Минимально инвазивная, точная и эффективная методика интратермической инъекции мышам

Резюме

Настоящий протокол описывает интервенционную радиологическую процедуру, установленную для внутриутимической инъекции мышам, чтобы избежать риска открытой операции и повысить точность слепых чрескожных инъекций.

Аннотация

Интратермическая инъекция в мышиные модели является важным методом изучения тимической и иммунной функции, включая генетические и приобретенные Т-клеточные расстройства. Для этого требуются методы прямого осаждения реагентов и/или клеток в тимус живых мышей. Традиционные методы интратимических инъекций включают торакальную хирургию или минимально инвазивные чрескожные слепые инъекции, оба из которых имеют значительные ограничения. Сверхвысокочастотные ультразвуковые устройства визуализации сделали возможными чрескожные инъекции с визуальным контролем у мышей, значительно повысив точность инъекций чрескожного инъекционного подхода и позволив впрыскивать меньшие мишени. Тем не менее, инъекции с визуальным управлением полагаются на использование интегрированной железнодорожной системы, что делает эту процедуру жесткой и трудоемкой. Здесь представлен уникальный, безопасный и эффективный метод чрескожных внутриутомных инъекций у мышей, исключающий зависимость от рельсовой системы для инъекций. Метод основан на использовании микрозвукового блока высокого разрешения для неинвазивного изображения тимуса мыши. Используя технику свободной руки, радиолог может поместить кончик иглы непосредственно в тимус мыши под сонографическим руководством. Мышей очищают и анестезируют перед визуализацией. Для опытного радиолога, специалиста по ультразвуковым процедурам, период обучения заявленной методике довольно короткий, как правило, в течение одного сеанса. Метод имеет низкий уровень заболеваемости и смертности для мышей и намного быстрее, чем современные методы механической помощи для чрескожной инъекции. Это позволяет исследователю эффективно выполнять точные и надежные чрескожные инъекции тимуса любого размера (включая очень маленькие органы, такие как тимус пожилых или иммунодефицитных мышей) с минимальной нагрузкой на животное. Этот метод позволяет при желании вводить отдельные доли и облегчает крупномасштабные эксперименты благодаря экономящему времени характеру процедуры.

Введение

Тимус играет важную роль в развитии Т-клеток и иммунитета. Дефицит Т-клеток, который может быть вызван инволюцией тимуса, генетическими нарушениями, инфекциями и лечением рака, среди других факторов, приводит к высокой смертности и заболеваемости ^1,2. Мышиные модели незаменимы как в фундаментальных, так и в трансляционных иммунологических исследованиях и используются в течение десятилетий для изучения биологии тимуса и развития Т-клеток, а также для разработки методов лечения для тех, кто страдает от дисфункции тимуса и дефицита Т-клеток ^3,4,5.

Центральной частью исследований тимуса была внутритиремическая инъекция биологических материалов, таких как клетки, гены или белки в мышиных моделях 6,7,8,9,10,11,12. Обычные методы интратимических инъекций используют торакотомию с последующей внутриутимической инъекцией под прямой визуализацией или «слепой» чрескожной инъекцией в средостение. Хирургический подход значительно увеличивает риск пневмоторакса, среди прочих. Кроме того, повышенный стресс во время этой операции приводит к иммуносупрессии, что потенциально ставит под угрозу иммунологические данные¹³. Опытные исследователи, после некоторой практики, могут выполнить технику слепой инъекции, но такой подход менее точен и, следовательно, ограничивает подопытных молодыми мышами с большим тимусом.

Использование ультразвукового наведения было введено в качестве точной и минимально инвазивной альтернативы традиционным интратермическим инъекционным подходам¹⁴. Однако эта процедура очень трудоемка при использовании интегрированной рельсовой системы вместо техники свободной руки. Выполнение инъекций с помощью инжекторного крепления требует тщательной оптимизации изображения и позиционирования датчика с помощью различных приспособлений, таких как стойка и крепление преобразователя, система позиционирования X, Y и Z, а также умелое управление микроманипуляторами и расширения рельсовой системы. Здесь представлена простая альтернативная методика, ультразвуковая инъекция тимуса, выполняемая рентгенологом с использованием подхода¹⁵ от руки, который является одновременно быстрой и точной минимально инвазивной альтернативой вышеописанным методам. Важно отметить, что нынешний подход может быть выполнен с любой системой ультразвуковой визуализации высокого разрешения без необходимости установки для инъекций и интегрированной рельсовой системы. Он особенно полезен для исследований, требующих инъекции большого числа мышей¹¹, для экспериментов, включающих инъекцию обеих долей тимуса, или для точной инъекции небольших тимусов у пожилых, облученных или иммунокомпрометированных мышей¹².

протокол

Все процедуры были выполнены в соответствии с руководящими принципами по уходу за животными в Центре открытий и инноваций (протокол IACUC 290). Для настоящего исследования мыши C57BL/6 (самки, 4-6 недель), мыши C57BL/6 (самка, 6 месяцев), самки мышей J:NU, самки мышей NOD scid gamma (NSG) и B6; Мыши CAG-luc, -GFP использовались в качестве модели молодой мыши, модели стареющей мыши, атимической модели обнаженной натуры, иммунодефицитной модели и источника биолюминесцентных клеток соответственно. Мыши были получены из коммерческого источника (см. Таблицу материалов). Эта процедура обычно требует двух человек (один должен оставаться стерильным во время выполнения инъекций, а другой - для обработки мышей).

1. Подготовка животных

1. Индуцировать анестезию у мышей с использованием 3%-4% изофлуранового газа и поддерживать анестезию с использованием 1%-3% изофлуранового газа, вводимого через носовой конус и точно откалиброванный испаритель (см. Таблицу материалов).
2. Подтвердите соответствующую анестезирующую глубину/бессознательность невосприимчивостью к защемлению задней лапы.
3. Удалите мех из передней части грудной клетки мышей, нанеся тонкий слой крема для депиляции менее чем на 1 минуту. Используйте влажное бумажное полотенце, чтобы полностью удалить крем вместе с рыхлым мехом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Нанесение слишком большого количества крема приведет к воспалению кожи в области груди.
4. Поместите по одной мыши за раз, лежа на спине, на нагретой платформе станции ультразвуковой визуализации мелких животных (см. Таблицу материалов) с носовым конусом на месте (рисунок 1).
5. Закрепите мышь на сцене с помощью медицинской клейкой ленты на задней и передней конечностях (рисунок 1).
6. Нанесите офтальмологическую мазь на оба глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
7. Продезинфицируйте кожу верхней части грудной клетки без меха с помощью аппликатора хлоргексидина глюконата (см. Таблицу материалов).

2. Подготовка ультразвукового аппарата и стерильного поля

1. Активируйте самый высокочастотный линейный зонд, как правило, зонд с самым высоким пространственным разрешением для размера изображения животного. Активируйте зонд, нажав соответствующую кнопку после экрана запуска.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого применения с мышами используемый зонд разработан специально для использования с мышами и маленькими крысами (см. Таблицу материалов).
2. Оптимизируйте настройки ультразвука для визуализации и инъекций, выполнив следующие действия.
   1. Отрегулируйте глубину поля зрения до размера, соответствующего целевому животному, отрегулировав вертикально ориентированные ползунки в правой части экрана (рисунок 2). Максимальная установка глубины обычно составляет около 6-8 мм для молодых мышей.
   2. Отрегулируйте усиление оттенков серого, переместив кнопку вдоль горизонтальной полосы в нижней части экрана (рисунок 2). Цель состоит в том, чтобы начать с изображения, которое немного темнее, чем типичный «серый» внешний вид.
   3. Отрегулируйте фокусную зону (синяя стрелка справа от экрана, рисунок 2) до ожидаемого уровня тимуса. Для молодых мышей это будет около 4 мм глубины.
   4. Если требуется захват изображения, проверьте функциональность кнопок «Сохранить изображение » и «Сохранить клип », чтобы убедиться, что изображения могут быть надлежащим образом сохранены на протяжении всей процедуры. Выполните это, нажав кнопку Save Clip (Сохранить клип) в правом нижнем углу экрана или нажав кнопку Freeze (Заморозить ), а затем нажав Save Image (рисунок 2).
3. Нанесите небольшое количество (~1 мл) ультразвукового геля на поверхность преобразователя (см. Таблицу материалов), пока он находится в вертикальном положении, либо в держателе ультразвукового аппарата, либо в руках помощника.
4. Подготовьте небольшое стерильное поле рядом с отапливаемой платформой. Оптимальное позиционирование для этого обычно находится между платформой и ультразвуковым аппаратом.
   1. Опорожните эти предметы на стерильное поле: стерильную крышку зонда, резинку, стерильные перчатки и стерильный ультразвуковой гель (см. Таблицу материалов).
   2. Установив стерильное поле и поставив предметы на место, наденьте стерильные перчатки.
   3. Осторожно поместите стерильную крышку зонда на ультразвуковой преобразователь (а также на гель, который изначально был помещен на зонд). Сохраняйте стерильность и прикасайтесь только к стерильному чехлу, больше ничего. Сдвиньте стерильную резинку на стерильную крышку зонда, чтобы удержать ее на месте.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Воздушные очаги, независимо от размера, могут мешать ультразвуковой визуализации. Следовательно, важно наносить ультразвуковой гель между датчиком и стерильной крышкой зонда, а также поверх крышки зонда, чтобы обеспечить безвоздушный интерфейс между ультразвуковым зондом и животным.
   4. Поместите умеренное количество (2-3 мл) стерильного ультразвукового геля на датчик.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Теперь пользователь готов к созданию изображения анестезированной мыши.

3. Визуализация и определение местоположения тимуса

1. Сохраняя стерильность, поместите ультразвуковой гелеобразный зонд вертикально на продезинфицированную часть передней грудной стенки мыши для первоначальной визуализации.
   1. Найдите минутку, чтобы посмотреть на ультразвуковое изображение и оптимизировать его дальше. Вернитесь к шагу 2.2 и настройте его, чтобы получить внешний вид, аналогичный тому, который показан на рисунке 3.
2. Сканируйте переднюю грудную клетку мыши в поперечной плоскости. Выполните это, удерживая датчик вертикально и перемещая его вверх и вниз от шеи к животу кистью или «размашистым» движением.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Сердце будет самой узнаваемой структурой в грудной клетке благодаря ее быстрому движению и «камерному» виду. Как только сердце локализовано, это может быть использовано в качестве ориентира для получения изображения тимуса.
3. С сердцем, сосредоточенным в поле зрения, проведите датчик немного к шее. Просто превосходя сердце, тимус обычно встречается.
4. Визуализируйте тимус как двулопастную, пирамидальную, гипоэховую («темную» или «черную», появляющуюся на экране) структуру, которая центрирована по средней линии, передней к аорте и задней части грудины (рисунок 3А).
5. Обратите внимание на две круглые парные черные (то есть «гипоэхогенные») структуры по обе стороны верхней части груди.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это двусторонние venae cavae. Аорта представляет собой аналогичную криволинейную гипоэховую структуру в средней линии между двумя венами. Их легко узнать по пульсирующим движениям.

4. Инъекция тимуса

1. При необходимости нанесите на датчик больше (2-3 мл) стерильного ультразвукового геля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Относительно большое количество стерильного геля на преобразователе (по сравнению с размером грудной клетки мыши) будет действовать как «гелевая прокладка» вокруг грудной стенки мыши. Это уменьшит количество ультразвуковых артефактов, сделанных воздухом в поле зрения.
2. Используя ультразвуковой зонд, найдите самую широкую часть тимуса, которая обычно является идеальным целевым местом для инъекции. Предугадывайте горизонтальную траекторию иглы в выбранном месте.
   1. Обратите внимание, где основные кровеносные сосуды (SVC и aorta) расположены в этом месте. Избегайте их во время инъекции.
   2. Кровеносные сосуды будут гипоэхогенными, пульсирующими структурами, как описано в шаге 3.7. Если вы не уверены, используйте цветовой доплеровский режим для проверки потока внутри сосудов (рисунок 4A). Активируйте цветовой доплеровский режим, нажав кнопку «Цвет» на экране.
   3. Если ожидается, что один из основных кровеносных сосудов (или сердце) будет находиться вдоль ожидаемой траектории иглы, выберите новую целевую область или найдите другой подход / траекторию.
3. Держите датчик в одной руке и иглу инсулина 30 г (см. Таблицу материалов) с 10 мкл инъекционного введения в другой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Инъекция будет варьироваться в зависимости от экспериментальной конструкции. В настоящем исследовании использовали фосфатно-буферный физиологический раствор, трипан синий или D-люциферин (0,1 мкг/10 мкл).
4. Чтобы начать процесс инъекции, переместите преобразователь в боковом направлении так, чтобы тимус находился вне центра в ультразвуковом поле зрения. Убедитесь, что другая сторона поля зрения состоит в основном из ультразвукового геля и ничего больше.
5. Поместите кончик иглы в гель под датчик и медленно перемещайте иглу, пока она не будет визуализирована рядом с поверхностью кожи (рисунок 4B).
6. При непрерывной визуализации иглы под ультразвуком вставьте иглу в вилочковую железу с чрескожной траекторией, вдали от кровеносных сосудов.
   1. Используйте горизонтальную траекторию «поперечного тимуса», чтобы поместить кончик иглы в глоток тимуса, противоположный месту входа. Это объясняет потенциальную утечку вдоль игольчатого тракта (рисунок 5А).
7. Как только кончик иглы окажется внутри желаемой части тимуса, быстро введите содержимое (например, 10 мкл трипан-синего или D-люциферина, 0,1 мкг/10 мкл) из шприца 30 г с использованием сонографической визуализации.
   1. Чтобы стабилизировать шприц во время введения и инъекции иглы, держите шприц между большим и третьим пальцами и управляйте плунжером шприца указательным пальцем.
8. Извлеките иглу после того, как все содержимое будет отложено.

5. Постинъекционный мониторинг животных

1. Переведите животное в пустую клетку и наблюдайте, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного покоя.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полное восстановление после анестезии ожидается в течение 2 минут.
2. Наблюдайте за животным в течение дополнительных 10 минут на наличие признаков дистресса, затрудненного дыхания или кровотечения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Боль после инъекции не ожидается, и, как правило, нет необходимости в послеинъекционной анальгезии.
3. После полного выздоровления и после периода наблюдения после инъекции верните введенное животное в компанию других животных.

Результаты

Успешная реализация этого метода зависит от нескольких ключевых шагов, которые необходимо выполнить. Во-первых, должна быть обеспечена достоверная идентификация самой вилочковой железы. У молодых мышей это просто из-за большого размера железы (рисунок 3A). У старых мыше?...

Обсуждение

Ультразвуковая инъекция в свободную руку является высокоточным методом доставки учебных материалов к тимусу эффективным и асептическим способом. После первоначальной стерилизации кожи в месте инъекции стерильность сохраняется во время процедуры благодаря использованию стерильных...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Aquasonic 100 Ultrasound Gel	Parker Laboratories (Fairfield, NJ, USA)	01-01	Sterile Ultrasound Transmission Gel
B6;CAG-luc, -GFP mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	025854	Bioluminescence cell source
BD Insulin Syringes with needle	Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, USA)	328431	Ultra-fine needle - 12.7 mm, 30 G
C57BL/6 mouse - aged	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 6 months old; aged model
C57BL/6 mouse - young	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	000664	age 4-6 weeks; young model
Chloraprep One-step 0.67 mL	CareFusion (El Paso, TX, USA)	260449	chlorhexidine gluconate applicator
Curity Cotton Tipped Applicator	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	A5000-2	Sterile, 6"
D-Luciferin	Gold Biotechnology (St Louis, MO, USA)	LUCK-1G
Isoflurane	Henry Schein (Melville, NY, USA)	1182097
IVIS Lumina X5	PerkinElmer (Melville, NY, USA)	n/a	In vivo bioluminescence imaging system
J:NU mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	007850	Athymic nude model
Kendall Hypoallergenic Paper Tape	Cardinal Health (Dublin, OH, USA)	1914C
Kimtech Surgical Nitrile Gloves	Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, USA)	56892	Sterile Gloves
Nair Hair Remover Lotion	Church and Dwight (Trenton, NJ, USA)	n/a	Depilatory agent
NOD scid gamma (NSG) mouse	The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, USA)	005557	Immunodeficient model
Phosphate-Buffered Saline (PBS), 1x	Corning (Corning, NY, USA)	21-040-CV
Puralube Vet Ointment	Med Vet International	PH-PURALUBE-VET	Eye ointment
Sheathes	Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, USA)	10040	Sterile Ultrasound Probe Covers
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific (Braintree, MA, USA)	EZ-17 85	Anesthesia induction chamber
Transducer MX550D	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Vevo 3100 imaging probe (25-55 MHz, Centre Transmit: 40 MHz)
Trypan Blue, 0.4% solution in PBS	MP Biomedicals (Solon, OH, USA)	91691049
Vevo 3100 Imaging System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Ultrasound imaging system
Vevo 3100 Lab Software	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Version 3.2.7 for imaging and analysis
Vevo Compact Dual Anesthesia System	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Tabletop isoflurane-based anesthesia unit
Vevo Imaging Station	FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canada)	n/a	Procedural platform