Экспериментальная модель инфаркта миокарда для изучения восстановления и ремоделирования сердца у мышей с нокаутом

Резюме

В данной работе мы описываем экспериментальную модель инфаркта миокарда, процедуру эхокардиографии для изучения ремоделирования и функции сердца, а также процедуры количественной оценки фиброза и гипертрофии в участках, окрашенных в красный цвет и родамином, а также размер и индекс расширения инфаркта в срезах, окрашенных трихромом Массона.

Аннотация

Сердечно-сосудистые заболевания являются наиболее распространенной причиной смерти в западных странах, при этом наиболее распространенной формой является острый инфаркт миокарда (ИМ). В данной статье описывается протокол изучения роли галектина 3 (Gal-3) во временной эволюции заживления и ремоделирования сердца на экспериментальной животной модели ИМ.

Описанные процедуры включают экспериментальную модель ИМ с постоянной коронарной лигатурой у самцов мышей C57BL/6J (контроль) и нокаута Gal-3 (KO), процедуру эхокардиографии для изучения ремоделирования сердца и систолической функции in vivo, гистологическую оценку интерстициального фиброза миокарда с окрашенными в красный цвет пикрозириусом и окрашенными лектином родамином срезами для изучения гипертрофии миоцитов по площади поперечного сечения (MCSA), а также количественная оценка размера инфаркта и ремоделирования сердца (истончение рубца, толщина перегородки и индекс расширения) с помощью планиметриметрии в срезах, окрашенных трихромом Массона и трифенилтетразолием хлоридом. Гал-3 У мышей с КО с ИМ наблюдалось нарушение ремоделирования сердца и увеличение коэффициента истончения рубцов и индекса расширения. В начале ИМ функция миокарда и ремоделирование сердца также были серьезно нарушены. Через 4 недели после ИМ также была нарушена естественная эволюция фиброза у инфарктированных мышей Gal-3 KO.

Таким образом, экспериментальная модель ИМ является подходящей моделью для изучения временной эволюции восстановления и ремоделирования сердца у мышей с генетической делецией Gal-3 и других животных моделей. Недостаток Gal-3 влияет на динамику восстановления сердца и нарушает развитие ремоделирования и функции сердца после ИМ.

Введение

Инфаркт миокарда (ИМ) является наиболее распространенной формой сердечно-сосудистых заболеваний. После ИМ миокард претерпевает последовательные морфологические и функциональные изменения, включая заживление зоны инфаркта ИМ, ремоделирование желудочков (ВР) и дисфункцию миокарда¹. Заживление ИМ является динамичным и хорошо организованным процессом, связанным с глубокой воспалительной инфильтрацией, которая заканчивается образованием фиброзного рубца ^2,3. Экспериментальная модель ИМ у мышей в настоящее время используется для изучения ремоделирования сердца при патологических состояниях4,5, и осведомленность о точном хирургическом протоколе имеет важное значение для разработки воспроизводимой и эффективной процедуры индуцирования постоянной коронарной лигатуры. Этот метод необходим для изучения заживления ИМ и его значимости во временной эволюции ремоделирования левого желудочка (ЛЖР) и сердечной дисфункции, связанной с ИМ.

Галектины — это группа лектинов, которые распознают специфические углеводы во внутриклеточных лигандах, мембранных рецепторах и внеклеточных гликопротеинах. Галектин 3 (Gal-3) является членом этого семейства, который действует посредством распознавания и сшивания N- и O-гликанов в гликоконъюгатах на поверхности клеток, и широко экспрессируется в иммунной системе⁶. В предыдущих исследованиях изучалась роль Gal-3 в качестве регулятора воспаления и фиброза при сердечно-сосудистых заболеваниях 7,8,9,10,11,12. Поскольку нацеливание на регуляторные факторы воспаления во время заживления очень актуально, поскольку воспаление может заметно влиять на эволюцию ремоделирования, мы стремились описать протокол изучения временной эволюции ремоделирования желудочков после ИМ, а также шаги и методы для определения того, как генетическая мутация Gal-3 изменяет временную эволюцию заживления при ИМ и влияет на ремоделирование и функцию сердца у мышей.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все эксперименты, описанные в этом протоколе, были одобрены Комитетом по уходу за животными и исследованиям Университета Буэнос-Айреса (CICUAL) в соответствии с Комитетом Национального исследовательского совета (США) по обновлению Руководства по уходу за лабораторными животными и их использованию¹³. Для экспериментов использовали самцов мышей C57BL/6J и Gal-3 KO соответствующего возраста (8-10 недель) весом 30-35 г, что позволяет лучше проводить хирургические манипуляции. Предоставляйте животным доступ к воде и пище в неограниченном количестве. Мышей Gal-3 KO разводили на фоне C57BL/6J на тех же биоресурсных объектах, что и контрольных мышей C57BL/6J.

1. Операционная область и инструменты

1. Перед началом операции убедитесь, что аппарат ИВЛ подключен к источнику питания и работает правильно. Подтвердите, что имеется достаточное количество обезболивающего раствора. Приготовьте раствор в день операции, рассчитав количество животных, которые будут использоваться.
2. Убедитесь, что все хирургические инструменты стерилизованы, включая ножницы из нержавеющей стали, микроножницы, иглодержатели для больших и маленьких игл, ретракторы, особо острые изогнутые щипцы, зубчатые щипцы и тканевые щипцы. Очистите рабочую зону 70% этанолом.
3. Обеспечьте наличие небольших ватных шариков, иссопов и марли для немедленного прижигания любого потенциального кровотечения.
4. Держите готовыми от 10-0 до 7-0 плетеные шелковые шовные нити с силиконовым покрытием для лигатуры левой нисходящей коронарной артерии (ЛДА), нейлоновый шов для закрытия грудной клетки, а также льняную нить для закрытия кожи.

2. Анестезия и интубация

1. Взвесьте мышей, чтобы определить дозу анестезии.
2. Разогрейте грелку, окруженную основанием из пенополистирола, до 40 °C.
3. Обезболивают мышей внутримышечным введением 0,1 мл/10 г массы тела раствора, содержащего кетамин (65 мг/кг), ксилазин (13 мг/кг) и ацепромазин (1,5 мг/кг).
4. После того, как мышь будет обезболена, перед началом хирургической процедуры проверьте глубину анестезии, вызвав слегка болезненный раздражитель, например, надавливая на ноги пальцами. Если животное реагирует на раздражитель, отрегулируйте глубину анестезии.
5. Поместите мышь в спинное пролежни, а ее ножки прикрепите скотчем к рабочему основанию над грелкой, поместив ее под бинокулярный стереомикроскоп. Гиперэкстензируйте шейку с помощью нити, удерживающей верхнечелюстные зубы, прикрепленные к рабочему основанию.
6. Затем, для интубационной части, обнажите кольца трахеи через минимальный разрез на шее и проведите через него с помощью внутривенного катетера 20 G, подключенного к аппарату искусственной вентиляции легких для грызунов (дыхательный объем: 250 мл/удар) с частотой дыхания 34-38 циклов/мин, как описано ранее¹⁴.
7. Поместите животное в боковое пролежнем для выполнения левой боковой торакотомии в четвертом или пятом межреберье. Сделать надрез на коже животного; Понаблюдайте за мышцами внизу и осторожно распределите их, чтобы отделить их от грудной стенки, чтобы четко видеть межреберье. На этом этапе убедитесь, что животное правильно подключено к аппарату искусственной вентиляции легких; Затем откройте межреберье, проделав отверстие с помощью особо острых щипцов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: LDA должна быть идентифицируемой вдоль свободной стенки левого желудочка (ЛЖ) в межреберных пространствах, упомянутых выше.
8. Выполните перикардэктомию и определите LDA путем контрастирования коронарных артерий с коронарными венами и разветвлением LDA ниже левого предсердия. Затем выполните лигатуру LDA с помощью схемы 8-0 шелковая нить ~2 мм от края ушной раковины. Наконец, закройте грудную клетку слоями с помощью шелковой нити 6-0 - закройте ребра, следя за тем, чтобы внутри не было пневмоторакса (делайте это осторожно, заставляя легкие расширяться с помощью аппарата искусственной вентиляции легких), и подойдите к мышцам или зашите их перед закрытием кожи.
9. После того, как кожа будет закрыта, медленно отключите мышь от аппарата искусственной вентиляции легких в вентральном пролежне и удалите эндотрахеальную трубку, когда частота дыхания восстановится. Дайте животному восстановиться после анестезии в спокойной обстановке и, желательно, при стабильной комнатной температуре 27 °C.
10. Подождите, пока животные оправятся от анестезии, начнут двигать конечностями и их нормальная частота дыхания восстановится. Затем разместите их в индивидуальных клетках до окончания протокола.
11. Проделайте ту же процедуру на контрольных или фиктивно оперированных животных, но без лигатуры LDA.

3. Дизайн исследования

1. Чтобы проверить временную эволюцию заживления и ремоделирования желудочков после ИМ, рандомизируйте мышей на следующие группы:
   1. Чтобы изучить раннюю фазу ремоделирования желудочков после 1 недели развития ИМ, распределите мышей по следующим группам: 1) C57 Sham (1 неделя); 2) Гал-3 КО Шам (1 неделя); 3) C57 MI (1 неделя); 4) Гал-3 КО МИ (1 неделя).
   2. Для изучения поздней фазы ремоделирования желудочков на 4 неделе ИМ мышей разделили на следующие группы: 5) C57 Sham (4 недели); 6) Гал-3 КО Шам (4 недели); 7) C57 MI (4 недели); 8) Гал-3 КО МИ (4 недели).

4. Эхокардиография

ПРИМЕЧАНИЕ: Для эхокардиограммы мышей необходимо использовать линейные датчики с частотой более 10 МГц для правильной визуализации диаметров стенок и размеров полости. Эта процедура может быть выполнена под наркозом с внутрибрюшинным (IP) авертином в дозе 1,15 мл/кг или у животных в сознании. Тем не менее, последнее может привести к искажающим результатам у мышей с инфарктами миокарда из-за стресса и беспокойства, вызванных манипуляциями.

1. Чтобы обезболить мышь, возьмите ее в руки, прижмите спиной к ладони, а затем переверните так, чтобы достать до поверхности живота. В этом положении введите IP-анестезию под углом 45° между животным и подкожной иглой.
2. После того, как мышь будет обезболена, побрейте ее грудь и положите мышь на предварительно подогретую грелку в положение тыльной стороны пролежня. Для получения парастернального вида по длинной и короткой оси переместите преобразователь на 90°. После того, как будет получен правильный вид оси, поместите курсор на уровне папиллярных мышц, нажмите клавишу 2-D M-mode для захвата изображений и используйте программное обеспечение для анализа изображений для измерения следующих параметров:
   1. Измерьте размеры ЛЖ, включая толщину стенки (LVWT), площади LV как в систоле (S), так и в диастоле (D), а также диастолическую область левого желудочка (LVDA) и систолическую область левого желудочка (LVSA) не менее чем за три удара.
   2. Кроме того, рассчитайте функцию желудочков по фракции выброса (ФВ, %), фракции укорачивания (СФ, %) и сердечной массе (предположим, что куб без коррекции) используют уравнения (1), уравнения (2) и уравнения (3), как описано ранее¹⁵.
      SF (%) = ([LVEDD - LVESD]/LVEDD) × 100 (1)
      EF (%) = ([LVDA - LVSA]/LVDA) × 100 (2)
      Масса LV = 1,055 × ([IVST + LVEDD + PWT]³− [LVEDD]³) (3)
      Где LVEDD — конечный диастолический диаметр левого желудочка, LVESD — конечный систолический диаметр левого желудочка, IVST — толщина внутрижелудочкового пространства, а PWT — толщина задней стенки.

5. Гистологическое обследование

1. Во время вскрытия извлеките сердце из животного, открыв грудную клетку из стороны в сторону и разрезав все структуры, которые ее окружают. Очистите сгусток крови, который находится внутри полостей, слегка надавливая папиросной бумагой.
2. Соберите и взвесьте сердце на лабораторных прецизионных весах. Погрузите его в 10% формальдегид не менее чем на 72 часа при комнатной температуре. Сердцевину разрежьте вручную от верхушки до основания на поперечные ломтики толщиной 1 мм с помощью лезвия, а срезы обработайте, погрузив их в парафин. Сделайте последовательные разрезы на залитых парафином участках толщиной 5 мкм с помощью микротома.
3. Поместите каждый срез между предметными стеклами и окрасьте их гематоксилином и эозином (H&E), трихромным срезом Массона, окрашенными родамином-конъюгированным лектином, или Picrosirius red^15,16.
   1. Используя соответствующий фотомикроскоп, сделайте оцифрованные изображения с кратностью 400x для морфометрии, фиброза и количественного определения MCSA. Убедитесь, что микроскоп подключен к цифровой камере и подключен к компьютеру с программным обеспечением для анализа изображений. Для каждого морфометрического анализа убедитесь, что изображения находятся в одних и тех же областях, с минимум 10 полями высокой мощности в 400x на сечение (перегородка, инфарктная зона и удаленная зона) и без перекрытия полей.
      1. Чтобы измерить MCSA, помните о положении сердечных миоцитов и подсчитывайте только те миоциты, которые поперечно разрезаны и окружены по крайней мере тремя близлежащими капиллярами.
      2. На срезах, окрашенных в красный цвет Picrosirius, определите области рубца и перегородки и визуализируйте интерстициальный коллаген в обеих зонах. Загрузите изображения в программное обеспечение для анализа и откройте вкладку пороговых значений, чтобы выделить все положительные и отрицательные области коллагена. Для расчета процентного содержания коллагена в каждой области используйте уравнение (4), сложите коллаген-положительные зоны и разделите их на общую ткань, включая коллаген-положительные зоны, как описано в других разделах^15,16.
         Коллаген (%) = Площадь красного Picrosirius/Общая площадь тканей (4)
      3. Количественно оцените MCSA по оцифрованным изображениям, полученным из окрашенных родамином лектин-окрашенных участков образцов, залитых парафином. Чтобы получить правильное изображение, используйте программное обеспечение для анализа изображений, чтобы проследить красные контуры миоцитов, окружающих клеточные мембраны. Выберите вкладку области , обведите контуры и нажмите функцию вкладки измерения . Наконец, сохраните результаты из областей ячеек¹⁶.

6. Количественное определение размеров инфаркта и планиметрия для оценки ремоделирования сердца

1. Измерьте размер инфаркта миокарда, толщину стенки и длину эндокардиальной и эпикардиальной окружностей с помощью планиметрии по гистологическим изображениям окрашенных трихромом участков Массона, полученным с помощью светового микроскопа (4x) и соответствующего программного обеспечения.
   1. Для количественной оценки размера инфаркта определите зону инфаркта (синяя) и удаленную зону (красная). Проследить и измерить общую длину зоны инфаркта и удаленной зоны на эндокардиальной и эпикардиальной сторонах. Рассчитайте среднее значение эндокардиальных и эпикардиальных трасс в процентах от общей окружности ЛЖ¹⁷.
   2. Аналогичным образом измерьте толщину рубца (среднее значение пяти эквидистантных измерений) и толщину перегородки (среднее значение трех эквидистантных измерений) в среднем отделе сердца и используйте эти измерения для определения отношения толщины рубца (уравнение [5]) и индекса расширения (уравнение [6]¹⁸).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Все значения могут быть записаны в электронную таблицу.
      Отношение толщины рубца = Толщина рубца/толщина перегородки (5)
      Индекс расширения = (площадь полости ЛЖ/общая площадь ЛЖ) × (толщина перегородки/толщина рубца) (6)
      ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку ремоделирование может изменить расширение, что приведет к недооценке или переоценке размера инфаркта, может потребоваться некоторое время для проведения пилотного эксперимента по измерению размера инфаркта через 24 часа с последующей эвтаназией. В этом случае обезболите животное тем же раствором анестетика, который использовался для процедуры ИМ.
2. Поместите животное в спинное пролежнем и интубируйте его, как описано ранее. После того, как животное будет обезболито, сделайте глубокий диагональный разрез, который доходит до кожи, мышц и реберных костей от мечевидного апофиза до подмышечной впадины.
3. Изолируйте дугу аорты, сделайте небольшое отверстие в восходящей аорте и введите катетер, чтобы перфузировать сердце синим цветом Эвана. Затем вручную снимите испачканное сердце с животного, и разрежьте его от верхушки до основания острым лезвием. Поместите срезы сердца в 1% трифенилтетразолия хлорид (ТТС) в изотонический фосфатный буфер (pH 7,4) и инкубируйте при 37 °C в течение 30 мин ⁴ , чтобы убедиться, что животные сопоставимы с точки зрения размера инфаркта.

Результаты

Выживаемость и вскрытие после ИМ
В течение 4 недель наблюдения 17% (4/23) мышей C57 против 40% (8/20) мышей Gal-3 KO были найдены мертвыми. Было проведено вскрытие; у мертвых мышей Gal-3 KO сердце было больше, чем у мышей C57 (рис. 1), а у 38% мышей C57 по срав?...

Обсуждение

Экспериментальная модель ИМ с помощью постоянной лигатуры коронарных артерий используется для изучения широкого спектра патофизиологических механизмов восстановления и ремоделирования сердца ^5,14,17. В этой статье о...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
8-0 silk suture	Ethicon
C57BL/6J mice	Department of Bioresources of the Faculty of Veterinary of the University of Buenos Aires, Argentina
Forceps
Hardvard 386 respirator	Hardvard company
Heating pad			maintain animal's temperature during surgery
Image Pro-Plus 6.0	Media Cybernetics		Image Analysis Software
Ketamine	Holiday
Masson Trichrome	BIOPUR
Picrosirius red	BIOPUR
Retractors
Rodent Ventilator Model 683	Harvard Apparatus		Mechanical ventilator
Scissors
Stereoscopic magnifying glass	Arcano
Vivid 7 machine (General Electric Medical Systems, Horten, Norway)	General Electric		Any tracking software can be utilized with this protocol
WGA no. RL-1022, Vector Laboratories, Burlingame	Vector Laboratories
Xylazine	Pro-Ser