Оценка целостности контрольной точки сборки шпинделя в ооцитах мыши

Резюме

Ошибка в сегрегации хромосом является общей чертой в ооцитах. Поэтому изучение контрольной точки сборки веретена дает важные подсказки о механизмах, необходимых для производства здоровых яиц. Настоящий протокол описывает три дополнительных анализа для оценки целостности контрольных точек сборки веретена в ооцитах мыши.

Аннотация

Анеуплоидия является ведущей генетической аномалией, вызывающей ранний выкидыш и неудачу беременности у людей. Большинство ошибок в сегрегации хромосом, которые приводят к анеуплоидии, происходят во время мейоза в ооцитах, но почему мейоз ооцитов подвержен ошибкам, до сих пор не до конца понятно. Во время деления клеток клетки предотвращают ошибки в сегрегации хромосом, активируя контрольную точку сборки веретена (SAC). Этот механизм управления основан на обнаружении кинетохорных (КТ)-микротрубочек (МТ) креплений и зондировании напряжения, создаваемого волокнами шпинделя. Когда КТ не прикреплены, SAC активируется и предотвращает прогрессирование клеточного цикла. SAC активируется сначала киназой MPS1, которая запускает набор и формирование комплекса митотических контрольных точек (MCC), состоящего из MAD1, MAD2, BUB3 и BUBR1. Затем MCC диффундирует в цитоплазму и изолирует CDC20, активатор анафаз-стимулирующего комплекса/ циклосомы (APC / C). Как только KTs прикрепляются к микротрубочкам и хромосомы выравниваются на метафазной пластине, SAC заглушается, CDC20 высвобождается, а APC / C активируется, вызывая деградацию циклина B и Securin, тем самым позволяя анафазному началу. По сравнению с соматическими клетками, SAC в ооцитах не так эффективен, потому что клетки могут подвергаться анафазе, несмотря на наличие неприкрепленных КТ. Понимание того, почему SAC является более разрешительным и является ли эта разрешительность одной из причин ошибок сегрегации хромосом в ооцитах, все еще нуждается в дальнейшем изучении. Настоящий протокол описывает три метода всесторонней оценки целостности SAC в ооцитах мыши. Эти методы включают использование нокодазола для деполимеризации МТ для оценки реакции SAC, отслеживание глушения SAC путем отслеживания кинетики разрушения Securin и оценку набора MAD2 в KTs путем иммунофлуоресценции. Вместе эти методы исследуют механизмы, необходимые для производства здоровых яйцеклеток, обеспечивая полную оценку целостности SAC.

Введение

Анеуплоидия, которая возникает из-за ошибок в сегрегации хромосом, является основной причиной ранних выкидышей и тесно связана с ошибками в мейозе¹. Мейоз отличается от митоза тем, что он состоит из двух раундов деления клеток без промежуточного этапа репликации ДНК. При мейозе I гомологичные хромосомы разделяются, в то время как сестринские хроматиды остаются вместе. В ооцитах этот этап подвержен ошибкам, что приводит к производству анеуплоидных яиц².

Чтобы предотвратить ошибки сегрегации хромосом, большинство типов клеток активируют механизм наблюдения, который приостанавливает клеточный цикл, называемый контрольной точкой сборки веретена (SAC). Этот механизм определяет прикрепления кинетохора (КТ)-микротрубочек (МТ), и напряжение генерируется, когда хромосомы ориентированы биполярным образом³. Неприкрепленные кинетохоры вызывают реакцию SAC, которая начинается с набора MPS1, главного регулятора SAC, в кинетохоры ^3,4. MPS1 инициирует набор других компонентов SAC, выступая в качестве платформы для формирования комплекса митотических контрольных точек (MCC). MCC, состоящий из MAD1, MAD2, BUB3 и BUBR1, диффундирует в цитоплазму и ингибирует активацию APC / C путем секвестрации ее активатора CDC20. Как только все кинетохоры стабильно прикреплены к МТ и хромосомы выровнены на метафазной пластине, SAC заглушается, а MCC разбирается и высвобождает CDC20, тем самым позволяя активировать APC / C. Активный APC/C разлагает Securin и Cyclin B, два ключевых шага в запуске анафазного начала ^5,6. В соматических клетках SAC является строгим, поскольку он активируется одним неприкрепленным кинетохором и достаточен для индуцирования остановки клеточного цикла⁶. Однако во время мейоза ооцитов SAC более разрешителен, и ооциты могут входить в анафазу I с одним или несколькими неприкрепленными кинетохорами 6,7,8,9,10. Понимание того, почему SAC является более разрешительным в ооцитах, является постоянной областью внимания в этой области. Механизмы, которые вызывают дефекты активации SAC или глушения SAC, могут привести к ошибкам в сегрегации хромосом или длительной остановке клеточного цикла и гибели клеток. Поэтому оценка механизмов, которые поддерживают целостность SAC в ооцитах, важна для понимания процесса формирования здоровых, эуплоидных яйцеклеток.

Этот протокол описывает методы всесторонней оценки целостности SAC при мейозе ооцитов мыши путем изучения различных критических этапов контрольной точки. Во-первых, описана оценка ответа SAC после индуцирования активации SAC. Эта активация достигается путем генерации неприкрепленных кинетохоров с использованием нокодазола, препарата, который деполимеризует MTs¹¹. Во-вторых, метод мониторинга глушения SAC описан отслеживанием динамики деградации Securin во время созревания ооцитов. Наконец, иммунофлуоресцентный анализ используется для измерения набора MAD2, одного из компонентов MCC, к кинетохорам. Вместе эти анализы всесторонне оценивают целостность SAC во время мейотического созревания ооцитов.

протокол

Все мыши, используемые в этих протоколах, были размещены и выращены в соответствии с руководящими принципами Комитета по институциональному использованию и уходу за животными Университета Рутгерса (Протокол 201702497) и Национальными институтами здравоохранения. Эти регулирующие органы одобрили все экспериментальные процедуры, связанные с исследованиями на животных. Все мыши, использованные в настоящем исследовании, были 6-8-недельными самками CF-1.

1. Экспериментальная подготовка

1. Прежде чем начать оценку SAC, соберите мышиные ооциты в соответствии с ранее опубликованным отчетом¹². Разделите собранные ооциты на три группы одинакового размера и храните их в питательных средах Chatot, Ziomek и Bavister (CZB), содержащих 2,5 мкМ милринона (см. Таблицу материалов), чтобы избежать мейотического возобновления¹³.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав CZB: 81,6 мМ NaCL; 4,8 мМ KCl; 1,2 мМ KH₂PO₄; 1,2 мМ МгСО_{4-7Н 2О}; 0,27 мМ Пируват; 1,7 мМ CaCl₂; 30,8 мМ DL-молочная кислота; 7 мМ Таурин; 0,1 мМ ЭДТА; 25 мМ NaHCO₃; Гентамицин; и 0,3% BSA.
2. Подготовьте цРНК к микроинъекции, как описано ранее^12,14. Амплифицируйте мышиный ген Securin из кДНК, клонированной из мышиных зародышевых пузырчатых ооцитов, с последующим субклонированием в вектор pMDL2, содержащий последовательность Gfp^15,16.
   1. Для получения кРНК Securin-Gfp линеаризуйте плазмиду с помощью Nde I пищеварения. Выполняйте транскрипцию in vitro с помощью Т3-РНК-полимеразы и очищая цРНК¹⁶.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Храните цРНК в аликвотах по 2-3 мкл при -80 °C до начала использования.

2. Лечение нокодазолом и визуализация в реальном времени

1. Готовят 1 мл культуральной среды (CZB), содержащей 5 мкМ нокодазола (NOC), 1 мл культуральной среды с 5 мкМ NOC плюс 0,5 мкМ реверсина (NOC + REV) и 1 мл питательной среды с диметилсульфоксидом (DMSO) (1:2000) в качестве контроля (см. Таблицу материалов).
2. Для созревания ооцитов и визуализации в реальном времени используйте 96-луночную пластину, предварительно нагретую в инкубаторе при 37 °C, 5% CO₂ и влажности 80%. В первой скважине нагрузка 150 мкл контрольной обработки ДМСО; во второй скважине нагрузка 150 мкл обработки НОК; и в третьей скважине нагрузка 150 мкл обработки NOC + REV. Храните пластину в инкубаторе в тех же условиях, что и выше, до тех пор, пока это не понадобится.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В 96-луночной пластине избегайте использования первой строки и первого столбца, поскольку тень границы мешает качеству изображений.
3. Чтобы начать мейотическое созревание, удалите мильринон. При просмотре ооцитов под стереомикроскопом с использованием увеличения между 30x-64x вымывайте мильринон из среды, последовательно перенося ооциты через шесть капель 100 мкл свободной от милринона культуральной среды, содержащей ДМСО, и поместите их в соответствующий колодец 96-луночной пластины с помощью пипетки, управляемой вручную или ртом.
   1. Подсчитывайте ооциты, подбирая их с помощью пипетки, управляемой рукой или ртом, и доставляя их к следующей капле, чтобы избежать потери ни одной. Ооциты одиночные, крупные (~80 мкм в диаметре) и круглые клетки. Ядро будет выглядеть как кнопка в центре клетки, а мембрана и пеллюцидная зона будут окружать ооцит.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Переносите ооциты между каплями при перемещении наименьшего количества жидкости. Это позволяет оптимально удалять милринон из питательных сред. Если ооциты не могут возобновить мейоз, вполне вероятно, что милринон не был эффективно удален.
4. Повторите тот же процесс (шаг 2.3) для лечения NOC и NOC + REV.
5. Визуализируйте ооциты с помощью микроскопа Brightfield, оснащенного камерой инкубатора с контролируемой средой в следующих условиях: 37 ° C, 5% CO₂ и 80% влажности. Захват изображений в средней плоскости ооцитов с интервалом 20 мин в течение 24 ч.
6. Количественно оценить количество ооцитов, которые выдавливают полярное тело (ПБ), путем идентификации клеток, которые проходят через асимметричный цитокинез. Результатом будет маленькая клетка (ПБ) рядом с яйцеклеткой и в пределах общей зоны пеллюцида. Просмотр изображений с помощью программного обеспечения для обработки изображений (ImageJ, см. Таблица материалов).
7. Импортируйте последовательность изображений в программное обеспечение для анализа изображений и выдвигайте кадры до тех пор, пока одна или несколько клеток не пройдут через асимметричный цитокинез. Рассчитайте процент ооцитов, которые выдавливают ПБ от общего количества ооцитов¹⁷.

3. Мониторинг паттерна деградации Securin-gfp во время мейотического созревания

1. Центрифуга 3 мкл кРНК Securin-Gfp (стадия 1.2) при 19,283 х г в течение 30 мин при 4 °C¹⁸.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте супернатант, чтобы избежать загрузки примесей, которые могут вызвать закупорку иглы во время микроинъекции.
2. Следуйте пошаговой микроинъекции ооцитов, подробно описанной в ссылке¹². Микроинъекционные профазные I-арестованные ооциты со 100 нг/мкл цекурин-гфп цРНК, полученные на стадии 1.2.
3. После микроинъекции дайте ооцитам восстановиться и перевести РНК в инкубатор_СО2 в течение не менее 3 ч. Проверьте экспрессию, наблюдая за ооцитами в автоматизированной многоканальной флуоресцентной системе визуализации (см. Таблицу материалов) для просмотра сигнала GFP.
4. Как описано на этапе 2.2, загрузка 150 мкл культуральной среды с или без 5 мкМ нокодазола и 150 мкл культуральной среды с 0,5 мкМ реверсина в трех различных скважинах 96-луночной пластины.
5. Промывайте микроинъекционные ооциты через шесть капель культуральных сред без милринона и переносите 1/3 ооцитов в каждую обработку.
6. Держите пластину в инкубаторе при температуре 37 °C, с влажностью 5% CO₂ и 80% до тех пор, пока ооциты не возобновятся мейозом, примерно через 3 ч после промывания милриноном.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стереомикроскоп с увеличением между 30x-64x для оценки разрушения ядерной оболочки как отличительной черты мейотического возобновления.
7. Запись изображений созревания ооцитов с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного камерой инкубатора, как описано на этапе 2.6. Используйте настройки яркого поля, чтобы найти ооциты в колодце. Используйте фильтр 488 для обнаружения сигнала Securin-gfp и регулировки интенсивности флуоресценции, чтобы избежать чрезмерного воздействия на клетки.
   1. Если система визуализации автоматизирована, сохраните положения ооцитов в каждой лунке. Поскольку Securin-gfp равномерно распределяется в цитоплазму, захватывают изображения в средней плоскости ооцитов с интервалом 20 мин в течение 24 ч. Чтобы запечатлеть группы ооцитов на одном снимке, используйте объектив с меньшим увеличением, такой как 10x.
8. Используйте программное обеспечение для анализа изображений для количественной оценки разрушения Securin-gfp. Откройте изображения канала GFP. Начните с точки времени 1. В предпочтительном программном обеспечении для анализа используйте инструмент выделения или формы, чтобы отметить каждую яйцеклетку и сгенерировать интересующую область (ROI) для каждой клетки.
   1. Используйте ту же рентабельность инвестиций, чтобы выбрать фоновую область, которая будет вычтена позже. Измерьте интенсивность пикселей GFP в каждом ROI.
9. Используя ROI для каждого ооцита, сгенерированного на шаге 3.8, измерьте интенсивность GFP во всех временных точках.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых программах вкладка «Анализ» позволяет выбрать функцию «Измерение».
   1. Затем перейдите к следующему таймфрейму и повторите этот процесс, чтобы измерить интенсивность GFP в каждом таймфрейме. Наконец, из каждого значения GFP вычтите измерение ROI в фоновом режиме, выбранном на шаге 3.8. Этот анализ даст значение интенсивности Securin-gfp для каждого ооцита в каждый момент времени.
10. Извлеките различные параметры из паттерна разрушения Securin: (a) время начала деградации Securin-gfp. Это говорит о том, когда началось замалчивание SAC; (b) время минимального сигнала Securin-gfp. Это говорит о том, когда глушение SAC упало ниже порогового уровня, чтобы обеспечить высокую активацию APC / C и полную деградацию Securin-GFP; c) скорость разрушения Securin-gfp¹⁹. Это говорит о том, как быстро активность SAC падает ниже порогового уровня для активации APC / C и деградации Securin-GFP.

4. Рекрутирование MAD2 у кинетохоров иммунофлуоресценцией при мейотическом созревании

ПРИМЕЧАНИЕ: Для сбора и созревания ооцитов обратитесь к ранее опубликованному отчету¹².

1. Расщепление ооцитов на три группы. Переведите каждую группу ооцитов в 100 мкл капель культуральной среды без милринона. Залейте капли минеральным маслом и поместите их в инкубатор (37 °C, 5% CO₂ и 80% влажности) на 3 ч, 5 ч и 7 ч, чтобы достичь ранней прометафазы I, поздней прометафазы I и метафазы I стадии соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите каждую точку времени в другую посуду, чтобы избежать извлечения одного и того же блюда из инкубатора несколько раз, что влияет на регулярные сроки созревания мейотии.
2. В назначенные моменты времени фиксируют ооциты, перенося их в 500 мкл капель 2% PFA в 1x буфере PHEM в течение 20 мин при комнатной температуре, используя стеклянную посуду с 9 лунками, как описано ранее²⁰. Затем переложите клетки в чистый колодец, содержащий 500 мкл капли блокирующего раствора (PBS + 0,3% BSA + 0,01% Tween-20 + 0,02% NaN₃).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Состав PHEM: трубы 60 мМ; 25 мМ HEPES; 10 мМ ЭГТА; и 2 мМ_MgCl2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В этой точке можно остановиться и хранить ооциты в блокирующем растворе в 9-луночной пластине при 4 °C до удобного времени для завершения иммунофлуоресценции.
3. Для продолжения обнаружения MAD2 переводят ооциты в чистую лунку, содержащую каплю пермеабилизационного раствора объемом 500 мкл (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN₃). Инкубировать в течение 20 мин при комнатной температуре, а затем перенести клетки в новую лунку блокирующего раствора и инкубировать в течение 10 мин.
4. Для остальных стадий иммунофлуоресценции используйте крышку для посуды с 96 лунками с углублениями, как описано ранее²⁰. Используйте увлажненную темную камеру, чтобы избежать воздействия света и испарения. Переведите ооциты в каплю блокирующего раствора объемом 30 мкл с антителом анти-MAD2 (1:1000, кролик) и антицентромерным антителом (ACA) (1:30, человек) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 2 ч при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Крышка для посуды на 96 лунок позволяет одновременно обрабатывать несколько белков и групп.
5. Чтобы промыть избыток первичных антител, переместите клетки в 30 мкл капли 1x буфера PHEM, дополненного 0,5% тритоном, и инкубируйте в течение 10 мин в увлажненной камере. Повторите этот шаг еще два раза.
6. Выполняют четвертую промывку, перенося клетки в каплю 30 мкл 1x буфера PHEM без 0,5% 1x Тритона, и инкубируют в течение 10 мин.
7. Переместите клетки в 30 мкл капли блокирующего раствора, содержащего вторичные антитела, такие как античеловек-633 (1:200) и анти-кролик-568 (1:200) (см. Таблицу материалов) и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите комбинацию флуорофоров на основе лазеров или фильтров вашего микроскопа.
8. Чтобы промыть избыток вторичных антител, повторите шаги 4,5-4,6.
9. Чтобы установить клетки на предметное стекло микроскопа, перенесите клетки на 10 мкл монтажной среды, содержащей DAPI (0,1 мг/мл) (см. Таблицу материалов). Добавьте небольшие точки вазелина в каждый угол крышки, аккуратно поместите их поверх монтажного носителя и медленно нажмите, чтобы распределить. Используйте прозрачный лак для ногтей, чтобы закрепить крышку на слайде. Более подробное описание процесса монтажа см. в ссылке²⁰.
10. Изображение кинетохоров с помощью конфокального микроскопа (см. Таблицу материалов), оснащенного объективом 40x или 63x. Используя сигнал ACA, определите z-диапазон, который позволяет визуализировать всю область хромосомы.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Оптический зум 4,0 и размер z-шага 0,5 мкм могут использоваться в некоторых системах визуализации. Эти параметры могут варьироваться от системы к системе, и потребуется оптимизация.
11. Анализ интенсивности MAD2 на кинетохорах с помощью программного обеспечения для анализа изображений. Сделайте максимальную проекцию z-стека, а затем разделите каналы.
12. Во-первых, создайте маску с помощью канала ACA, выбрав канал ACA, чтобы установить пороговое значение, которое идентифицирует все кинетохорные сигналы. Перейдите на вкладку редактирования и создайте выделенную область. Затем создайте рентабельность инвестиций с этим выбором.
13. Выберите канал MAD2 и введите выборку, созданную на шаге 4.12. Выберите пороговый метод, который лучше адаптируется к сигналу MAD2. Измерьте интенсивность.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите пороговый метод в контрольной обработке и сохраняйте его постоянным при анализе различных методов лечения.
14. Чтобы произвести расчет относительной интенсивности пикселей, разделите интенсивность каждой клетки на среднюю интенсивность ооцитов WT в эксперименте.

Результаты

Оценка чувствительности SAC при лечении нокодазолом
Целью данного эксперимента является оценка активации и силы SAC. При использовании нокодазола для деполимеризации микротрубочек веретена все кинетохоры будут не прикреплены, что вызовет остановку клеточного цикла, опосред?...

Обсуждение

Контрольная точка сборки веретена является критическим механизмом управления во время деления клеток, предназначенным для предотвращения ошибок сегрегации хромосом. Это позволяет ячейке иметь достаточно времени для исправления неправильных насадок KT-MT. Мейоз в ооцитах является под?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumin (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimethyl-sulfoxide (DMSO)	Sigma	D5879
Donkey-anti-rabbit-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Fluorescence microscope
EVOS Onstage Incubator	Life Technologies		Incubator chamber
Glass Bottom 96- well plates N 1.5 uncoated	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
goat-anti-human-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
Human anti-ACA	Antibodies Incorporated	15-234	Dilution 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 equipped with a 63×, 1.40 NA oil immersion objective	Leica
MgSO4·7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazole	Sigma	M1404
Paraformaldhyde (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Rabbit anti- MAD2	Biolegend	924601	Dilution 1/1000; previously Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical	10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Vectashield	Vector laboratories	H-1000