Тестирование проницаемости эпителия в энтероидах, полученных из тканей плода

Резюме

Этот протокол подробно описывает создание энтероидов, трехмерной кишечной модели, из кишечной ткани плода. Иммунофлуоресцентная визуализация эпителиальных биомаркеров использовалась для характеристики модели. Апикальное воздействие липополисахаридов, бактериального эндотоксина, с использованием метода микроинъекции индуцировало проницаемость эпителия дозозависимым образом, измеряемым утечкой флуоресцентного декстрана.

Аннотация

Энтероиды, полученные из тканей плода человека, становятся многообещающей моделью in vitro для изучения кишечных травм у недоношенных детей. Энтероиды проявляют полярность, состоящую из просвета с апикальной границей, плотных соединений и базолатерального внешнего слоя, подверженного воздействию питательных сред. К последствиям травм кишечника относят воспаление слизистой оболочки и повышенную проницаемость. Тестирование кишечной проницаемости у уязвимых недоношенных людей часто неосуществимо. Таким образом, для изучения кишечных повреждений кишечника у недоношенных детей необходима кишечная модель in vitro . Энтероиды могут быть использованы для проверки изменений проницаемости эпителия, регулируемых белками плотного соединения. У энтероидов стволовые клетки кишечника дифференцируются во все типы эпителиальных клеток и образуют трехмерную структуру на матрице базальной мембраны, секретируемой клетками саркомы мыши. В этой статье мы опишем методы, используемые для установления энтероидов из кишечной ткани плода, характеризуя энтероидные плотные соединения белков иммунофлуоресцентной визуализацией и проверки проницаемости эпителия. Поскольку грамотрицательный доминантный бактериальный дисбактериоз является известным фактором риска повреждения кишечника, мы использовали липополисахарид (ЛПС), эндотоксин, продуцируемый грамотрицательными бактериями, чтобы вызвать проницаемость в энтероидах. Флуоресцеин-меченый декстран был микроинъецирован в энтероидный просвет, и последовательные концентрации декстрана, просочившиеся в культуральную среду, были измерены для количественной оценки изменений параклеточной проницаемости. Эксперимент показал, что апикальное воздействие ЛПС индуцирует проницаемость эпителия в зависимости от концентрации. Эти результаты подтверждают гипотезу о том, что грамотрицательный доминантный дисбактериоз способствует механизму повреждения кишечника у недоношенных детей.

Введение

Недоношенные дети подвергаются частому и длительному воспалению, которое подвергает их повышенному риску повреждения кишечника, что приводит к долгосрочной инвалидности или смерти¹. Исследования в этой области оспариваются ограниченной способностью проводить эксперименты на уязвимых недоношенных детях. Кроме того, отсутствие подходящих моделей затрудняет всестороннее изучение преждевременной кишечной среды². Существующие модели in vitro и in vivo не смогли всесторонне представить преждевременную кишечную среду человека. В частности, одиночные эпителиальные клеточные линии плода могут не образовывать плотных соединений, а животные модели демонстрируют различные воспалительные и иммунологические реакции, чем недоношенные дети. С открытием передачи сигналов Wnt в качестве основного пути в пролиферации и дифференцировке стволовых клеток кишечного крипта и новых тканевых стволовых клеток Lgr5⁺, органоиды, полученные из кишечной ткани, такие как энтероиды и колоноиды, были установлены в качестве моделей in vitro ^3,4,5. Используя эту технологию, можно создавать и использовать трехмерные (3D) энтероидные модели, которые разрабатываются из целой ткани или биопсии кишечника для изучения эпителиальных реакций на кишечную среду ^6,7.

В отличие от типичных клеточных линий кишечника, выращенных в культуре, энтероиды проявляют полярность с просветом, соединенным белками плотного соединения⁸. Это позволяет подвергать воздействию базолатеральную границу в среде роста, а также люминальную микроинъекцию для оценки апикальной границы. Кроме того, энтероиды демонстрируют сходные генетические, физиологические и иммунологические характеристики с эпителием человека ^9,10. Энтероиды, полученные из тканей плода, позволяют исследовать роль недоношенных в функции эпителия. Уникальные характеристики энтероидов могут больше напоминать преждевременную кишечную среду⁹. Тканевые энтероиды могут быть использованы для проверки целостности плотного соединения в виде монослоя или в виде 3D-структур, встроенных в затвердевшую белковую смесь базальной мембраны. Метод микроинъекции требуется для последней формы, если требуется апикальное воздействие. Измерение эпителиальных реакций в энтероидных моделях включает экспрессию генов путем секвенирования РНК, биомаркеры с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) или передовые методы визуализации. Метод, представленный здесь, обеспечивает еще один возможный вариант измерения валовой проницаемости с помощью флуорометрии.

Повреждение кишечника у недоношенных детей имеет многофакторный патогенез, который включает в себя дисбаланс микробного сообщества кишечника. Энтероиды могут обеспечить отличные модели для изучения определенных аспектов преждевременных кишечных заболеваний, таких как некротизирующий энтероколит, которые включают функции эпителия¹¹. Энтероиды проявляют те же характеристики, что и кишечник плода человека¹⁰. Воздействие энтероидов на липополисахарид (ЛПС), эндотоксин, продуцируемый грамотрицательными бактериями, в культуральной среде в качестве базолатерального воздействия индуцирует экспрессию генов, которая может привести к увеличению воспаления и кишечной проницаемости⁷. Это исследование направлено на оценку изменений в валовой проницаемости эпителия после апикального воздействия бактериальных продуктов, таких как ЛПС. Результаты могут дать представление о микробно-эпителиальных взаимодействиях, участвующих в патогенезе повреждения кишечника. Метод, предназначенный для проверки валовой проницаемости, требует микроинъекционной установки и навыков.

протокол

Коллекция тканей человека была одобрена Советом по институциональному обзору Вашингтонского университета (идентификатор исследования: STUDY380 и CR ID: CR3603) и выполнена Исследовательской лабораторией врожденных дефектов. Исследовательская лаборатория врожденных дефектов была поддержана наградой NIH No 5R24HD000836 от Национального института детского здоровья и развития человека Имени Юнис Кеннеди Шрайвер. Образцы были собраны у согласных участников и отправлены как обезличенные и без какой-либо медицинской информации. Образцы тонкой кишки хранились в ледяном фосфатно-буферном солевом растворе Dulbecco (DPBS) и отправлялись на ночь в приемную лабораторию.

1. Подготовка реагентов

ПРИМЕЧАНИЕ: Список реагентов и каталожные номера приведены в Таблице материалов ; рекомендуемые объемы предназначены для плиты с 6 скважинами, если не указано иное.

1. Приготовьте 0,1% бычьего сывороточного альбумина (BSA), растворив 50 мг порошка BSA в 50 мл фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS) со 100 мкг / мл антибиотика широкого спектра действия примоцина для покрытия всей пластиковой посуды и наконечников, которые контактируют с тканями или энтероидами.
   1. Чтобы покрыть BSA, поместите нефильтрованные наконечники пипеток в коническую трубку объемом 50 мл с достаточным количеством BSA для покрытия наконечников, добавьте 1-2 мл BSA для покрытия поверхности чашки Петри или заполните конические трубки BSA объемом 15 мл в течение не менее 20-30 минут при комнатной температуре перед использованием.
2. Готовят среду DPBS путем смешивания 50 мл DPBS со 100 мкг/мл примоцина и 50 мкг/мл гентамицина. Приготовьте эту среду с амфотерицином 2,5 мкг/мл и без него.
3. Получают энтероидные питательные среды, смешивая 2 мл органоидной питательной среды, 100 мкг/мл примоцина, 10 мкМ Y27632 и 2,5 мкМ CHIR99021. Ежедневно готовьте свежие носители и нагревайте их в инкубаторе клеточных культур при 37 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Коэффициент разрежения для Y27632 составляет 1:250. Для CHIR99021 разбавьте раствор CHIR до 1:100 в теплых средах, а затем до 1:40 в энтероидных питательных средах для достижения разбавления 1:4000.
4. Готовят матричную смесь базальной мембраны, добавляя в запас основную мембранную матрицу 10 мкМ Y27632 и 2,5 мкМ CHIR99021. Сделайте в общей сложности 285 мкл окончательной смеси матрицы базальной мембраны при концентрации белка 8 мг/мл для одной лунки 6-луночной пластины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Основная мембранная матрица должна быть ледяной, чтобы оставаться в жидкой форме и затвердевать при более высоких температурах. Концентрация белка в матрице базальной мембраны определяет объем, необходимый для получения конечной концентрации белка 8 мг/мл, используя уравнение:
   Объем 1 × Концентрация 1 = Объем 2 × Концентрация 2
5. Приготовьте 4% параформальдегида (PFA), разбавив 32% запаса PFA в PBS на 1:8, и храните при комнатной температуре. Сделайте 0,5 мл на каждую лунку энтероидов, подлежащих фиксации.
6. Приготовьте блокирующий буфер, добавив 5% козьей сыворотки и 0,5% Тритона X-100 в PBS. Приготовьте 1 мл для первого антитела на лунку и 0,5 мл для дополнительного антитела на лунку.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сыворотку того же вида, что и хозяин вторичных антител
7. Получают первичные и вторичные антитела, разведенные в блокирующем буфере в концентрации, рекомендованной производителем для каждого антитела.
8. Готовят 5 мкг/мл дмидино-2-фенилиндола (DAPI) путем разбавления до 1:200 из 1 мг/мл стандартного раствора в PBS. Внесите 0,5 мл на лунку окрашенных энтероидов.
9. Приготовьте 70% глицерина в PBS и сделайте 0,5 мл для установки энтероидов на предметные стекла микроскопа.
10. Готовят 5 мг/мл декстран-ФИТЦ (флуоресцеин-изотиоцианат), разбавляя 25 мг/мл раствора в PBS в соотношении 1:5. Сделайте 20 мкл для микроинъекции.
11. Приготовьте липополисахариды (ЛПС) и декстран-ФИТЦ путем восстановления порошка ЛПС в ПБС до 5 мг/мл раствора. Разбавляют стоковые растворы ЛПС и декстрана в ПБС до 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл ЛПС и 5 мг/мл декстрана-ФИТЦ. Сделайте 20 мкл для микроинъекции.
12. Получают этиленгликоль-бис(β-аминоэтиловый эфир)-N,N,N',N',N'-тетрауксусную кислоту (ЭГТА), сделав запасной раствор 0,2 М путем растворения порошка ЭГТА в дистиллированной воде и регулировки рН примерно до 8 с использованием соляной кислоты (HCl). Подготовьте испытательную концентрацию 2 мМ в питательных средах, выполнив разбавление 1:100.

2. Коллекция образцов

1. Как только образцы получены, выполните изоляцию эпителиальных клеток и покрытие в течение 24 часов после сбора образцов.

3. Покрытие эпителиальных клеток кишечника в матрице базальной мембраны из целых образцов

ПРИМЕЧАНИЕ: Эта процедура следует модифицированным протоколам лаборатории моделирования трансляционных тканей Мичиганского университета 12,13,14. Использование питательных сред с высоким коэффициентом Wnt дает последовательные результаты для энтероидного образования. Как только энтероиды установлены, используйте те же среды с высоким коэффициентом Wnt, чтобы привести энтероиды к сферическим формам для микроинъекции.

1. Переложите сегменты кишечника в чашку Петри размером 60 мм х 15 мм с ледяным DPBS с амфотерицином и замочите на льду в течение 20 мин. Пока ткань пропитывается, определите области (двенадцатиперстная кишка, тощая кишка или подвздошная кишка) тонкой кишки и удалите соединительную ткань и кровеносные сосуды щипцами и ножницами. Вымойте содержимое просвета по мере необходимости, используя небольшую иглу 23-25 г и шприц 3 мл без нарушения эпителия.
2. Нарежьте сегменты кишечника на кусочки по 3-5 мм с помощью скальпеля и поместите 1-2 кусочка (для обшивки в одну лунку 6-луночной пластины) в чашку Петри размером 35 мм х 15 мм, содержащую на льду 0,5-1 мл органоидной питательной среды.
3. С помощью рассечения микроножницы и щипцы разрезают кишечную трубку продольно. Используйте кончик щипцов, чтобы соскоблить эпителиальные клетки с фасции под 10-кратным стереомикроскопом. Удалите фасцию и закрутите блюдо, чтобы разбить сгустки клеток.
4. Используйте наконечник пипетки объемом 20 мкл для переноса клеток и среды с шагом 5-10 мкл в матричную смесь базальной мембраны, чтобы получить раствор 285 мкл при концентрации матричного белка 8 мг/мл. Пипетка вверх и вниз медленно 20x для смешивания клеток в матрице базальной мембраны на льду с помощью разрезанного наконечника 200 мкл.
5. Поместите пять 50 мкл полосок матрицы клеточной базальной мембраны в одну лунку предварительно нагретой 6-луночной пластины, хранящейся на теплом пенопластовом кирпиче. Инкубируют пластину в инкубаторе клеточной культуры при 37 °C и 5% CO₂ в течение 10 мин, чтобы позволить матрице базальной мембраны полимеризоваться и затвердеть.
6. Добавьте 2 мл энтероидной среды роста в лунку затвердевших полосок матрицы базальной мембраны и поместите обратно внутрь инкубатора клеточной культуры. Ежедневно меняйте медиа, чтобы стимулировать рост энтероидов. Ежедневно проверяйте дифференцировку кишечных стволовых клеток под 10-кратным инвертированным микроскопом.
7. Через 10-14 дней пропускают энтероиды в одну лунку из 12-луночной или 6-луночной пластины в зависимости от плотности энтероидов. Начните менять медиа через день и проходите в соотношении 1:2 каждые 5-7 дней, когда энтероиды начнут процветать.
   1. Удаляют клетки, которые не дифференцируются в энтероиды, с помощью матричного слоя базальной мембраны во время проходов. Создайте замороженный запас энтероидов с низким проходом, заморозив их в 80% питательной среде, 10% фетальной бычьей сыворотке (FBS) и 10% диметилсульфоксиде (DMSO), если это необходимо.

4. Иммунофлуоресцентное окрашивание энтероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс фиксации и окрашивания занимает 3 дня. В этом протоколе мы фиксировали и окрашивали ядра (DAPI), эпителиальные маркеры (villin, CDX2), лизоцим, муцин и белки плотного соединения (клаудин 2, клаудин 3, окклюдин, zonula occluden-1) с использованием модифицированного протокола¹⁵. Флуоресцентные снимки были сделаны конфокальным микроскопом.

1. Закрепление
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс обычно выполняется одновременно с энтероидным проходом или процедурой замораживания.
   1. Поместите энтероидную пластину на лед. Удалите питательные среды и аккуратно промыть 2x холодными DPBS.
   2. Определите энтероиды, подлежащие фиксации и окрашиванию. Переложите их на 12-луночную пластину, тщательно пипетировав их режущим наконечником объемом 200 мкл или используя инокуляторную петлю объемом 1 мкл. Поместите энтероиды в отдельные лунки, если необходимо провести окрашивание различными антителами.
   3. Удалите как можно больше жидкости кончиком объемом 200 мкл, не нарушая энтероиды. Добавьте 0,5 мл 4% PFA и инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре. Время от времени закручивайте пластину, чтобы облегчить отслоение энтероидов от матрицы базальной мембраны.
   4. Исследуют грубо, чтобы определить отслоение энтероидов от матрицы базальной мембраны. Осторожно аспирируйте и выбросьте жидкий PFA, не нарушая энтероиды. Промывка с PBS 3x для удаления PFA и любой остаточной матрицы базальной мембраны
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирация жидкости под стереомикроскопом может быть полезна для предотвращения энтероидов. Фиксированные энтероиды могут храниться в PBS при 4 °C до 1 месяца.
2. Блокировка
   1. Осторожно удалите остатки PBS пипеткой 200 мкл, не нарушая энтероиды. Добавить 0,5 мл блокирующего буфера и инкубировать в течение 2 ч при комнатной температуре.
   2. Извлеките и выбросьте блокирующий буфер с помощью пипетки 200 мкл, стараясь избежать нарушения энтероидов.
3. Окрашивание антителами
   1. Добавьте 500 мкл первичного антитела в блокирующий буфер к каждой лунке с энтероидами. Для первичных антител и для лизоцима коэффициент разбавления равен 1:100, для CDX2 коэффициент разбавления равен 1:100, а для виллина коэффициент разбавления равен 1:50. Инкубировать при 4 °C в течение ночи.
   2. На следующий день удалите раствор антител и промыть 3 раза PBS. Подождите 10-15 минут инкубационного времени для каждой стирки.
   3. Повторите шаги 4.3.1.-4.3.2. для вторичного антитела с коэффициентом разведения 1:400.
   4. Добавьте 500 мкл DAPI при 5 мкг/мл в PBS и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 мин. После инкубации промыть 3 раза PBS и дать 10-15 минут инкубационного времени для каждой промывки
4. Установка
   1. Удалите как можно больше PBS. Промыть окрашенные энтероиды 70% глицерином 1x.
   2. Поднимите энтероиды из пластины с помощью инокуляционной петли объемом 1 мкл или разрезанного наконечника объемом 200 мкл и установите с 70% глицерином на предметное стекло микроскопа.
   3. Чтобы сохранить 3D-структуру энтероидов, обеспечьте пространство 0,5-1 мм между нижним стеклянным слайдом и крышкой. Используйте вырезы из тонкого силиконового резинового листа или стеклянной крышки, чтобы создать пространство между стеклянной горкой и крышкой. Энтероиды теперь можно визуализировать с помощью конфокального микроскопа.

5. Подготовка к микроинъекции энтероидов

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол микроинъекции является модифицированным протоколом от Hill et ^al.16 в соответствии с ресурсами и настройками. Некоторые из подготовительных шагов должны быть завершены за несколько дней.

1. Настройка микроинъекционной установки
   1. Установите микроинжекторный аппарат либо внутри шкафа биобезопасности, либо на чистый счетчик, в зависимости от цели экспериментов, следующим образом: стереомикроскоп для просмотра, микроманипулятор с регулятором осей X,Y и Z, установленный на тяжелой подставке рядом с микроскопом, держатель микропипетки, установленный на кронштейне микроманипулятора, трубка микроинжектора, соединяющая держатель микропипетки, и шприц с трехсторонним запорным краном, затем к пневматическому насосу и настенному источнику воздуха, подключенному к насосу (рисунок 1).
   2. Дезинфицируйте микроинъекционный аппарат 70% этанолом перед экспериментальным использованием и после него. Проверьте позиционирование микроскопа и микроманипулятора в соответствии с желаемыми физическими характеристиками, включая перемещение осевых ручек, чтобы микропипетка могла достичь целевого образца.
2. Приготовление микропипетки
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните эти действия заранее.
   1. Используйте съемник микропипетки, чтобы втянуть стеклянные капиллярные трубки в микропипетки.
   2. Под стереомикроскопом поместите микропипетку на горизонтальный держатель микропипетки (рисунок 2), сосредоточьтесь на наконечниках и вырежьте наконечники с помощью микроножников, глядя через окуляры микроскопа. Подготовьте около 10-15 микропипеток с одинаковым размером наконечника для каждого эксперимента.
   3. Проверьте размер наконечника, подтянув 0,5-1 мкл жидкости, и посчитайте, сколько насосов необходимо для опорожнения объема. Протестируйте несколько размеров наконечников, чтобы найти подходящий размер для эксперимента. Соответствующий размер наконечника выбрасывает примерно 10-30 нЛ объема на насос.
   4. Храните нарезанные стеклянные микропипетты в чистой коробке или трубке, не повреждая наконечники.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Предварительно нарезанные микропипетты доступны в продаже.
3. Энтероидная подготовка
   1. Поместите на лед пластину, состоящую в основном из крупных и сферических энтероидов. Замените старую питательную среду свежей.
   2. Осторожно отделите точки матрицы базальной мембраны от пластины с помощью клеточного лифтера. Закрутите гелевые точки из стороны в сторону на льду, чтобы разрушить матрицу базальной мембраны, не нарушая энтероиды.
   3. Выберите около 10-15 сферических энтероидов с вырезанным наконечником пипетки 20 мкл под стереомикроскопом и добавьте к матрице базальной мембраны, чтобы получить 285 мкл смеси белковой концентрации 8 мг / мл.
   4. Аккуратно пипетируйте вверх и вниз с помощью разрезанного наконечника объемом 200 мкл, чтобы смешать энтероиды, не ломая их. Пластина пяти 50 мкл гелевых точек в центре круглой чашки 35 мм х 10 мм для культуры клеток Петри или одной с аналогичными размерами.
   5. Инкубировать энтероидные гелевые точки при 37 °C в течение 10 мин для затвердевания. Затем добавьте в блюдо 1 мл свежей питательной среды. Инкубируют энтероиды в течение не менее 2-3 дней для стабилизации и до тех пор, пока энтероиды не достигнут соответствующего размера 0,5-1 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Важно иметь блюдо с низкой стенкой для более легкого доступа к энтероидам и небольшим диаметром для меньшего объема питательной среды.
4. Микроинъекция декстран-ФИТЦ и испытуемого материала
   1. Выключите трехсторонний запорный кран на пневматический насос. Заполните микропипетку введенным материалом, в данном случае декстран-ФИТЦ с ЛПС или без него.
   2. Приготовьте чашку Петри, покрытую полоской прозрачной пленки. Поместите на пленку две-четыре точки введенного материала по 1 мкл.
   3. Используйте микроманипулятор, чтобы загнать наконечник микропипетки прямо внутрь жидкости, но над пленкой под визуализацией стереомикроскопа. Осторожно потяните за шприц, чтобы вывести введенный материал в микропипетку.
   4. Наполните микропипетку 2-4 мкл введенного материала и надавите на шприц, чтобы удалить любой воздух на кончике микропипетки. Осмотрите колонку впрыскиваемого материала в микропипетке, чтобы убедиться, что в ней нет воздушного кармана. Запишите объем вводимого материала, который выводился внутрь микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Жидкость видна в зеленоватом цвете благодаря декстран-ФИТК.
   5. Включите источник воздуха, подключенный к пневматическому насосу, который обеспечивает давление воздуха примерно 60 фунтов на квадратный дюйм. Включите насос и установите длительность насоса на 10-15 мс. Поверните запорный кран на шприце, чтобы открыть линию от насоса до микропипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Большая продолжительность насоса позволяет выделять больше материала на насос. Для оценки объема впрыска рекомендуется использовать одинаковую продолжительность насоса и микропипетты с одинаковыми размерами наконечников.
   6. Удалите энтероиды из инкубатора клеточной культуры и поместите посуду поверх теплого пенопластового кирпича в закрытый контейнер, чтобы ограничить воздействие света после микроинъекции.
   7. Поместите чашку Петри с энтероидами под стереомикроскоп и переместите ручки микроманипулятора, чтобы поместить наконечник микропипетки под углом около 35°-45° к горизонтальной поверхности (рисунок 3). Это требует некоторой практики заранее.
   8. Визуализируйте и нанесите на карту энтероиды в каждой чашке Петри под микроскопом, чтобы составить план введения около 3-5 сферических энтероидов на чашку.
   9. Как только кончик микропипетки приблизится к поверхности жидкости, посмотрите в окуляры микроскопа, чтобы продвинуть наконечник к целевому энтероиду.
   10. Проколите энтероид кончиком микропипетки, продвигая ручку оси Z точным медленным движением. Энтероидная стенка будет сжиматься и выскакивать назад, как только наконечник проходит через энтероидную поверхность, и в этот момент продвижение должно прекратиться.
   11. Нажмите на педаль насоса одной ногой и заполните энтероид зеленоватым раствором декстран-FITC до тех пор, пока он не будет слегка расширен. Запишите количество насосов, чтобы рассчитать перекачиваемый объем и концентрацию декстрана.
   12. Извлеките кончик микропипетки после завершения микроинъекции и перейдите к следующему энтероиду. С практикой процесс может пройти гладко.
       1. Если наконечник сломался, замените его другой микропипеткой с аналогичным размером наконечника. Вытяните достаточный объем вводимого материала для всех энтероидов в одной группе воздействия и измените микропипетку между вводимыми материалами, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
   13. Поместите введенное энтероидное блюдо под крышку, чтобы избежать воздействия света.
5. Сбор и измерение Декстран-ФИТЦ
   1. После процедуры микроинъекции немедленно удалить культуральную среду. Промыть свежей питательной средой 2x, чтобы удалить остатки декстран-FITC. Добавьте свежие носители и запишите время как время 0 после микроинъекции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вам может понадобиться второй человек, чтобы выполнить этот шаг, не нарушая процесс микроинъекции.
   2. Собрать 200 мкл культуральной среды в непрозрачной микрофузионной трубке объемом 0,5 мл, а затем заменить удаленную культуральную среду тем же объемом свежей питательной среды через 1 ч, 2 ч, 4 ч, 6 ч, 8 ч, 10 ч и 12 ч после микроинъекций.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Временной интервал может варьироваться в зависимости от эксперимента. При базолатеральном воздействии замещающие среды должны содержать экспозицию в той же концентрации.
   3. Хранят собранные питательные среды при 4 °C и измеряют концентрацию декстрана в течение 24 ч. Храните остатки среды при температуре −80 °C для других анализов. В конце сбора питательных сред собирают энтероиды для экстракции РНК или визуализации, если это необходимо.
   4. Измерьте концентрации декстран-ФИТК с помощью флуоресцентного микропластичного считывателя. Постройте стандартную кривую для каждой пластины, используя последовательные разбавления и установив линию линейной регрессии, как показано на рисунке 4.
   5. Корректировать абсорбцию для удаленного объема культуральной среды, содержащей декстран, которая была заменена свежей питательной средой без декстрана, следующим образом: удаление 200 мкл из 2 мл культуральной среды составляет 10% по объему.
      Скорректированное поглощение через 2 ч = (поглощение при 1 ч х 10%) + измеренное поглощение через 2 ч
      Поглощение первой скорректированной среды не нуждается в коррекции. Затем рассчитайте концентрацию декстрана из скорректированного значения поглощения, используя стандартное уравнение кривой.
   6. Для нормализации разделите концентрацию декстрана на общее количество насосов для каждой чашки Петри, а затем умножьте на наибольшее общее количество насосов на чашку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все экспозиции проводятся в трех экземплярах (три чашки Петри на экспозицию с 3-5 микроинъективами на чашку). Средние значения трипликатов сравниваются между экспозициями с помощью t-теста Студента.

Результаты

Мы установили энтероидную клеточную линию из донорской ткани плода подвздошной кишки в соответствии с модифицированными протоколами, предоставленными нашими сотрудниками в Лаборатории моделирования трансляционных тканей Мичиганского университета¹². Энтероидная клеточная линия дала отрицательный результат на микоплазменную инфекцию. Энтероиды окрашивались положительно на виллин, CDX2, лизоцим, муцин, клаудин, окклюдин и зонула-окклюден 1 (рисунок 5), подтверждая их эпителиальное происхождение тонкой кишки. Энтероиды были микроинъецированы декстран-FITC 4 кДа при 5 мг/мл в PBS (рисунок 6). Тестовые воздействия представляли собой ЛПС в различных концентрациях, 0,1 мг/мл и 0,5 мг/мл, смешанные с декстран-ФИТЦ для апикального воздействия. В качестве положительного контроля мы использовали 2 мМ EGTA и добавляли его в культуральную среду через 4 ч после микроинъекции декстрана. EGTA является хелатором кальция, который увеличивает проницаемость плотных соединений. Отрицательные контрольные группы были микроинъецированы декстран-ФИТЦ только в PBS. Для базолатерального воздействия замещающая среда для сбора серийных питательных сред имела одинаковую концентрацию экспозиции (т.е. 2 мМ EGTA). Результаты показывают явное увеличение концентрации декстрана в питательных средах после добавления EGTA по сравнению с отрицательным контролем PBS. Апикальное воздействие ЛПС индуцировало более высокую проницаемость декстрана, начиная примерно через 8 ч после воздействия концентрационно-зависимым образом (рисунок 7).

Рисунок 1: Установка микроинжектора. Установка включает в себя стереомикроскоп, микроманипулятор, установленный на магнитной подставке на тяжелой стальной опорной пластине, держатель микропипетки, соединенный со шприцем с трехсторонним запорным краном, и пневматический насос. Подача воздуха в стену обеспечивает давление воздуха, которое регулируется насосом для создания постоянного объема насоса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Горизонтальный держатель микропипетки. Эта пластиковая платформа предназначена для удержания микропипетки после вытягивания стеклянной капиллярной трубки для резки наконечника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Позиционирование микропипетки. Угол 35°-45° идеально подходит для инъекций энтероидов, расположенных в середине чашки Петри. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Стандартная кривая Декстрана. Кривая построена с флуоресцентным поглощением 10 последовательных разбавлений декстрана в дубликатах. Для создания уравнения регрессии была установлена линия линейной регрессии. Панели ошибок являются SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Флуоресцентные биомаркеры энтероидов. DAPI для окрашивания ядра синий. Показаны следующие биомаркеры: (A) виллин, (B) CDX2, (C) лизоцим, (D) муцин, (E) клаудин, (F) окклюдинг и (G) зонула-окклюден 1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Энтероиды на разных стадиях. (А) Энтероид в возрасте 7-10 дней маленький и с толстой стенкой. (B) Энтероид, готовый к микроинъекции с большим размером, просветом и мысленной стенкой, и (C) флуоресцентный декстран-FITC внутри энтероида через 2 дня после микроинъекции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Проницаемость декстран-ФИТЦ после микроинъекции. (А) Измеренные уровни декстрана в средах были выше после добавления EGTA по сравнению с PBS. (B) Микроинжекция 0,5 мг/мл ЛПС вызывала большую утечку декстрана из энтероидного просвета в среду, чем микроинжекционированная 0,1 мг/мл ЛПС, начиная с 8 ч после инъекции. *p-значение < 0,05, полосы ошибок SEM, n = 3, для расчета значимости использовался t-тест Стьюдента. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Этот протокол детализирует установление энтероидов из кишечной ткани плода, а также характеристику модели с иммунофлуоресцентным окрашиванием и тестированием проницаемости эпителия. Проницаемость энтероидов проверяли с использованием метода микроинъекции и последовательных измерений с течением времени утечки концентрации декстран-ФИТК в культуральной среде. Новизна этого протокола заключается в апикальном воздействии, которое более близко напоминает физиологию кишечника человека по сравнению с базолатеральным воздействием в культуральной среде⁷. В предыдущих исследованиях Hill et al. использовали серийную визуализацию и расчет интенсивности флуоресценции во времени¹⁶. Ares et al. подвергли ЛПС базолатеральную мембрану эпителиальной модели, а затем сравнили схему экспрессии клеточных генов⁷. Для сравнения, мы используем апикальное воздействие испытуемых реагентов, а затем исследуем потенциальные изменения валовой проницаемости путем измерения серийных концентраций просочившегося декстрана в питательных средах. Наш метод также позволяет проводить серийный сравнительный анализ цитокинов, продуцируемых эпителиальными клетками в культуральных средах и экспрессии генов путем сбора клеточной мРНК. ЛПС обычно используется для изучения повреждения кишечника на животных и в моделях in vitro из-за его способности индуцировать проницаемость и воспаление ^7,17. Когда ЛПС тестировался в этой модели, проницаемость эпителия дифференцировалась по концентрации воздействия. Этот протокол может быть расширен для изучения других патологий заболевания с использованием различных микроинъекционных материалов и измерений результатов.

Критические шаги в этом протоколе включают установление энтероидов из тканей кишечника плода, энтероидную характеристику и технику микроинъекции. Целостность этого исследования зависит от точного отбора проб клеток. Использование анатомических ориентиров и кровеносных сосудов полезно для обеспечения отбора клеток тонкого кишечника. Из-за устойчивого роста и дифференцировки стволовых клеток кишечника плода обширная процедура выделения стволовых клеток из других эпителиальных клеток не требуется. После того, как энтероиды были установлены, важно подтвердить характеристики модели путем окрашивания белков и клеточных маркеров. В этом протоколе энтероиды были окрашены для энтероцитов с использованием виллина и CDX2, клеток Панета с использованием лизоцима и бокаловидных клеток с использованием муцина, все клетки, которые находятся в эпителии тонкой кишки 18,19,20. В отличие от традиционных одиночных клеточных линий, которые отображают один тип клеток, энтероиды устанавливают все типы клеток из стволовых клеток-предшественников кишечника⁸. Окрашивающая часть этого протокола может быть модифицирована для конкретных клеточных маркеров, представляющих интерес. Решающее значение для надежности этого протокола имеет метод микроинъекции. Консистенцию наконечников микропипетки можно проверить, измерив объем на насос с помощью раствора декстран-ФИТЦ и визуализировав диаметр наконечников под микроскопом. Из-за риска загрязнения одна и та же микропипетка не может использоваться более чем для одного воздействия. Кроме того, на форму и рост энтероидов может влиять содержимое их питательных сред. Мы обнаружили, что сферические, а не цветные энтероиды обеспечивают лучшие модели для микроинъекции. Сферическая форма может быть индуцирована большим коэффициентом Wnt в среде²¹.

Этот протокол во многом зависит от навыков исполнителя в микроинъекции, чтобы уменьшить вариации, особенно в чувствительных ко времени измерениях. Вариации могут быть сведены к минимуму, имея одного и того же опытного исполнителя с последовательными методами, используя одно и то же происхождение клеток, чтобы избежать генетической изменчивости, тестирование на одном и том же проходе для устранения смещения зрелости и выращивание клеток в одном и том же типе среды для аналогичной дифференцировки клеток. Компоненты питательной среды могут индуцировать различную дифференцировку стволовых клеток in vitro , а не в среде in vivo . Например, in vivo лизоцим не экспрессируется до 22-24 недель гестационного развития, когда клетки Панета формируются и становятся функциональными²². Тем не менее, мы смогли обнаружить лизоцим в наших энтероидах, установленных из 10-недельного кишечника плода. Этот метод может ограничить количество тестируемых воздействий за один раз из-за высоких технических навыков, необходимых для микроинъекции. Утечка декстрана из прокола микроинъекционного отверстия может повлиять на оценку проницаемости. Для устранения этого эффекта сразу после микроинъекции рекомендуется тройные промывания для удаления остатков декстрана из процедуры. Концентрацию декстрана в средах следует измерять ежечасно в течение 4-6 ч после микроинъекции. Эксперименты со значительным повышением концентрации декстрана в течение 2-4 ч после инъекции следует исключить из итогового анализа.

Этот метод имеет ряд преимуществ. Это требует более низкой стоимости и меньших ресурсов по сравнению с монослоями энтероидного происхождения на трансвелле. Кроме того, он может быть расширен на другие воздействия, такие как живые бактерии или вирусы, для изучения первоначального взаимодействия между кишечными микробами и эпителием. Закрытый просвет энтероида может поддерживать стабильный рост микроинжекционных живых бактерий без загрязнения среды роста¹³. В отличие от монослоя, подвергающегося воздействию питательных сред и инкубационного кислорода, закрытый просвет представляет собой плотное, изолированное пространство. Закрытый просвет не обеспечивает связи со средой роста и содержанием кислорода в просвете, которое со временем ниже при росте живых бактерий¹³.

Использование кишечной ткани плода более точно изображает кишечный эпителий недоношенных детей по сравнению со взрослыми кишечными стволовыми клетками или животными моделями⁷. Кроме того, полярность энтероидов позволяет проводить как апикальное, так и базолатеральное воздействие и измерения²³. Энтероиды образуют замкнутый просвет с более низкой концентрацией оксигенации, который более точно имитирует концентрацию оксигенации кишечника²⁴. В отличие от более технологически продвинутых протоколов¹⁶, использование валовых измерений среды обеспечивает большую доступность этого метода. Эксперимент показал, что утечка эпителия может быть вызвана апикальным воздействием ЛПС и зависит от концентрации. Поскольку этот метод исследует изменения в утечке концентрации декстрана, он полезен для обнаружения грубых функциональных изменений в плотных соединениях. Сбор матричной РНК и секвенирование обнаженных энтероидов и анализ вестерн-блот могут дополнять анализ грубых функциональных изменений. Эта модель изучает целостность кишечного эпителия в системе, которая очень напоминает преждевременную среду и, таким образом, может быть использована для лучшего понимания преждевременных травм кишечника и других патологий заболеваний.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotericin 250 uL/mL	Gibco	15-290-026
Anti-CDX-2 [CDX2-88] 0.5mL concentrated Mouse, IgG, monoclonal	Biogenex	MU392A-5UC
Anti-Claudin 2 antibody (ab53032)	abcam	ab53032
Anti-Claudin 3 antibody (ab15102)	abcam	ab15102
Anti-LYZ antibody produced in rabbit	Millipore Sigma	HPA066182-100UL
Anti-Mucin 2/MUC2 Antibody (F-2): sc-515032	Santa Cruz	sc-515032
Anti-Villin, Clone VIL1/4107R 0.5mL concentrated Rabbit, IgG, monoclonal	Biogenex	NUA42-5UC
Bovine Serum Albumin (BSA)	Millipore Sigma	A8806
Cell culture plates, CytoOne 12-well non-treated plates	USA Scientific Inc	50-754-1395
Cell culture plates, CytoOne 6-well non-treated plates	USA Scientific Inc	50-754-1560
Centrifuge with 15 mL tube buckets	Eppendorf	05-413-110
CHIR 99021	Tocris Bioscience	4423
Confocal microscope	Olympus FV1200	N/A	Or a similar microscope
Conical centrifuge tubes, 15 ml	Falcon	05-527-90
Cover glass for microscope slides	Fisher Scientific	12-544-DP
Disposable scalpels	Mopec	22-444-272
Dmidino-2-phenylindole (DAPI) Solution (1 mg/mL)	Fisher Scientific	62248
Dulbecco's Phosphate-buffered Saline (DPBS, 1X)	Fisher Scientific	AAJ67802K2
Ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid tetrasodium salt (EGTA)	Millipore Sigma	E8145-10G
Fluorescein isothiocyanate dextran (Dextran-FITC) 4 kDa	Millipore Sigma	46944
Fuorescence microplate reader	Agilent BioTek	Synergy HTX
Gentamicin 50 mg/mL	Gibco	15-750-060
Glass capillary tubes, single-barrel borosilicate, 1x0.5mm, 6" (cut in half before pulling)	A-M systems	626500
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 594	Fisher Scientific	A32742
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Fisher Scientific	A32731
Goat Serum	Fisher Scientific	16210064
ImageJ software	NIH	N/A	https://imagej.nih.gov/ij/download.html
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stem Cell  Technologies	06010
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4	Millipore Sigma	L4391-1MG
Magnetic stand	World Precision Instruments	M10
Matrigel Basement Membrane Matrix, LDEV-free, 10 mL	Corning	354234	protein concentration > 9 mg/mL preferably
Micro forceps	Fisher Scientific	13-820-078
Micro scissors	Fisher Scientific	08-953-1B
Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301
Micropipette puller	World Precision Instruments	SU-P1000	Or a similar equipment
Microscope slides	Fisher Scientific	22-034486
Occludin Polyclonal Antibody	Fisher Scientific	71-1500
Paraformaldehyde 32% aqueous solution	ELECTRON MICROSCOPY SCIENCES	RT 15714
Petri Dishes, 35x10 mm	Fisher Scientific	150318
Petri Dishes, 60x15 mm	Fisher Scientific	12-565-94
Phosphate Buffered Saline (PBS)	Fisher Scientific	10010031
PicoPump foot switch	World Precision Instruments	3260
Pipette tips, non-filtered, 1000 uL	Fisher Scientific	21-402-47
Pipette tips, non-filtered, 20 uL	Fisher Scientific	21-402-41
Pipette tips, non-filtered, 200 uL	Fisher Scientific	21-236-54
Pneumatic PicoPump system	World Precision Instruments	SYS-PV820	or a similar picopump system
Primocin 50 mg/mL, 10x1 ml vial	InvivoGen	ant-pm-1
Steel base plate	World Precision Instruments	5052
Stereo microscope	Zeiss stemi 350		Or a similar microscope
ThermoSafe PolarPack Foam Bricks	Sonoco	03-531-53
Triton X-100	Millipore Sigma	T8787
Wall air supply	N/A	N/A
Y-27632 dihydrochloride	Tocris Bioscience	1254
ZO-1 Polyclonal Antibody	Fisher Scientific	61-7300