JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Индуцированные человеком плюрипотентные кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток (hiPSC-CM), предлагают альтернативу использованию животных для доклинического скрининга кардиотоксичности. Ограничением для широкого внедрения hiPSC-CM в доклиническом скрининге токсичности является незрелый, эмбрионоподобный фенотип клеток. Здесь представлены протоколы для надежного и быстрого созревания hiPSC-CM.

Аннотация

Кардиомиоциты, полученные из стволовых клеток человека (hiPSC-CM), используются для замены и снижения зависимости от животных и клеток животных для доклинических испытаний на кардиотоксичность. В двумерных монослойных форматах hiPSC-CM повторяют структуру и функцию клеток сердечной мышцы взрослого человека при культивировании на оптимальном внеклеточном матриксе (ECM). ECM, полученный из перинатальных стволовых клеток человека (индуцирующий созревание внеклеточный матрикс-MECM-MECM), созревает структуру, функцию и метаболическое состояние hiPSC-CM через 7 дней после нанесения покрытия.

Зрелые монослои hiPSC-CM также реагируют, как и ожидалось, на клинически значимые лекарства с известным риском возникновения аритмий и кардиотоксичности. Созревание монослоев hiPSC-CM до сих пор было препятствием для широкого внедрения этих ценных клеток для нормативной науки и скрининга безопасности. В этой статье представлены валидированные методы нанесения покрытия, созревания и высокопроизводительного функционального фенотипирования электрофизиологической и сократительной функции hiPSC-CM. Эти методы применимы к коммерчески доступным очищенным кардиомиоцитам, а также к кардиомиоцитам, полученным из стволовых клеток, полученным собственными силами с использованием высокоэффективных протоколов камерно-специфической дифференцировки.

Высокопроизводительная электрофизиологическая функция измеряется с помощью чувствительных к напряжению красителей (VSD; излучение: 488 нм), кальций-чувствительных флуорофоров (CSF) или генетически кодируемых кальциевых датчиков (GCaMP6). Для оптической записи каждого функционального параметра используется высокопроизводительное оптическое картографическое устройство, а для анализа электрофизиологических данных используется специальное программное обеспечение. Протоколы MECM применяются для скрининга лекарств с использованием положительного инотропа (изопреналин) и блокаторов канала, связанных с эфиром (hERG) человека. Эти ресурсы позволят другим исследователям успешно использовать зрелые hiPSC-CM для высокопроизводительного доклинического скрининга кардиотоксичности, тестирования эффективности сердечных препаратов и сердечно-сосудистых исследований.

Введение

Индуцированные плюрипотентные кардиомиоциты человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (hiPSC-CM), были валидированы в международном масштабе и доступны дляскрининга кардиотоксичности in vitro1. Высокочистые hiPSC-CM могут генерироваться практически в неограниченном количестве, криоконсервироваться и размораживаться. После перекладывания они также реанимируются и начинают сокращаться с ритмом, напоминающим человеческое сердце 2,3. Примечательно, что отдельные hiPSC-CM соединяются друг с другом и образуют функциональные синцитии, которые бьются как единая ткань. В настоящее время ИПСК обычно получают из образцов крови пациентов, поэтому любой человек может быть представлен с помощью скрининговых анализов кардиотоксичности hiPSC-CM in vitro 4,5. Это создает возможность для проведения «клинических испытаний в блюде» со значительным представительством различных групп населения6.

Одним из важнейших преимуществ по сравнению с существующими подходами к скринингу кардиотоксичности клеток животных и животных является то, что hiPSC-CM используют полный геном человека и предлагают систему in vitro с генетическим сходством с человеческим сердцем. Это особенно привлекательно для фармакогеномики и персонализированной медицины - прогнозируется, что использование hiPSC-CM для разработки лекарств и других методов лечения обеспечит более точные, точные и безопасные назначения лекарств. Действительно, двумерные (2D) монослойные анализы hiPSC-CM доказали свою эффективность прогнозирования кардиотоксичности лекарств с использованием панели клинически используемых лекарств с известным риском возникновения аритмий 1,7,8,9. Несмотря на огромный потенциал hiPSC-CM и обещание упростить и удешевить разработку лекарств, существует нежелание использовать эти новые анализы10,11,12.

До сих пор одним из основных ограничений широкого внедрения и принятия скрининговых анализов hiPSC-CM является их незрелый, похожий на плод внешний вид, а также их функция. Критический вопрос созревания hiPSC-CM был рассмотрен и обсужден в научной литературе до тошноты13,14,15,16. Аналогичным образом, для стимулирования созревания hiPSC-CM было использовано множество подходов, включая манипуляции с внеклеточным матриксом (ECM) в 2D-монослоях и разработку 3D-инженерных тканей сердца (EHT)17,18. В настоящее время широко распространено мнение, что использование 3D EHT обеспечит превосходное созревание по сравнению с подходами на основе 2D монослоя. Однако 2D-монослои обеспечивают более высокую эффективность использования ячеек и больший успех в нанесении покрытия по сравнению с 3D-EHT; 3D EHT используют большее количество клеток и часто требуют включения других типов клеток, которые могут исказить результаты. Поэтому в этой статье основное внимание уделяется использованию простого метода созревания hiPSC-CM, культивируемых в виде 2D-монослоев электрически и механически связанных клеток.

Усовершенствованное созревание hiPSC-CM может быть достигнуто в 2D-монослоях с помощью ECM. 2D-монослои hiPSC-CM могут созревать с использованием мягкого, гибкого полидиметилсилоксанового покровного стекла, покрытого матриксом базальной мембраны, секретируемым клеткой саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (ECM мыши). В 2016 году отчеты показали, что hiPSC-CM, культивируемые в этом мягком состоянии ECM, функционально созревают, демонстрируя скорости проводимости потенциала действия вблизи значений сердца взрослого человека (~ 50 см / с)18. Кроме того, эти зрелые hiPSC-CM проявляли многие другие электрофизиологические характеристики, напоминающие сердце взрослого человека, включая гиперполяризованный мембранный потенциал покоя и экспрессию Kir2.1. Совсем недавно в отчетах было идентифицировано покрытие ECM, полученное из перинатальных стволовых клеток человека, которое способствует структурному созреванию 2D hiPSC-CMs19. Здесь представлены простые в использовании методы структурно зрелых 2D-монослоев hiPSC-CM для использования в высокопроизводительных электрофизиологических экранах. Кроме того, мы проводим валидацию оптического картографического прибора для автоматического сбора и анализа 2D монослойной электрофизиологической функции hiPSC-CM с использованием чувствительных к напряжению красителей (VSD) и чувствительных к кальцию зондов и белков.

протокол

Использование hiPSC в этом протоколе было одобрено комитетом HPSCRO Мичиганского университета (Комитет по надзору за плюрипотентными стволовыми клетками человека). Список материалов и оборудования см. в таблице материалов . В таблице 1 приведены носители и их составы.

1. Размораживание и покрытие коммерчески доступных криоконсервированных hiPSC-CM для созревания на индуцирующем созревание внеклеточном матриксе (MECM)

  1. Нагрейте все реагенты до комнатной температуры и регидратируйте планшеты MECM сбалансированным солевым раствором Хэнка (HBSS) или фосфатно-буферным физиологическим раствором (PBS), содержащим кальций и магний, в течение 1 часа до покрытия кардиомиоцитов (200 мкл буфера на лунку 96-луночного планшета).
  2. Промойте планшеты MECM 2 раза HBSS или PBS, содержащими кальций и магний, в течение 1 часа перед кардиомиоцитами (200 мкл буфера на лунку 96-луночной пластины) и держите лунки гидратированными.
  3. Приготовьте водяную баню с температурой 37 °C.
  4. Извлеките кардиомиоцитарные пробирки из резервуара с жидким азотом, перенесите пробирки на сухой лед и слегка приоткройте крышки пробирок, чтобы сбросить давление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сброс давления в трубках чрезвычайно важен! Если внутри труб будет слишком большое давление, они могут взорваться.
  5. Закройте крышки тюбиков и поместите их на водяную баню, чтобы они оттаяли на 4 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дайте им полностью оттаять, чтобы избежать повреждения клеток из-за частичного оттаивания.
  6. После того, как клетки оттают, опрыскайте пробирки 70% этанолом перед открытием. Перенесите клетки в конические пробирки объемом 15 мл с помощью пипетки объемом 1 мл. Медленно капайте 8 мл гальванической среды, перемешивая пробирку каждый раз, когда добавляется 1 мл, чтобы клетки могли приспособиться к изменениям осмолярности.
    1. Промойте криовиал 1 мл гальванической среды с помощью стеклянной пипетки объемом 1 мл. Затем медленно капните жидкость в коническую трубку объемом 15 мл.
  7. Центрифугируют пробирки при ~300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл гальванической среды. Удалите аликвоту и проведите подсчет живых клеток с помощью гемоцитометра. Добавьте дополнительную гальваническую среду для получения 7,5 × 10,5 клеток/мл .
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 10 мл клеточной суспензии требуется для подготовки 96 лунок.
  8. Дозируйте 100 мкл клеточной суспензии на лунку 96-луночной пластины с покрытием MECM с помощью многоканальной пипетки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что вы избегаете осаждения ячеек и добиваетесь равномерной плотности ячеек во всех лунках во время нанесения покрытия.
  9. Инкубируйте клетки при 37 °C, 5% CO 2 в течение2 дней перед сменой среды на поддерживающую среду (200 мкл / лунка). Замените поддерживающую среду на 5-й день после размораживания. Выполняйте анализы ЭП на 7-й день или позже, как описано ранее8,9. Меняйте среду через день, выбирая расширение клеточной культуры.

2. hiPSC-направленная кардиальная дифференцировка и очистка hiPSC-CM

  1. Теплый 1x коммерчески доступный раствор этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА), HBSS без кальция и магния (HBSS--) и 6-луночные пластины, покрытые солюбилизированным матриксом базальной мембраны, секретируемым клеткой саркомы мыши Энгельбрета-Холма-Роя (ECM мыши) до комнатной температуры.
  2. Отметьте дифференцированные колонии с помощью фазово-контрастной микроскопии и аспирата/аблята. Хорошо промойте каждый из них 1 мл HBSS--. Проведите две промывки в лунках, содержащих >10 пятен дифференциации.
  3. Аспирируйте HBSS и добавьте 1 мл раствора ЭДТА в каждую лунку. Выдерживайте пластины до 5 минут при 37 °C. Проверьте пластины через 3 минуты и найдите полупрозрачные белые видимые колонии.
  4. Аспирируйте раствор ЭДТА и добавьте 1 мл в одну лунку. Вытесните клетки с 2 мл среды hiPSC, многократно пипетируя суспензию вверх и вниз, используя стеклянную пипетку объемом 10 мл, чтобы отделить все стволовые клетки от лунки и перенести клеточную суспензию в пробирку для сбора. Повторяют аспирацию и выбивание с последующими лунками.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вытесните трудно поднимаемые колонии кончиком стеклянной пипетки.
  5. Подсчитайте стволовые клетки и отрегулируйте объем до пластины 8,0 × 105 клеток / лунка. Культивируйте клетки на среде hiPSC (2 мл / лунка) до тех пор, пока стволовые клетки не достигнут 90% слияния (это время отныне называется D0).
  6. Приготовьте 2 мл среды для базальной дифференцировки с добавлением 4 мкМ CHIR99021.
  7. На D0 промойте каждую лунку 6-луночной пластины стволовых клеток 1 мл HBSS на лунку. Замените HBSS средой базальной дифференцировки с добавлением 4 мкМ CHIR99021.
  8. На D1 ничего не делать.
  9. На D2 готовят среду для базальной дифференцировки с добавлением 4 мкМ IWP4.
  10. Замените среду 2 мл среды для базальной дифференцировки с добавлением IWP4 на лунку.
  11. На D3 ничего не делать для желудочково-специфической дифференцировки. Для предсердно-специфической дифференцировки аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды с добавлением 4 мкМ раствора IWP4 и 1 мкМ ретиноевой кислоты (РА) на лунку.
  12. На D4 аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды в лунку для дифференцировки желудочков. Для дифференцировки предсердий аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды с добавлением 1 мкМ раствора РА на лунку.
  13. На D5 ничего не делать.
  14. На D6 аспирируют среду и добавляют 2 мл базальной среды на лунку (как для предсердной, так и для желудочковой дифференцировки).
  15. На D7 ничего не делать.
  16. На D8 аспирируйте среду и добавьте 2 мл поддерживающей среды кардиомиоцитов. Меняйте среду через день до разделения клеток или следуйте плану воздействия хронического препарата.

3. Очистка hiPSC-CM с помощью MACS (магнитно-активируемая сортировка клеток)

  1. Аспирируйте питательную среду для клеток и хорошо промойте каждую из них 1 мл HBSS--. Диссоциируют клетки, добавляя 1 мл 0,25% трипсина / ЭДТА и инкубируя при 37 ° C, 5% CO2 в течение 10 мин. Ресуспендируют и сингуляризируют клетки в каждой лунке 2 мл гальванической среды для инактивации трипсина / ЭДТА.
  2. Соберите клетки из шести лунок в коническую пробирку объемом 50 мл с сетчатым фильтром 70 мкм. Затем промойте сетчатый фильтр 3 мл гальванической среды. Посчитайте ячейки.
  3. Центрифугу суспензии при ~300 × г в течение 5 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и промойте клетки 20 мл ледяного разделительного буфера MACS. Затем снова центрифугу при ~300 × г в течение 5 мин.
  4. Ресуспендируют гранулу в 80 мкл холодного разделительного буфера MACS на 5 ×10-6 ячеек. Добавьте 20 мкл холодного коктейля истощения некардиомиоцитов (человеческого) на 5 × 106 клеток. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и выдержите на льду в течение 10 минут.
  5. Промойте образец, добавив 4 мл холодного разделительного буфера MACS на 5 × 106 клеток. Центрифугируют образец при ~300 × г в течение 5 мин и аспирируют надосадочную жидкость.
  6. Ресуспендируют гранулу в 80 мкл холодного разделительного буфера MACS на 5 ×10-6 ячеек. Добавьте 20 мкл холодных антибиотиновых микрогранул на 5 × 106 клеток. Аккуратно перемешайте клеточную суспензию и выдержите 10 мин на льду.
  7. Во время инкубации образцов поместите колонки положительного истощения (оснащенные фильтрами предварительного разделения 30 мкм) на сепаратор MACS и поместите маркированные пробирки для сбора объемом 15 мл под колонки. Один столбец нужен на каждые 5 × 106 ячеек.
  8. Заправьте каждую колонку 3 мл холодного разделительного буфера MACS. Смешайте клеточную суспензию, обработанную антителами, с 2 мл разделительного буфера MACS на 5 ×10-6 клеток и добавьте в колонку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не центрифуга! Центрифугирование на этом этапе оказывает пагубное влияние на выход кардиомиоцитов.
  9. Добавьте 2 мл разделительного буфера MACS в каждую колонку и собирайте проточный буфер до тех пор, пока не будет собрано 12 мл проточной суспензии кардиомиоцитов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Никогда не допускайте полного высыхания колонн.
  10. Центрифугируйте кардиомиоциты при ~ 300 × г в течение 5 мин, выбросьте надосадочную жидкость и суспендируйте кардиомиоциты в 1 мл гальванической среды.
  11. Подсчитайте ячейки, чтобы определить концентрацию, отрегулируйте объем до желаемой плотности посева и наклейте ячейки. Нанесите очищенные кардиомиоциты на 96-луночные планшеты MECM, как описано выше на этапах 1.9-1.11 (7,5 × 105 клеток/лунка).

4. Оптическое картирование с использованием чувствительных к напряжению красителей (VSD) и кальций-чувствительных флуорофоров (CSF)

  1. Приготовьте соответствующее количество VSD в HBSS с кальцием и магнием, добавив 1 мкл красителя VSD на мл HBSS и 10 мкл загрузочного адъюванта на мл HBSS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Как правило, для 96-луночного планшета требуется 10 мл раствора VSD.
  2. В качестве альтернативы можно приготовить HBSS с кальцием и магнием с добавлением 5 мкМ спинномозговой жидкости. Аспирируйте поддерживающую среду кардиомиоцитов и замените 100 мкл VSD или CSF на лунку 96-луночного планшета. Инкубируют клетки в течение 30 мин в инкубаторе клеточных культур.
  3. Удалите красители и замените их проанализирующей средой или HBSS. Уравновешивание при 37 °C для получения базовых данных оптического картографирования с помощью высокопроизводительного оптического картографического устройства.
  4. Обработайте клетки препаратами для тестирования на острое воздействие или сопоставьте клетки, которые подвергались хроническому воздействию интересующих лекарств.
  5. Для тестирования кардиотоксичности на 96-луночных планшетах используйте четыре дозы соединения, по крайней мере, с шестью лунками на дозу. Используйте дозы в диапазоне от ниже до выше эффективной терапевтической концентрации в плазме, включая дозу клинической эффективной терапевтической концентрации в плазме.
  6. Разбавьте препараты в диметилсульфоксиде, храните их в виде исходных растворов при -20 °C, а затем разбавьте их в HBSS до желаемых концентраций.
  7. Перед применением лекарственного средства проведите базовые электрофизиологические измерения, как описано в разделе 5. После того, как препараты были применены, сделайте электрофизиологические записи не менее чем через 30 минут для хронических исследований. Процедуры сбора и анализа данных оптического картографирования см. в следующих разделах.

5. Оптическое картирование с использованием генетически кодируемого кальциевого индикатора (GECI)

  1. Пластины, коммерчески доступные или очищенные MACS-hiPSC-CM, как описано выше, с использованием 96-луночных пластин с покрытием MECM для изготовления зрелых hiPSC-CM. Для формирования сливающихся монопластов плита 7,5 × 104 СМ на скважину каждой 96-луночной плиты. Используйте гальваническую среду.
  2. Через 48 ч в гальванической среде переключитесь на поддерживающую среду кардиомиоцитов.
  3. На 4-й день после размораживания и повторного окрашивания добавьте рекомбинантный аденовирус для экспрессии GCaMP6m (AdGCaMP6m) в клетки при кратности инфекции (MOI) = 5. Добавьте вирус с помощью среды для анализа CM.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь эксперименты с использованием GCaMP6m были проведены в кардиомиоцитах iCell2 от коммерческого поставщика.
  4. На 5-й день удалите носитель adGCaMP6m и замените его свежим RPMI+B27 (поддерживающая среда кардиомиоцитов).
  5. На 7-й день наблюдайте за КМ с помощью микроскопии или оптического картографа, чтобы визуализировать спонтанные сокращения и соответствующие переходные процессы кальция.
  6. На 7-й день или позже, для скрининга лекарств, непосредственно перенесите 96-луночные планшеты зрелых монослоев hiPSC-CM, экспрессирующих GCaMP6m, в оптический картографирующий тепловизор из инкубатора для сбора исходных данных.
  7. После сбора данных электрофизиологии верните планшеты КМ в инкубатор для культивирования тканей для измерений в последующий момент времени.
  8. После исходных записей применяйте лекарства, используя не менее четырех доз каждого лекарства и не менее шести лунок на дозу. Уравновешивайте лекарства на клетках в течение не менее 30 минут до сбора данных. Нагрейте температуру скважины до ~37 °C до и во время сбора данных.
  9. После базовой регистрации всей пластины добавьте изопротеренол (500 нМ) в каждую лунку, чтобы получить надежные данные об ответе на лекарство. Количественно оцените влияние изопротеренола на частоту биения монослоя, амплитуду сжатия (эмплитуду переходного процесса кальция) и продолжительность переходного процесса кальция (см. рис. 6), как описано в разделе 5.

6. Сбор и анализ данных оптического картографирования

  1. Убедитесь, что камера оптического картографического устройства, трансиллюминатор и нагреватель пластин включены.
  2. Откройте программное обеспечение для сбора данных и определите место сохранения файла.
  3. Откройте передний ящик и установите тарелку на нагреватель.
  4. Получите темную рамку, нажав кнопку « Темная рамка ».
  5. Выберите «Продолжительность (10–30 с)» и «Частота кадров съемки» (например, 100 кадров в секунду; 250 кадров в секунду для более высокого временного разрешения) и нажмите «Начать съемку».
  6. Откройте аналитическое программное обеспечение и на вкладке « Импорт/фильтр » выберите « Обзор одного файла» или « Несколько плиток », чтобы восстановить пластину.
  7. Выберите «Режим параметров» (APD или CaTD), введите «Расстояние на пиксель» и используйте мастер скважин для определения местоположения скважин на изображении. Нажмите кнопку Process Save (Сохранить процесс), чтобы перейти на следующую вкладку.
  8. Откройте вкладку ROI (области интереса) и выберите, чтобы нарисовать ROI вручную, автоматически или вообще не использовать ROI, что затем рассмотрит весь колодец для анализа. После того, как рентабельность инвестиций будет выбрана, нажмите кнопку «Обработать/Сохранить», чтобы перейти к следующему шагу. Установите флажки «Скрыть колодцы» и «Показывать только отфильтрованные», чтобы визуализировать рентабельность инвестиций.
  9. Откройте вкладку «Анализ » и в правом верхнем углу экрана выберите каждую скважину или ROI , чтобы подтвердить точность автоматического обнаружения ударов. Добавьте или удалите биты из трассировок, нажав «Добавить бит» / «Сохранить биты» или выбрав отдельный бит и нажав клавишу «Delete » на клавиатуре.
  10. При желании используйте функцию «Средние тепловые карты » для создания тепловых карт выбранных параметров для пластины.
  11. Нажмите кнопку «Пространственно-временной график» на вкладке «Анализ», чтобы визуализировать данные для каждой скважины или окупаемости инвестиций. Убедившись, что определение биений точно, перейдите на вкладку «Экспорт» и выберите «Формат файла». Нажмите «Экспорт» и создайте папку для экспортируемых данных. Перейдите к открытию файлов данных и запустите выбранную процедуру статистического анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Файлы .xlxs предпочтительнее, так как все параметры экспортируются в один файл; Другие форматы (.csv или .tsv) генерируют один файл для каждого параметра.

Результаты

Созревание hiPSC-CM, характеризующееся фазовым контрастом и иммунофлюоресцентной конфокальной визуализацией
График ECM-опосредованного созревания коммерчески доступных hiPSC-CM с использованием 96-луночных планшетов с покрытием MECM представлен на рисунке 1A. Эти дан...

Обсуждение

Существует несколько различных подходов к скринингу кардиотоксичности in vitro с использованием hiPSC-CM. В недавнем документе «Передовая практика» по использованию hiPSC-CM были представлены различные анализы in vitro , их первичные показания и, что важно, детализация каждого анализа для...

Раскрытие информации

TJH является консультантом и научным советником StemBioSys, Inc. TB является сотрудником StemBioSys, Inc. AMR и JC являются бывшими консультантами StemBioSys, Inc. TJH, TB, AMR и JC являются акционерами StemBioSys, Inc.

Благодарности

Эта работа была поддержана грантами NIH HL148068-04 и R44ES027703-02 (TJH).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
0.25% Trypsin EDTAGibco25200-056
0.5 mg/mL BSA (7.5 µmol/L)Millipore SigmaA3294
2.9788 g/500 mL HEPES (25 mmol/L)Millipore SigmaH4034
AdGCaMP6mVector biolabs1909
Albumin humanSigmaA9731-1G
alpha actinin antibodyThermoFisherMA1-22863
B27Gibco17504-044
BlebbistatinSigmaB0560
CalBryte 520AMAAT Bioquest20650
CELLvo MatrixPlus 96wpStemBiosysN/Ahttps://www.stembiosys.com/products/cellvo-matrix-plus
CHIR99021LC Laboratoriesc-6556
Clear Assay medium (fluorobrite)ThermoFisherA1896701For adenovirus transduction
DAPIThermoFisher62248
DMEM:F12Gibco11330-032
FBS (Fetal Bovine Serum)SigmaF4135-500ML
FluoVoltThermoFisherF10488
HBSSGibco14025-092
iCell CM maintenance mediaFUJIFILM/Cellular DynamicsM1003
iCell2 CMsFUJIFILM1434
Incucyte Zoom Sartorius
iPS DF19-9-11T.HWiCell
IsoproterenolMilliporeSigmaCAS-51-30-9
IWP4Tocris5214
L-ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrateSigmaA8960-5g
L-glutamineGibcoA2916801
LS columnsMiltenyii Biotec130-042-401
MACS Buffer (autoMACS Running Buffer)Miltenyii Biotec130-091-221
MatrigelCorning354234
MitoTracker RedThermoFisherM7512
Nautilus HTS Optical Mapping CuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Nikon A1R Confocal MicroscopeNikon
nonessential amino acidsGibco11140-050
pre-separation filterMiltenyii Biotec130-041-407
PSC-Derived Cardiomyocyte Isolation Kit, humanMiltenyii Biotec130-110-188
PulseCuriBiohttps://www.curibio.com/products-overview
Quadro MACS separator (Magnet)Miltenyii Biotec130-091-051
Retinoic acidSigmaR2625
RPMI 1640 Gibco11875-093
RPMI 1640 (+HEPES, +L-Glutamine)Gibco22400-089
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyii Biotec130-107-086
TnI antibody (pan TnI)Millipore SigmaMAB1691 
Versene (ethylenediaminetetraacetic acid - EDTA solution)Gibco15040-066
Y-27632 dihydrochlorideTocris1254
β-mercaptoethanolGibco21985023

Ссылки

  1. Blinova, K., et al. International multisite study of human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes for drug proarrhythmic potential assessment. Cell Reports. 24 (13), 3582-3592 (2018).
  2. Ma, J., et al. High purity human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: electrophysiological properties of action potentials and ionic currents. American Journal of Physiology. Heart and Circulatory Physiology. 301 (5), 2006-2017 (2011).
  3. Lee, P., et al. Simultaneous voltage and calcium mapping of genetically purified human induced pluripotent stem cell-derived cardiac myocyte monolayers. Circulation Research. 110 (12), 1556-1563 (2012).
  4. Fermini, B., Coyne, S. T., Coyne, K. P. Clinical trials in a dish: a perspective on the coming revolution in drug development. SLAS Discovery. 23 (8), 765-776 (2018).
  5. Strauss, D. G., Blinova, K. Clinical trials in a dish. Trends in Pharmacological Sciences. 38 (1), 4-7 (2017).
  6. Blinova, K., et al. Clinical trial in a dish: personalized stem cell-derived cardiomyocyte assay compared with clinical trial results for two QT-prolonging drugs. Clinical and Translational Science. 12 (6), 687-697 (2019).
  7. Blinova, ., et al. Comprehensive translational assessment of human-induced pluripotent stem cell derived cardiomyocytes for evaluating drug-induced arrhythmias. Toxicological Sciences. 155 (1), 234-247 (2017).
  8. da Rocha, A. M., et al. hiPSC-CM monolayer maturation state determines drug responsiveness in high throughput pro-arrhythmia screen. Scientific Reports. 7 (1), 13834 (2017).
  9. da Rocha, A. M., Creech, J., Thonn, E., Mironov, S., Herron, T. J. Detection of drug-induced Torsades de Pointes arrhythmia mechanisms using hiPSC-CM syncytial monolayers in a high-throughput screening voltage sensitive dye assay. Toxicological Sciences. 173 (2), 402-415 (2020).
  10. Knollmann, B. C. Induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes: boutique science or valuable arrhythmia model. Circulation Research. 112 (6), 969-976 (2013).
  11. Lam, C. K., Wu, J. C. Disease modelling and drug discovery for hypertrophic cardiomyopathy using pluripotent stem cells: how far have we come. European Heart Journal. 39 (43), 3893-3895 (2018).
  12. Jiang, Y., Park, P., Hong, S. M., Ban, K. Maturation of cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells: current strategies and limitations. Molecules and Cells. 41 (7), 613-621 (2018).
  13. Ahmed, R. E., Anzai, T., Chanthra, N., Uosaki, H. A brief review of current maturation methods for human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 178 (2020).
  14. Guo, Y., Pu, W. T. Cardiomyocyte maturation: new phase in development. Circulation Research. 126 (8), 1086-1106 (2020).
  15. Yang, X., Pabon, L., Murry, C. E. Engineering adolescence:maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Circulation Research. 114 (3), 511-523 (2014).
  16. Karbassi, E., et al. Cardiomyocyte maturation: advances in knowledge and implications for regenerative medicine. Nature Reviews Cardiology. 17 (6), 341-359 (2020).
  17. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  18. Herron, T. J., et al. Extracellular matrix-mediated maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiac monolayer structure and electrophysiological function. Circulation. Arrhythmia and Electrophysiology. 9 (4), 003638 (2016).
  19. Block, T., et al. Human perinatal stem cell derived extracellular matrix enables rapid maturation of hiPSC-CM structural and functional phenotypes. Scientific Reports. 10 (1), 19071 (2020).
  20. Gintant, G., et al. Repolarization studies using human stem cell-derived cardiomyocytes: Validation studies and best practice recommendations. Regulatory Toxicology and Pharmacology. 117, 104756 (2020).
  21. Cyganek, L., et al. Deep phenotyping of human induced pluripotent stem cell-derived atrial and ventricular cardiomyocytes. JCI Insight. 3 (12), 99941 (2018).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).
  23. Davis, J., et al. In vitro model of ischemic heart failure using human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. JCI Insight. 6 (10), 134368 (2021).
  24. Diaz, R. J., Wilson, G. J. Studying ischemic preconditioning in isolated cardiomyocyte models. Cardiovascular Research. 70 (2), 286-296 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE193

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены