Первичная культура пигментных эпителиальных клеток свиньи свиней

Резюме

Здесь представлен простой в применении метод культивирования первичных пигментных эпителиальных клеток свиньи in vitro .

Аннотация

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) представляет собой монослой поляризованных пигментированных эпителиальных клеток, расположенный между сосудистой оболочкой и нейроретиной в сетчатке. Множественные функции, включая фагоцитоз, транспортировку питательных веществ / метаболитов, метаболизм витамина А и т. Д., Проводятся RPE на ежедневной основе. Клетки RPE представляют собой терминально дифференцированные эпителиальные клетки с небольшой регенеративной способностью или вообще без нее. Потеря клеток RPE приводит к множественным заболеваниям глаз, приводящим к нарушениям зрения, таким как возрастная макулярная дегенерация. Поэтому создание модели культуры in vitro первичных клеток RPE, которая больше напоминает RPE in vivo , чем клеточные линии, имеет решающее значение для характерных и механистических исследований клеток RPE. Учитывая тот факт, что источник глазных яблок человека ограничен, мы создаем протокол для культивирования первичных клеток Свиньи RPE. Используя этот протокол, клетки RPE могут быть легко диссоциированы от глазных яблок взрослых свиней. Впоследствии эти диссоциированные клетки прикрепляются к культуральным чашкам / вставкам, размножаются, образуя сливающийся монослой, и быстро восстанавливают ключевые особенности эпителиальной ткани in vivo в течение 2 недель. С помощью qRT-PCR показано, что первичные клетки RPE свиней экспрессируют несколько сигнатурных генов на сопоставимых уровнях с нативной тканью RPE, в то время как экспрессия большинства этих генов теряется / сильно снижается в человеческих RPE-подобных клетках, ARPE-19. Кроме того, иммунофлуоресцентное окрашивание показывает распределение плотного соединения, полярности тканей и белков цитоскелета, а также присутствие RPE65, изомеразы, критической для метаболизма витамина А, в культивируемых первичных клетках. В целом, мы разработали простой в использовании подход к культивированию первичных клеток RPE свиней с высокой чистотой и нативными характеристиками RPE, который может служить хорошей моделью для понимания физиологии RPE, изучения токсичности клеток и облегчения скрининга лекарств.

Введение

Пигментный эпителий сетчатки (RPE) расположен между фоторецепторами и хориокапиллярисом во внешнем слое сетчатки¹ с несколькими функциями, включая формирование гематорезитарного барьера, транспортировку и обмен питательными веществами и метаболитами сетчатки, рециркуляцию витамина А для поддержания нормального зрительного цикла, а также фагоцитоз и клиренс наружных сегментов фоторецепторов (POSs)^2,3 . Поскольку POS требуют постоянного самообновления для генерации зрения, клетки RPE должны непрерывно поглощать отделенные POS для поддержания гомеостаза сетчатки⁴. Таким образом, дисфункция RPE приводит ко многим ослепляющим заболеваниям глаз, таким как возрастная макулярная дегенерация (AMD)⁴, пигментный ретинит (RP)⁵, врожденный амавроз Лебера⁶, диабетическая ретинопатия⁷ и т. Д. До сих пор точный патогенез большинства этих заболеваний остается неуловимым. В результате создается клеточная культура RPE для изучения клеточной биологии RPE, патологических изменений и основных механизмов.

Как простейшая модель для изучения клеточной биологии, культура клеток RPE была начата еще в 1920-х^{годах 8}. Хотя ARPE-19 широко используется в качестве клеток RPE, потеря пигментации, морфология булыжника и, особенно, барьерные функции в этой клеточной линии вызывают много опасений⁹. Для сравнения, культура первичных клеток RPE человека предлагает более реалистичный сценарий физиологических и патологических исследований⁹. Однако относительно ограниченная доступность ограничивает их использование, и этические проблемы всегда существуют. Кроме того, несколько групп использовали мышиные модели для культивирования клеток RPE. Однако размер мышиного глаза невелик, и для одной культуры обычно требуется много мышей, что неудобно⁹. Недавно ученые разработали новые методы использования эмбриональных стволовых клеток человека или индуцированных плюрипотентных стволовых клеток для получения клеток RPE. Хотя этот метод имеет особый потенциал для лечения наследственных нарушений RPE, он занимает много времени и обычно требует нескольких месяцев для создания зрелых клеток RPE¹⁰. Чтобы преодолеть эти проблемы, здесь мы вводим простой в использовании протокол для регулярного выделения и культивирования клеток RPE высокой чистоты в лаборатории. При подходящих условиях культивирования эти клетки могут демонстрировать типичные функции RPE и демонстрировать типичные морфологии RPE. Таким образом, этот метод культивирования может обеспечить хорошую модель для понимания физиологии RPE, изучения цитотоксичности, исследования патологических механизмов связанных глазных заболеваний и проведения скринингов лекарств.

протокол

Использование экспериментальных животных соответствовало правилам Ассоциации исследований в области зрения и офтальмологии (ARVO) и было одобрено Комитетом по этике управления экспериментальными животными Сямыньского университета.

1. Подготовка экспериментальных хирургических устройств, фермента переваривания тканей и буфера клеточной культуры

1. Подготовьте экспериментальные хирургические устройства, очистив и автоклавировав две пары офтальмологических хирургических ножниц и щипцов за день до рассечения глазного яблока, а затем высушив коробку хирургическими устройствами в общепроцедурной печи при 65 °C в течение ночи.
2. Подготовка питательных сред.
   1. Препарат DMEM/Basic media с добавлением 10% (v/v) фетальной бычьей сыворотки, 2 мМ L-глутамина и 1% (v/v) пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 Ед/мл).
   2. Приготовьте носители DMEM/F12 с добавлением 1% (v/v) FBS и 1% (v/v) пенициллина (100 Ед/мл) и стрептомицина (100 Ед/мл).
   3. Готовят MEM-Nic¹¹, добавляя MEM альфа с 2 мМ L-глутамином, 1% FBS, 1% (v/v) пенициллином (100 Ед/мл) и стрептомицином (100 ЕД/мл), 0,1 мМ NEAA, 1% (v/v) добавкой N1, таурином (0,25 мг/мл), гидрокортизоном (20 нг/мл), трийод-тиронином (0,013 нг/мл) и 10 мМ никотинамида.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для улучшения жизнеспособности и пролиферации клеток процент FBS может быть увеличен до 20%, чтобы нейтрализовать ферменты пищеварения и засеять диссоциированные клетки. Для долгосрочной клеточной культуры процент FBS может быть уменьшен до 1%¹².
3. Размораживание тканевого пищеварительного фермента аликвоты (0,25% (мас./об.) раствора трипсина/ЭДТА, дополненного 0,91 мМ ЭДТА, далее именуемого раствором Трипсина/ЭДТА) во время эксперимента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Свежий раствор Трипсина/ЭДТА следует использовать каждый раз для получения оптимальных результатов. Aliquot 10 мл свежего раствора трипсина/ЭДТА в каждую 15 мл стерильной центрифужной трубки и заморозьте аликвоты при -20 °C холодильнике до использования.
4. Раствор для рассечения.
   1. Стерилизуйте 1x фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS) (pH 7,2), дополненный 2% (v/v) пенициллином (100 Ед/мл) и стрептомицином (100 Ед/мл), фильтруя раствор через 0,22 мкм шприцевой фильтрующий блок.
5. Нанесите покрытие на культуральные пластины и трансвеллентные вставки.
   1. Промывайте колодцы и трансвеллеры с помощью 1x PBS. Удалите PBS из колодцев и трансвеллов пипеткой, а затем добавьте 1 мл свежего 1x PBS в нижнюю камеру и 600 мкл 10 мкг/мл раствора ламинина в верхнюю камеру.
   2. Инкубировать пластины/трансвеллеры в инкубаторе клеточной культуры на ночь при 37 °C и 5% CO₂. Удалите раствор ламинина из верхней камеры и дважды промойте 1 мл холодного 1x PBS перед посевом клеток.

2. Рассечение клеток RPE глазного яблока свиней

1. Подготовка инструментов.
   1. Очистите ламинарную вытяжку с 75% этанолом и ультрафиолетовым светом. Приготовьте три 50 мл стерильных центрифужных пробирок, содержащих ~25 мл 75% этанола, три 50 мл стерильных центрифужных пробирок, содержащих ~25 мл 1x PBS, и три 10 см стерильные чашки для культивирования клеток, содержащие ~15 мл 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки обычно используются для рассечения четырех глазных яблок свиней. Пожалуйста, увеличивайте масштаб, когда используется больше глазных яблок. Чтобы улучшить жизнеспособность клеток, предварительно охладите 1x PBS буфер на льду в течение не менее 30 мин. Как 75% этанола, так и ультрафиолетового излучения необходимы для обеспечения того, чтобы экспериментальные приборы и клетки не были загрязнены. Включите УФ-лампу заранее, чтобы стерилизовать весь рабочий стол в течение не менее 15 минут.
2. Очистите свиные глазные яблоки.
   1. Получите свежие глазные яблоки со скотобойни и держите их на льду до рассечения. Замочите четыре глазных яблока свиней в ~ 15 мл 75% этанола в чашке Петри 10 см и используйте ножницы и щипцы, чтобы отрезать все остаточные соединительные ткани и мышцы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите как можно больше ткани снаружи склеры, чтобы уменьшить загрязнения. Не перерезайте зрительный нерв в это время, чтобы облегчить перенос глазных яблок во время этапа обеззараживания и промывания. После этого шага все процедуры должны выполняться в ламинарной вытяжке.
3. Обеззараживать глазные яблоки свиней путем замачивания и промывания четырех глазных яблок свиней в трех стерильных центрифужных трубках по 50 мл, заполненных 75% этанолом последовательно; каждое глазное яблоко опускается не менее чем на 5 минут в каждую трубку. Затем промыть глазные яблоки свиней в трех стерильных центрифужных трубках по 50 мл, заполненных 1x PBS последовательным образом; промыть каждое глазное яблоко не менее 5 мин в каждой трубке (рисунок 1А). Переворачивайте трубки каждую минуту, чтобы тщательно промыть глазные яблоки.
4. Рассечение глазных яблок свиней.
   1. Переместите четыре глазных яблока свиней в 10-сантиметровую стерильную чашку для культивирования клеток, содержащую 1 PBS. Снова обрежьте внешнюю поверхность каждого глазного яблока, чтобы удалить зрительный нерв и мелкий мусор (рисунок 1B). С помощью ножниц сделайте небольшой разрез на пересечении лимбуса и склеры, а затем удалите роговицу, радужную оболочку, хрусталик, стекловидное тело и нервную сетчатку (подробные структуры этих тканей см. на рисунке 1).
   2. Перенесите комплекс RPE-сосудистой оболочки-склеры в новую чашку для культивирования клеток размером 10 см и сделайте четыре разреза, чтобы плоский наглазник в форме четырехлистного клевера (рисунок 1C).
5. Выполните переваривание раствора трипсина/ЭДТА, поместив четыре комплекса RPE-сосудистой оболочки-склеры в новую посуду размером 10 см. Налейте 20 мл свежего раствора Трипсина/ЭДТА для слияния комплексов RPE-сосудистой оболочки-склеры и поместите блюдо в инкубатор клеточной культуры при 37 °C в течение ~30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте свежий раствор Трипсина/ЭДТА для диссоциации клеток RPE. Тщательно контролируйте время переваривания раствора трипсина/ЭДТА, так как более длительное время инкубации (более 30 мин) может увеличить загрязнение других типов клеток.

3. Выделение и культивирование клеток RPE свиного глазного яблока

1. Диссоциация РПЭ.
   1. Выньте блюдо из инкубатора после 30 мин инкубации с раствором Трипсина/ЭДТА и добавьте в блюдо 20 мл предварительно расплавленной культуральной среды (с 10% FBS) для нейтрализации раствора Трипсина/ЭДТА.
      ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе используется только носитель DMEM/Basic. Когда клетки достигают слияния, в зависимости от условий эксперимента могут использоваться три питательные среды: DMEM/Basic среда, среда DMEM/F12 и среда MEM-Nic.
   2. Используйте передаточную пипетку объемом 5 мл для диссоциации клеток RPE путем осторожной пипетки несколько раз. Соберите клеточные суспензии в трубки центрифуги объемом 15 мл. Используйте еще 10 мл свежих питательных сред (10% FBS) для промывки комплексов RPE-сосудистой оболочки-склеры на посуде путем осторожного пипетирования для получения как можно большего количества клеток RPE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не разрушайте клетки слишком энергично. Убедитесь, что пипетка заполнена и опорожнена со скоростью около 3 мл/с. Избегайте пузырьков клеточной суспензии.
2. Собирайте ячейки RPE путем центрифугирования трубок при 200 х г в течение 5 мин при комнатной температуре. Аспирировать супернатант с помощью пипетки и добавить еще 5 мл культуральной среды (10% FBS) для повторного суспендирования клеток и центрифуги при 200 х г еще на 5 мин. Декантировать супернатант и повторно суспендировать клетки 12 мл питательных сред.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При аспирации супернатанта оставьте около 1 мл среды, чтобы избежать разрушения сгустков клеток.
3. Посев RPE клеток.
   1. Семена ~1-2 х 10⁵ клеток /скважина в 12-луночные культуральные пластины или трансвелл-вкладыши. Обычно из четырех глазных яблок свиней получают около 1,5 х 10⁶ клеток RPE. Меняйте питательные среды каждые 2 дня и снижайте концентрацию сыворотки до 1%, когда клетки полностью покрывают поверхность лунок/вкладышей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Не перемещайте чашку для культивирования клеток слишком часто, прежде чем клетки прикрепятся к чашке/вставкам для культивирования.
4. Меняйте культуральную среду каждые 2 дня, пока клетки не будут собраны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация FBS может быть снижена после того, как клетки достигнут слияния, и клетки могут культивироваться в течение нескольких месяцев, чтобы обеспечить полную дифференцировку и созревание.

4. Характеристика первичных клеток РПЭ свиней

1. Культивируйте клетки при слиянии в течение 1 или 2 недель, а затем собирайте клетки для дальнейшего анализа.
2. Собирайте клетки для количественного анализа ПЦР в режиме реального времени (qRT-PCR).
   1. Удалите культуральную среду, промыть клетки 1 мл холодного 1x PBS, а затем добавить 500 мкл экстракционного раствора РНК в каждую лунку для сбора лизата клеток примерно из 1 х 10⁶ клеток.
   2. Экстракт мРНК¹³; приблизительно 4 мкг РНК извлекается из каждого образца. Используйте 100 нг мРНК для выполнения обратной транскрипции¹⁴; разбавляют кДНК в 40 раз для количественного анализа ПЦР в режиме реального времени. Грунтовки приведены в таблице 1.
3. Сбор клеток для иммунофлуоресцентного окрашивания.
   1. Удалите питательные среды, промыть клетки 1 мл холодного 1x PBS, а затем добавить 500 мкл 4% (мас./об.) параформальдегида в 1x PBS для фиксации клеток (около 1 x 10⁶ клеток/лунка) в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем промыть клетки 1x PBS дважды и выполнить иммунофлуоресцентное окрашивание первичными антителами (1:100 в 1x PBS с добавлением 1% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина) при 4 °C в течение ночи и вторичными антителами (1:200 в 1x PBS, дополненным 1% (мас./об.) бычьим сывороточным альбумином) при комнатной температуре в течение 2 ч в соответствии с онлайн-протоколами¹⁵.
   2. Изображения иммунофлуоресценции получены конфокальным микроскопом в соответствии с онлайн-руководством¹⁶.
4. Собирайте клетки для анализа вестерн-блоттинга.
   1. Удалите питательные среды, дважды промойте клетки холодным 1x PBS, а затем добавьте 80 мкл буфера RIPA (с 1x ингибитором протеазы) в каждую лунку и используйте клеточные скребки, чтобы поцарапать около 1 x 10⁶ клеток с посуды / вкладышей.
   2. Соберите лизат клеток из каждой лунки /вставьте в микроцентрифужную трубку объемом 1,5 мл. Кипятите клеточные лизаты в течение 10 минут, а затем измеряйте концентрацию белка с помощью наборов BCA; концентрация белка в каждом образце составляет около 2 мг/мл. Используйте 25 мкг белков каждого образца для анализа вестерн-блоттинга в соответствии с онлайн-протоколами¹⁷.
   3. Для вестерн-блоттинга инкубируют мембраны в 5 мл раствора первичных антител (1:1000 разведения первичных антител в 1x растворе TBST, дополненном 5% (мас./об.) бычьим сывороточным альбумином) при 4 °C в течение ночи на вращающемся многоцелевом шейкере.
   4. Затем инкубируют мембрану примерно с 15 мл раствора вторичных анти-кроликов или против мышей (разведение вторичных антител 1:5000 в 1x растворе TBST, дополненном 5% (мас./об.) обезжиренным молоком) при комнатной температуре в течение 2 ч на орбитальном шейкере, согласно источнику используемого первичного антитела.
5. Измерение трансэпителиального сопротивления (ТЕЖ).
   1. Вымойте электроды палочки для еды с 70% этанолом и стерильным 1x PBS последовательным способом. Затем поместите более короткий конец электрода в верхнюю камеру, а более длинный конец в нижнюю камеру трансвеллерных вставок и нажмите кнопку на эпителиальном вольтметре для измерений. Регистрируйте измерения ТЕЖ каждой скважины в трех экземплярах.

Результаты

Первичные клетки Свиньи RPE (pRPE) культивировали в DMEM/Basic средах с 10% FBS, а морфологию клеток под световым микроскопом фотографировали через 2 дня (Рисунок 2A), 6 дней (Рисунок 2B) и 10 дней (Рисунок 2C) после посева. Через 1 нед наблюдался сливающийся ?...

Обсуждение

Здесь был описан подробный и оптимизированный протокол для выделения, культивирования и характеристики клеток RPE из глазных яблок свиней, который генерирует хорошую модель для характеристики in vitro клеток RPE и исследований расстройств, связанных с RPE. Методы выделения РПЭ из глаз че...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ARPE-19 cells	CCTCC	GDC0323
Bovine serum albumin	Yeasen	36101ES60
Confocal microscopy	Zeiss	LSM 880 with Airyscan
ChemiDoc Touch	Bio-Rad	1708370
Cell scraper	Sangon	F619301
10 cm culture dish	NEST	121621EH01
12-well culture plate	NEST	29821075P
DMEM F12 Medium	Gibco	C11330500BT
DMEM basic Medium	Gibco	C11995500BT
EVOM2	World Precision Instruments	EVOM2	For TER measurement
Fetal bovine serum	ExCell Bio	FSP500
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	ThermoFisher Scientific	A-11034
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 594	ThermoFisher Scientific	A-11012
Goat anti Mouse IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	0300-0108P
Goat anti Rabbit IgG (H/L):HRP	Bio-Rad	5196-2504
hydrocortisone	MCE	HY-N0583/CS-2226
Hoechst 33342 solution (20 mM)	ThermoFisher Scientific	62249
LightCycler 96 Instrument	Roche	5815916001
Liothyronine	MCE	HY-A0070A/CS-4141
laminin	Sigma-Aldrich	L2020-1MG
MEM(1X)+GlutaMAX Medium	Gibco	10566-016
MEM NEAA(100X)	Gibco	11140-050
Millex-GP syringe filter unit	Millipore	SLGPR33RB
N1	Sigma-Aldrich	SLCF4683
NcmECL Ultra	New Cell&Molecular Biotech	P10300
Non-fat Powdered Milk	Solarbio	D8340
Nicotinamide	SparkJade	SJ-MV0061
Na+-K+ ATPase antibody	Abcam	ab76020	Recognize both human and porcine proteins
PAGE Gel Fast Preparation Kit(10%)	Epizyme	PG112
primary Human RPE cells	-	-	Generous gift from Shoubi Wang lab
Pierce BCA Protein Assay Kit	ThermoFisher Scientific	23225
Prism	GraphPad by Dotmatics	version 8.0
Protease Inhibitor Cocktails	APExBIO	K1024
PRE65 antibody	Proteintech	17939-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
PEDF antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-390172	Recognize both human and porcine proteins
100 x penicillin/streptomycin	Biological Industries	03-031-1BCS
Phosphate buffered saline (PBS)	RARBIO	RA-9005
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix	Toyobo	FSQ-201
RIPA buffer	ThermoFisher Scientific	89900
15 mL sterile centrifuge tubes	NEST	601052
50 mL sterile centrifuge tubes	NEST	602052
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056
Taurine	Damas-beta	107-35-7
Trizol	Thermo-Fisher	15596026	RNA extraction solution
TB Green Fast qPCR Mix	Takara	RR430A
12-well transwell inserts	Labselect	14212
VEGF antibody	Proteintech	19003-1-AP	Recognize both human and porcine proteins
VEGF ELISA kit	Novusbio	VAL106
ZO-1 antibody	ABclonal	A0659	Recognize both human and porcine proteins