientific	ESI-B-100
Safe 2020	Fisher Scientific	1284804	Class II microbiology safety cabinet
Scalpel blade number 15	Fisher Scientific	O305
Scalpel Swann Morton	Fisher Scientific	11849002
Sodium bicarbonate	Sigma	S5761-1KG
Toothed Allis Tissue Forceps	Rocialle	RSPU500-322
Tryptic Soy Agar	Merck Life Science UK Limited	14432-500G-F
Tryptic Soy Broth	Merck Life Science UK Limited	41298-500G-F
Vimoba Tablets	Quip Labs	VMTAB75BX