Экстракция, маркировка и очистка клеток, специфичных для линии, из антральных фолликулов человека

Резюме

Здесь мы представляем протоколы идентификации и очистки клеток яичников от антральных фолликулов. Мы разрабатываем методы обработки целых яичников для криоконсервации кортикальных полосок, а также сбора интактных антральных фолликулов, которые обрабатываются ферментативно для высвобождения нескольких типов резидентных клеток фолликулов, включая гранулезные, тека, эндотелиальные, кроветворные и стромальные клетки.

Аннотация

Активация, рост, развитие и созревание ооцитов является сложным процессом, который координируется не только между несколькими типами клеток яичника, но и между несколькими точками контроля в гипоталамо/гипофизе/яичниковой цепи. В яичнике несколько специализированных типов клеток растут в тесной связи с ооцитами в фолликулах яичников. Биология этих клеток была хорошо описана на более поздних стадиях, когда они легко восстанавливаются как побочные продукты вспомогательного репродуктивного лечения. Однако углубленный анализ небольших антральных фолликулов, выделенных непосредственно из яичника, обычно не проводится из-за нехватки ткани яичников человека и ограниченного доступа к яичнику у пациенток, проходящих вспомогательное репродуктивное лечение.

Эти методы обработки целых яичников для криоконсервации кортикальных полосок с одновременной идентификацией/выделением резидентных клеток яичников позволяют проводить анализ ранних стадий развития антрального фолликула с высоким разрешением. Мы демонстрируем протоколы выделения дискретных типов клеток путем ферментативной обработки антральных фолликулов и разделения гранулезных, тека-, эндотелиальных, кроветворных и стромальных клеток. Выделение клеток из антральных фолликулов различных размеров и стадий развития позволяет всесторонне анализировать клеточные и молекулярные механизмы, которые управляют ростом фолликулов и физиологией яичников, и обеспечивает источник жизнеспособных клеток, которые можно культивировать in vitro для повторения микроокружения фолликулов.

Введение

Основными функциональными элементами яичника человека являются фолликулы, которые регулируют рост и развитие ооцитов. Протоколы выделения фолликулярных клеток хорошо зарекомендовали себя в контексте экстракорпорального оплодотворения, но они подходят только для сбора клеток из лютеинизированных фолликулов в точке извлечения ооцитов¹. Мы разработали протокол, который позволяет выделять дискретные клеточные популяции из антральных фолликулов на разных стадиях развития, которые возникают из нативных яичников или ксенотрансплантированной ткани яичника². Хотя существует консенсус в отношении того, что вклад резидентных клеток фолликулов в культивирование ооцитов очень важен, лишь немногие исследования проспективно идентифицировали и извлекли уникальные фенотипические подтипы, присутствующие в фолликулах антральной стадии. Более глубокое понимание иерархии дифференцировки и передачи сигналов между специализированными клетками на разных стадиях развития может расширить наше понимание физиологии яичников в гомеостатических и патологических условиях. Кроме того, различение дискретных клеточных подтипов и их молекулярного вклада в рост/созревание фолликулов может обеспечить средства создания суррогатов ex vivo , которые реконструируют функцию яичников для стимулирования созревания ооцитов и/или лечения эндокринной дисфункции.

Каждый уникальный тип клеток в яичнике вносит свой вклад в сложную функцию фолликула, который эффективно функционирует как отдельный мини-орган, способствующий росту и созреванию содержащегося в нем ооцита. Ооцит, центральный элемент фолликула, непосредственно окружен непрерывным слоем гранулезных клеток (ГК), при этом тека-клетки (ТК) образуют вторичный слой клеток, которые объединяются с ооцитом и ГК, образуя фолликулярную единицу. Несмотря на то, что ГХ и ТК подразделяются на две группы, они содержат множество подтипов. ГК классифицируются в соответствии с их положением в фолликуле; ГК, которые окружают ооцит, по сравнению с теми, которые примыкают к базальной мембране, обозначаются как оофорные и настенные ГК соответственно, и эти подтипы демонстрируют уникальные транскриптомные сигнатуры. ТК имеют множество подтипов, которые функционируют для обеспечения стероидогенной, метаболической и структурной поддержки. Эндотелиальные, периваскулярные и иммунные клетки играют центральную роль в поддержании нормальной физиологии яичников. Строма яичника служит не только субстратом для роста фолликулов, но и, вероятно, является источником предшественников, которые дают начало ТК. Этот многослойный комплекс клеточных подтипов в яичнике обеспечивает его функцию как эндокринного, так и репродуктивного органа.

В данной работе представлен протокол идентификации и очистки гранулезных, тека-, стромальных, эндотелиальных и кроветворных клеток из антральных фолликулов. Мы использовали этот протокол для выделения этих клеток яичников и их анализа с помощью секвенирования отдельных клеток с последующим специфическим окрашиванием фолликулов на разных стадиях развития. Протокол предоставляет простую методологию, которую можно воспроизвести и которая позволит проводить анализ с высоким разрешением как физиологии, так и патологии яичника.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все процедуры с участием мышей были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) в Weill Cornell Medicine. Все эксперименты по ксенотрансплантации с использованием ткани яичника проводились в соответствии с соответствующими рекомендациями и правилами. Оба яичника были изолированы от 14-летнего донора органов с мертвым мозгом, у которого в анамнезе не было радио/химиотерапии и не было документально подтвержденных эндокринных или репродуктивных заболеваний. Комитет институционального наблюдательного совета (IRB) Weill Cornell Medicine одобрил сбор ткани, и одобрение семьи донора органов было получено после информированного согласия на использование ткани.

1. Сбор и обработка тканей яичников

1. Соберите целые яичники и связанные с ними ткани и промойте в стерильном солевом растворе.
2. С помощью стерильного пинцета поместите яичники в стерильный контейнер. Налейте в контейнер стерильный, буферизованный, холодный раствор (например, среду L-15 Лейбовица). Убедитесь, что ткань полностью покрыта жидкостью.
3. Закройте контейнер и дважды упакуйте его в стерильные полиэтиленовые пакеты. Перевозите контейнер на льду в изолированной коробке (например, пенополистирол). Передайте образцы в лабораторию, которая обработает яичники, как можно скорее, желательно за время, не превышающее 5 ч ^3,4.

2. Обработка ткани яичника

ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что все реагенты и инструменты подготовлены до того, как ткань поступит в лабораторию, чтобы максимально сократить ишемический интервал. Буферы можно приготовить за 1 неделю до замораживания и хранить в холодильнике до использования.

1. Препараты для обработки и замораживания яичников
   1. Набор стерилизованных хирургических инструментов в шкаф биобезопасности при подготовке к тканевой обработке: один скальпель No 21; один скальпель No 11; острые тонкие изогнутые ножницы; один длинный щипец (длина ~150 мм); и два средних щипца (длина ~110 мм).
   2. Приготовьте 100 мл среды для обработки тканей (см. Таблицу материалов): среду L-15 Лейбовица, содержащую раствор антибиотика и антимикотика и отфильтрованную с помощью фильтра 0,2 мкм. Держите среду охлажденной.
   3. Маркируйте криовиалы, добавьте 1,5 мл замораживающего раствора (см. Таблицу материалов) в каждый флакон и храните его при температуре 4 ° C.
   4. Имейте под рукой 6-луночную пластину для использования.
2. По прибытии ткани
   1. Опрыскайте контейнер 70% раствором этанола, тщательно протрите и поместите в шкаф биобезопасности.
   2. Надев стерильные перчатки, откройте контейнер. Поместите яичник в стерильную чашку Петри и залейте охлажденной средой (с шага 2.1.2) для увлажнения ткани. Следите за тем, чтобы яичник был наполовину погружен в среду.
   3. Удалите все швы или другой материал и рассеките остаточную окружающую ткань от яичника.

3. Выделение антральных фолликулов

1. Определите отдельные фолликулы для выделения. Выбирая здоровые фолликулы, исключите любые заполненные кровью, темные или несимметричные фолликулы, так как они, вероятно, будут атретическими.
2. Изолируйте выбранные антральные фолликулы от всего яичника с помощью скальпелей, сохраняя антральный отдел нетронутым, иссекая корковую ткань, охватывающую фолликул.
3. Поместите каждый иссеченный интактный антральный фолликул в одну лунку 6-луночной пластины. Если это необходимо для описательных целей, используйте линейку, помещенную под чашку, чтобы определить диаметр фолликула.
4. С помощью скальпеля разделите пополам неповрежденный антральный фолликул, чтобы получить доступ к антральной полости, и добавьте 4 мл ферментативной среды для отсоединения клеток. Инкубируйте пластину в увлажненном инкубаторе при 5%_CO2 и 37 °C в течение 10 мин.
5. При необходимости повторите экстракцию дополнительных антральных фолликулов.

4. Выделение резидентных клеток фолликула

1. После инкубации добавляют 4 мл доступной среды, содержащей 20% FBS, и промывают путем повторного энергичного пипетирования среды над разделенными пополам фолликулами микропипеткой P1000.
2. Соберите среду и пропустите ее через фильтр 100 мкм.
3. Центрифугу фильтруют надосадочную жидкость при 300 × г и 4 °С в течение 3 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и оставьте клеточную гранулу (обогащенную ГХ) на льду для мечения и сортировки клеток, активированной флуоресценцией (FACS).
4. Поместите оставшуюся ткань в смесь коллагеназы (100 ЕД / мл) и диспазы (1 ЕД / мл), разведенную в сбалансированном физиологическом растворе (например, Хэнкса), и инкубируйте в течение 30 мин при 5% CO₂ и 37 ° C, механически разрушая ткань растиранием и энергичным пипетированием (т.е. 10-15 проходов через наконечник пипетки) дважды через 10 мин и 20 мин.
5. Восстановите среду, содержащую ткань, промойте с помощью пипетки через наконечник микропипетки P1,000 и процедите через фильтр 100 мкм.
6. Центрифуга при 300 × г и 4 °C в течение 3 мин. Аспирируйте надосадочную жидкость и отложите клеточную гранулу (обогащенную TCs и клетками стромы) на лед для маркировки и FACS.

5. Сортировка клеток, активируемая флуоресценцией

1. Ресуспендировать гранулы ячейки в блокирующем растворе (PBS + 0,1% FBS) и инкубировать в течение 10 мин при 4 °C.
2. Центрифугу при 300 × г и 4 °C в течение 3 мин и аспирировать надосадочную жидкость.
3. Ресуспендируют клеточные гранулы в блокирующем растворе, содержащем непосредственно конъюгированные антитела (см. Таблицу 1 для соответствующих комбинаций антител для идентификации ГХ и ТК), и инкубируют на льду в течение 10 мин.
4. Промойте и центрифугируйте клетки при температуре 300 × г и 4 °C в течение 3 мин. Ресуспендируют клетки в буфере FACS, содержащем 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), и пропускают клеточную суспензию через прибор FACS для захвата небольшой популяции клеток (500-1000) с использованием интенсивности флуоресценции флуорофор-конъюгированных антител для стробирования.
5. Для идентификации уникальных субпопуляций используйте следующие стратегии стробирования:
   1. Для очистки ГК нарисуйте ворота вокруг клеток CD45+ (рис. 1B) и исключите эту популяцию из популяции CD99⁺ (рис. 1A и рис. 1C); затем далее разделите оставшуюся фракцию CD99+ на фракции PVRL^+/- (рис. 1A и рис. 1C).
   2. Для очистки ТК и стромы затворите общую популяцию ENG+ (рис. 1A) или CD55+ (рис. 1D), чтобы исключить эндотелиальную фракцию CD34+ (рис. 1E) и различить стероидогенные (ANPEP⁺) и нестероидогенные (ANPEP^-) клетки. Будьте осторожны, чтобы компенсировать утечку между флуорофорами, которые находятся близко по спектрам излучения.
6. Чтобы проверить чистоту фракции отсортированных клеток, пропустите 5% от общего захваченного объема через прибор FACS и убедитесь, что ячейки заполняют ожидаемые вентили и присутствуют с чистотой >95%.

6. Обработка кортикальной ткани яичников

1. Разделите оставшуюся часть яичника пополам и иссеките продолговатый мозг с помощью изогнутых тонких ножниц и скальпелей, стараясь избежать повреждения коры яичника.
2. Продолжайте обрабатывать и истончать кору яичников путем осторожного соскабливания до тех пор, пока не останется минимальное мозговое вещество. Убедитесь, что вы используете минимально необходимое усилие.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Толщина кортикальной ткани должна составлять от 1 мм до 1,5 мм.
3. Разделите корковую ткань на полоски шириной 2-3 мм по длине яичника.

7. Медленное замораживание ткани яичника

1. Подготовка к заморозке
   1. Поместите одну кортикальную полоску в каждый охлажденный криогенный флакон с замораживающим раствором.
   2. Встряхните криогенные флаконы, содержащие кортикальные полоски, на вращающейся пластине в течение 20 мин при 4 °C.
2. Медленное замораживание ткани яичника⁵
   1. Поместите криовиалы, содержащие ткань яичников, в программируемую морозильную камеру, установленную на 0 ° C.
   2. Охладить со скоростью 2 °C/мин до −7 °C.
   3. Поддерживайте криовиалы при этой температуре в течение 10 минут.
   4. Образование кристаллов нуклеата льда путем прикосновения к каждому криовиалу ватным наконечником, который был ненадолго погружен в жидкий азот (LN₂).
   5. Охлаждают со скоростью 0,3 °C/мин до тех пор, пока температура образца не достигнет −40°C.
   6. Увеличьте скорость охлаждения до 10 °C/мин до тех пор, пока температура образца не достигнет −140 °C.
   7. Перевести криовиалы на хранение в LN₂.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Мы выделили фолликулы с поверхности яичника и ферментативно обработали их, чтобы выделить ГК, а также тека и стромные клетки, окружающие антральную полость. Клетки были собраны, а клеточные фракции были отсортированы из антральных фолликулов (диаметр от 0,5 мм до 4 мм) с помощью FACS до чист?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Лучшее разрешение клеточного разнообразия в фолликулах яичников клинически важно по нескольким причинам. При применении приведенного выше протокола к выделению уникальных фенотипических подтипов, которые находятся в фолликулах антральной стадии, следует учитывать несколько фактор...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chemicals, reagents
Antibiotic-Antimycotic 100x	Thermo Fisher Scientific	15240062	Anti-Anti
Antifade Mountant solution	Thermo Fisher Scientific	P36930	ProLong Gold
Collagenase from Clostridium histolyticum	Millipore Sigma	C 2674
DAPI	Thermo Fisher Scientific	D1306
Dispase II, powder	Thermo Fisher Scientific	17105041
DMSO	Millipore Sigma	D 2650	Dimethyl sulfoxide
DPBS, no calcium, no magnesium	Thermo Fisher Scientific	14190144
Enzyme Cell Detachment Medium	Thermo Fisher Scientific	00-4555-56	Accutase
Fetal Bovine Serum, heat-inactivated	Thermo Fisher Scientific	10438026
Hanks′ Balanced Salt solution	Thermo Fisher Scientific	14175079	no calcium, no magnesium, no phenol red
Leibovitz’s L-15 medium	Thermo Fisher Scientific	11415064
Normal Saline	Quality Biological	114-055-101
Sucrose	Millipore Sigma	S 1888
Freezing Medium (100 mL, filtered through a 0.2 micron filter)
- 69.64 mL of Leibovitz's L-15
- 17.66 mL of fetal bovine serum
- 3.42 g of sucrose
- 10.65 mL of DMSO
- 1 mL of antibiotic-antimycotic
Lab Plasticware and Supplies
6-well Clear Flat Bottom Not Treated	Corning	351146	Falcon
Cell Strainer 100 µm	Fisher scientific	352360	Corning, Falcon
Cryovials	Thermo Fisher Scientific	377267	CryoTube 1.8 mL
Petri dish, D x H 150 mm x 25 mm	Millipore Sigma	CLS430599	60EA
Round-Bottom Polystyrene Test Tubes with Cell Strainer Snap Cap, 5 mL	Fisher scientific	352235	Corning, Falcon
Vacuum Filter/Storage Bottle System, 0.22 µm	Corning	431154
Antibodies
ANPEP	BioLegend	301703
CD34	R&D Systems	FAB7227A
CD45	BioLegend	304019
CD55	BioLegend	311306
CD 99	BioLegend	371308
PVRL	BioLegend	340404
Surgical tools
long forceps (~150 mm length)	Fisherbrand	12-000-128	Fisher Scientific
medium forceps (~110 mm length)	Fisherbrand	12-000-157	Fisher Scientific
number 21 scalpel	Andwin Scientific	EF7281H	Fisher Scientific
number 11 scalpel	Andwin Scientific	FH/CX7281A	Fisher Scientific
sharp fine curved scissors	Roboz Surgical	RS-5881
Instruments
FACSJazz Flourescence activated cell sorter	BD
LSM 710 META Confocal microscope	Zeiss