JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол описывает извлечение люмиканов из амниотической мембраны (AM) и условия их хранения в виде экстракта AM (AME) при -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT) в течение 6, 12, 20 и 32 дней для количественной оценки его белков и концентрации люмиканов.

Аннотация

Люмикан представляет собой небольшой богатый лейцином протеогликан в амниотической мембране человека (АМ), который способствует эпителизации роговицы и организации коллагеновых волокон, поддерживая прозрачность роговицы. В настоящей работе предложен способ экстракции белка из АМ для получения люмикана. Кроме того, оценивается стабильность люмикана в экстракте AM (AME), хранящемся при различных температурах и периодах времени. 100 мг АМ размораживали и механически деэпителизировали. Деэпителиализованный АМ замораживали и измельчали до получения мелкого порошка, который солюбилизировали 2,5 мл физиологического буфера с ингибиторами протеазы и центрифугировали для экстракции белка. Супернатант собирали и хранили при -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT) в течение 6, 12, 20 и 32 дней. После этого люмикан был количественно определен в каждом AME. Этот метод позволяет создать доступный и доступный протокол для извлечения люмиканов из AM. На концентрацию люмикана влияли время хранения и температурные условия. Люмикан в АМЕ 12 дней хранился при -20 °C и 4 °C был значительно выше, чем в других AME. Эта экстракт люмикана может быть полезна для разработки методов лечения и фармацевтических решений. Необходимы дальнейшие исследования для определения использования люмикана AME в процессе реэпителизации и заживления ран.

Введение

Одним из наиболее часто используемых методов лечения поражений роговицы является трансплантация амниотической мембраны; однако в последние годы появились новые предложения по использованию различных компонентов амниотической ткани в качестве альтернативных и адъювантных методов лечения. К числу наиболее изученных компонентов АМ относятся те, которые получены из экстракта АМ (АМЕ)1,2,3,4,5,6,7. AM содержит множество растворимых факторов, таких как антиангиогенные белки, интерлейкины (IL), тканевые ингибиторы металлопротеиназ (TIMPs), противовоспалительные белки, опосредованные TSG-6, которые ингибируют внеклеточные ловушки нейтрофилов, факторы роста: эпидермальный фактор роста (EGF), трансформирующий фактор роста (TGF) (альфа и бета), фактор роста кератиноцитов (KGF), фактор роста гепатоцитов (HGF) и люмикан, который поддерживает прозрачность роговицы путем регулирования фибрилтогенеза коллагена1, 2,3,4,5,6,7,8,9.

Люмикан представляет собой небольшой богатый лейцином протеогликан (SLRP), один из основных внеклеточных компонентов интерстициальной коллагеназы в матрице стромы роговицы, отвечающий за организацию коллагеновых волокон и поддержание прозрачности роговицы 4,10,11. Протеогликаны представляют собой молекулы во внеклеточном матриксе (ECM), которые являются основными в проведении клеточной сигнализации и поддержании внутриклеточного гомеостаза12. Сообщалось, что белки ECM управляют клеточными процессами пролиферации, дифференцировки и миграции во время заживления ран11.

Данные свидетельствуют о возможном участии люмикана в процессе реэпителизации роговицы. Saika et al. в исследовании показали, что после травмы роговицы люмикан может быть обнаружен в кератоцитах роговицы между первыми 8 ч и до 3 дней после травмы. Представляя самую высокую концентрацию люмикана на второй и третий день, этот протеогликан впоследствии не обнаруживается на седьмой день13. Эти данные свидетельствуют об участии люмикана в активации процесса реэпителизации роговицы. С другой стороны, в другом исследовании сообщалось, что отсутствие люмиканов задерживает реэпителизацию; Интересно, что добавление люмикана может ускорить процесс реэпителизации 4,11,13. Аналогичным образом, недавнее исследование показало, что люмикан может модулировать воспалительные функции фибробластов роговицылимбуса 14, что предполагает роль люмикана в качестве модулятора воспалительного, антифиброзивного и реэпителиализирующего ответа. Аналогичным образом, люмикан может модулировать реакцию роговицы, взаимодействуя с сигнальными молекулами, такими как Fas-FasL. Кроме того, отсутствие люмикана в нокаутной модели Lum-/- мыши продемонстрировало, что отсутствие люмиканной сигнализации препятствует адекватному восстановлению роговицы15.

В первую очередь, этот метод направлен на демонстрацию осуществимого и доступного способа извлечения люмикана из AM. С помощью этого предпочтительного метода экстракции люмиканов можно получить аналогичные концентрации белков, уменьшая время обработки и делая его более удобным для исследователей по сравнению с предыдущими исследованиями16. Кроме того, этот люмикан AME может быть использован в качестве адъюванта для процессов восстановления и реэпителизации роговицы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Все экспериментальные процедуры были одобрены Институциональным наблюдательным советом (проект No CEI-2020/06/04). AM был получен из Банка АМТа Офтальмологии Валенсии (из деидентифицированных людей), который подготовлен, как описано Чавесом-Гарсией и др.17.

1. Приготовление экстракта амниотической мембраны

  1. Получают 100 мг АМ из амнионного банка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Согласно предыдущему отчету, 50 мг АМ секретирует в общей сложности 10 нг/мл люмикана14. Для получения более высокой концентрации люмикана используют 100 мг АМ, что эквивалентно общей площади 32см2.
  2. Если AM заморожен, разморозьте его при комнатной температуре.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните следующие процедуры под ламинарной проточной вытяжкой класса II B.
  3. Промыть АМ в чашке Петри 10 мл стерильного сбалансированного раствора соли (BSS, см. Таблицу материалов) в течение 2 мин.
    1. Налейте BSS в стакан.
    2. Повторите шаг 3 и визуально подтвердите, что глицериновая среда отсутствует в чашке Петри BSS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Повторите шаг 3. по мере необходимости до тех пор, пока глицериновая среда не присутствует в чашке Петри BSS.
  4. Инкубируют AM с 10 мл диспаза II (1,7 МЕ/мл, см. Таблицу материалов) при 37 °C, 5% CO2 в течение 30 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Dispase II является нейтральной протеазой с мягкой активностью над эпителиальными клетками. Этот фермент эффективно отделяет интактный эпидермис от дермы и изолирует интактные эпителиальные листы18.
  5. После инкубации диспазы выполняют механическую деэпителизацию14 с резиновым полицейским (см. Таблицу материалов). Подтвердите деэпителизацию с помощью микроскопической визуализации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс деэпителизации подтверждается в перевернутом микроскопе с использованием 4x и 20x объективов. Визуализируйте ткань, чтобы исключить наличие какого-либо клеточного слоя.
  6. Вымойте АМ в чашке Петри с 10 мл BSS в течение 2 мин. Налейте BSS в стакан.
  7. Поместите деэпителиализованный AM (dAM) в микроцентрифужную трубку объемом 2 мл. Погрузите дАМ в жидкий азот на 40 мин.
  8. Вручную измельчают замороженный dAM в течение 2-3 мин в предварительно охлаждаемом растворе при -85 °C до получения мелкодисперсного порошка.
  9. В растворе солюбилизируют порошок dAM 2,5 мл раствора ингибитора протеазы (BSS с ингибиторами протеазы).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая таблетка ингибитора протеазы состоит из следующей смеси ферментов: экстракт поджелудочной железы (0,02 мг/мл), термолизин (металлопротеаза) (0,0005 мг/мл), химотрипсин (0,002 мг/мл), трипсин (0,02 мг/мл) и папаин (0,33 мг/мл) (см. Таблицу материалов).
  10. Соберите смесь с помощью микропипетки, и очистите стенки раствора с помощью скальпельного ножа. Поместите смесь в пробирку объемом 5 мл.
  11. Хорошо перемешать с вихрем в течение 30 с.
  12. Гомогенизировать тканевую смесь центрифугированием при 34 х г в течение 20 мин при 4 °С и немедленно центрифугировать при 3360 х г в течение 20 мин при 4 °С.
  13. Собранным супернатантом является AME (рисунок 1). Хранить 0,7 мл каждого AME в разных микроцентрифужных трубках по 2 мл в течение 6, 12, 20 и 33 дней при различных температурных условиях -20 °C, 4 °C и комнатной температуре (RT).

figure-protocol-3589
Рисунок 1: Процесс получения АМЕ и измерения концентрации люмиканов. 100 мг АМ инкубировали с диспазой II при 37 °С в течение 30 мин и механически деэпителиализировали. Деэпителиализованный АМ промывали и погружали в жидкий азот на 40 мин, а затем измельчали до получения мелкого порошка, который солюбилизировали 2,5 мл физиологического буфера с ингибиторами протеазы и центрифугировали. Супернатант собирали и хранили при -20 °C, 4 °C и RT в течение 6, 12, 20 и 32 дней до полного количественного определения белка и люмикана. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

2. Количественная оценка белка AME

ПРИМЕЧАНИЕ: Количественная оценка общего белка в АМЕ должна проводиться сразу после получения. Количественно оценивайте белки с помощью анализа белка Lowry и следуйте инструкциям производителя (см. Таблицу материалов). Рекомендуется, чтобы все стандарты и образцы анализировались в трех экземплярах.

  1. Пипетка 40 мкл каждого образца AME в 96-луночную микропластину.
    1. Подготовьте стандартную кривую в ту же микропластину с использованием стандарта сывороточного альбумина крупного рогатого скота (BSA) для конечной концентрации BSA 0-1 500 мкг/мл (0, 1, 5, 25, 125, 250, 500, 750, 1000 и 1 500 мкг/мл).
  2. Пипетка 200 мкл модифицированного реагента Лоури в каждую скважину. Сразу же перемешайте его на пластинчатом миксере в течение 30 с.
  3. Накройте микропластин алюминиевой фольгой и инкубируйте ее на RT в течение 10 мин.
  4. Пипетка 20 мкл 1x реагента Folin-Ciocalteu в каждую лунку. Сразу же перемешайте его на пластинчатом миксере в течение 30 с.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы приготовить 1x реагента Folin-Ciocalteu, разбавьте 2x (2N) реагента 1:1 сверхчистой водой. Приготовьте 1x реагент Folin-Ciocalteu в тот же день использования, так как разбавленный реагент нестабилен.
  5. Накройте микропластинку от света алюминиевой фольгой и высиживайте ее на RT в течение 30 мин.
  6. Измерьте поглощение образцов при 660 нм в пластинчатом спектрометре ИФА (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет может быть измерен на длинах волн от 650 нм до 750 нм.
  7. Усредните значение поглощения 660 нм стандартных пустых образцов и вычтите его из других значений 660 нм стандартных и неизвестных образцов.
    1. Измерьте поглощение с помощью пластинчатого спектрометра ИФА в режиме конечной точки с низким встряхиванием в течение 10 с.
  8. Используйте стандартную кривую для определения концентрации белка в каждом неизвестном образце.
  9. Для расчета белка определите концентрацию на графике линейной регрессии, используя значения поглощения по оси Y по отношению к концентрациям в мг/мл на оси X каждой стандартной кривой BSA.
    1. Получение уравнения линейной регрессии и значения r для расчета концентрации белка.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Результаты выражаются в виде нормализованных относительных значений концентрации общего белка относительно мг АМ (мкг/мл белка/мг ткани АМ).

3. Количественная оценка Lumican в AME

ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация люмикана должна быть измерена в АМЕ, хранящемся в различных условиях хранения и периодах времени. Количественно оцените люмикан с помощью сэндвич-ИФА и следуйте инструкциям производителя. Рекомендуется, чтобы все стандарты и образцы анализировались в двух экземплярах.

  1. Разбавить человеческое люмиканное захватное антитело (см. Таблицу материалов) до используемой концентрации в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флакон с захватным антителом содержит 120 мкг антитела. После восстановления 0,5 мл ПБС разводят захватным антителом в рабочем растворе 2 мкг/мл.
    1. Мгновенно пипетку 100 мкл на лунку разбавленного захвата антитела к 96-луночной микропластине. Заключите пластину в оболочку и высиживайте ее на ночь в RT.
  2. Аспирировать каждую скважину и промыть ее пипеткой с 300 мкл промывочного буфера: 0,05% монолаурат полиоксиэтиленсорбитана 20 в PBS, рН 7,2-7,4 (см. Таблицу материалов) с использованием многоканального пипеттера. Повторите три раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После последней стирки удалите оставшийся буфер для стирки, покрыв тарелку, и осторожно прижмите ее к бумажным полотенцам.
  3. Блокируют пластины добавлением 300 мкл разбавителя реагента: 1% BSA в PBS, рН 7,2-7,4, 0,2 мкм фильтруют (см. Таблицу материалов) в каждую скважину. Инкубировать на РТ в течение 1 ч.
  4. Повторите шаг 2.
  5. Подготовьте стандартную кривую в 96-луночную микропластину с использованием двукратного последовательного разбавления от 0 до 8000 пг/мл для конечных концентраций 125, 250, 500, 1000, 2000, 4000 и 8000 пг/мл. Комплект люмиканов ELISA содержит рекомбинантный люмикан стандарта 75 нг (см. Таблицу материалов).
  6. Добавьте 100 мкл образцов и стандартную кривую в 96-луночную микропластину, покрытую антителами.
  7. Накройте микропластинкой и инкубируйте в течение 2 ч при РТ с низким перемешиванием в компактном коромысле, поддерживающем скорость между 2-3 об/мин.
  8. Повторите шаг 2.
  9. Добавьте 100 мкл антитела к биотинилированному детектированию (см. Таблицу материалов) в каждую лунку. Накрыть от света и инкубировать 2 ч на РТ с низким перемешиванием в компактном коромысле, поддерживающем скорость между 2-3 об/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Флакон с биотинилированным антителом содержит 24 мкг антитела. После восстановления 1,0 мл разбавителя реагента разводят антитело к биотинилированному детектированию в рабочем растворе 400 нг/мл.
  10. Повторите шаг 2.
  11. Добавляют в каждую лунку 100 мкл рабочего разбавления стрептавидин-пероксидазы хрена (HRP, см. Таблицу материалов). Накройте микропластинку от света и инкубируйте в течение 20 минут на RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Реактивный стрептавидин-HRP был 40-кратно концентрированным. Рабочий раствор 1х стрептавидина-HRP изготавливали с разбавителем реагента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размещения пластины при прямом освещении.
  12. Повторите шаг 2.
  13. Наконец, добавьте 100 мкл раствора субстрата тетраметилбензидина (TMB, см. Таблицу материалов) в каждую лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Готовят раствор ТМБ с равным объемом стабилизированного 30% раствора перекиси водорода, предусмотренного в комплекте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте раствор непосредственно перед использованием и выдерживайте его при комнатной температуре.
  14. Инкубировать в течение 30 мин при РТ в темном месте.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте размещения пластины при прямом освещении. Не аспирируйте раствор TMB, так как дальнейшая промывка не требуется.
  15. Добавляют 50 мкл 1NH2SO4 стоп-раствора, чтобы остановить колориметрическую реакцию. Осторожно постучите по тарелке, чтобы обеспечить тщательное перемешивание.
  16. Немедленно определите поглощение каждой скважины с помощью микропластичного считывателя, установленного на 450 нм в пластинчатом спектрометре ИФА.
  17. Измерьте поглощение с помощью пластинчатого спектрометра ИФА в режиме конечной точки с низким встряхиванием в течение 10 с.
  18. Усредните значение поглощения 450 нм стандартных пустых образцов и вычтите его из других значений 450 нм стандартных и неизвестных образцов.
  19. Используйте стандартную кривую для определения концентрации люмиканов в каждом неизвестном образце.
  20. Для расчета концентрации люмиканов составьте линейный график регрессии, используя значения поглощения по оси Y по отношению к концентрациям в пг/мл на оси X каждой стандартной люмиканской кривой.
    1. Получение уравнения линейной регрессии и значения r для вычисления концентрации люмикана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрацию люмикана нормализовали по отношению к мг экстрагированной ткани. Результаты выражаются в виде нормализованных относительных значений концентрации люмикана к мг АМ (нг/мл люмикан/мг АМ ткани).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Результаты сообщаются как среднее значение ± стандартного отклонения (SD). Были проведены студенческие т-тесты и анализ дисперсии (ANOVA). P-значения < 0,05 были признаны статистически значимыми. Статистический анализ проводился с использованием статистического программного обесп?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

В данном исследовании анализировалось наличие люмикана в АМЕ и его прямая корреляция с его стабильностью при различных условиях хранения. Интересно, что когда общая концентрация белка в АМЕ была количественно определена, концентрация белка увеличивалась после хранения. Данные свидет...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

Исследование финансировалось Программой поддержки научно-исследовательских и технологических инновационных проектов Национального автономного университета Мексики (грант No PAPIIT IN203821) и Министерства образования, науки, технологий и инноваций (грант No SECTEI 250/2019).

Благодарности

У авторов нет конкурирующих финансовых интересов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 N H2SO4 stop solutionR&D SystemsDY994
100 μL micropipetteEppendorf
1000 μL micropipetteEppendorf
15 mm Petri dishSymlaboratorios
18 G Needle (1.2 mm x 40 mm)BD Becton Dickinson 305211
2 mL microcentrifuge tubeEppendorfZ606340
20 mL plastic syringe BD Becton Dickinson 302562
20 μL micropipetteEppendorf
20-200 μL micropipetteEppendorf
5 mL microcentrifuge tubeEppendorf30119401
96-well microplateSARSTEDT821581
Aluminum foilN/AN/A
Amniotic membraneInstituto de Oftalmologia Conde de Valenciana Amnion Bank100 mg
Balanced salt solutionBausch + LombBSS-403802
BeakerN/AN/A
BioRender BioRenderfigures design 
Compact RockerBioRad970822DDMod. 5202SD-BIO
complete, EDTA-free, Protease inhibitor
cocktail tablets		Roche11 873 580 001Protease Inhibitor
Daiggner vortex Genie 2A.Daigger & Co. , INC22220A
Dispase IIGibco17105-041
ELISA plate spectrometerThermo Labsystems 35401106Multiscan
Freezer
GraphPad Prism GraphPad Software, Incversion 9statistical analysis and graphic program 
Human lumican DuoSet ELISA kitR&D SystemsDY2846-05includes human Lumican capture antibody
Incubator Forma Scientific 3326 S/N 36481-7002
Inverted light MicroscopeOlympus 6A13921to confirm de-epithelialization  Mod.CK2
Laminar flow hoodForma Scientific 14753-567Mod.1184
Liquid nitrogenN/AN/A
MortarN/AN/A
Multi-channel pipettorEppendorf
Nitrogen TankThermo ScientificMod. Biocan 20
Paper towelsN/AN/A
Phosphate-buffered salineR&D SystemsDY006
Pierce Modified Lowry Protein Assay KitThermo Scientific23240
Plate sealersR&D SystemsDY992
Reagent diluentR&D SystemsDY9951% BSA in PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μm filtered
Refrigerated centrifugecenturion scientific Ltd 15877Mod. K2015R
Rubber policeman cell scraperNEST710001for mechanical de-epithelialization
Scalpel knifeBraunBB521No. 10 or 21
Streptavidin-HRP 40-fold concentrated R&D Systemspart 893975
Substrate tetramethylbenzidine (TMB) solutionR&D SystemsDY999
Toothed tweezersInvent Germany6binox 
Ultrapure waterPISA
Wash bufferR&D SystemsWA1260.05% Tween 20 in PBS, pH 7.2-7.4

Ссылки

  1. Jirsova, K., Jones, G. Amniotic membrane in ophthalmology: properties, preparation, storage and indications for grafting-a review. Cell and Tissue Banking. 18 (2), 193-204 (2017).
  2. Witherel, C., Yu, T., Concannon, M., Dampier, W., Spiller, K. Immunomodulatory effects of human cryopreserved viable amniotic membrane in a pro-inflammatory environment in vitro. Cellular and Molecular Bioengineering. 10 (5), 451-462 (2017).
  3. Ruiz-Cañada, C., et al. Amniotic membrane stimulates cell migration by modulating transforming growth factor-β signalling. Journal of Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 12 (3), 808-820 (2017).
  4. Yeh, L., et al. Soluble lumican glycoprotein purified from human amniotic membrane promotes corneal epithelial wound healing. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (2), 479(2005).
  5. Navas, A., et al. Anti-Inflammatory and anti-fibrotic effects of human amniotic membrane mesenchymal stem cells and their potential in corneal repair. Stem Cells Translational Medicine. 7 (12), 906-917 (2018).
  6. Magaña-Guerrero, F., Domínguez-López, A., Martínez-Aboytes, P., Buentello-Volante, B., Garfias, Y. Human amniotic membrane mesenchymal stem cells inhibit neutrophil extracellular traps through TSG-6. Scientific Reports. 7, 12426(2017).
  7. Garfias, Y., Zaga-Clavellina, V., Vadillo-Ortega, F., Osorio, M., Jimenez-Martinez, M. Amniotic membrane is an immunosuppressor of peripheral blood mononuclear cells. Immunological Investigations. 40 (2), 183-196 (2010).
  8. Koob, T., et al. Biological properties of dehydrated human amnion/chorion composite graft: implications for chronic wound healing. International Wound Journal. 10 (5), 493-500 (2013).
  9. Miyagi, H., Thomasy, S., Russell, P., Murphy, C. The role of hepatocyte growth factor in corneal wound healing. Experimental Eye Research. 166, 49-55 (2018).
  10. Chen, S., Mienaltowski, M., Birk, D. Regulation of corneal stroma extracellular matrix assembly. Experimental Eye Research. 133, 69-80 (2015).
  11. Karamanou, K., Perrot, G., Maquart, F., Brézillon, S. Lumican as a multivalent effector in wound healing. Advanced Drug Delivery Reviews. 129, 344-351 (2018).
  12. Theocharis, A., et al. Cell-matrix interactions: focus on proteoglycan-proteinase interplay and pharmacological targeting in cancer. FEBS Journal. 281 (22), 5023-5042 (2014).
  13. Saika, S., et al. Role of lumican in the corneal epithelium during wound healing. Journal of Biological Chemistry. 275 (4), 2607-2612 (2000).
  14. Domínguez-López, A., et al. Amniotic membrane conditioned medium (AMCM) reduces inflammatory response on human limbal myofibroblast, and the potential role of lumican. Molecular Vision. 27, 370-383 (2021).
  15. Vij, N., Roberts, L., Joyce, S., Chakravarti, S. Lumican regulates corneal inflammatory responses by modulating Fas-Fas Ligand signaling. Investigative Opthalmology & Visual Science. 46 (1), 88(2005).
  16. Mahbod, M., et al. Amniotic membrane extract preparation: What is the best method. Journal of Ophthalmic and Vision Research. 9 (3), 314-319 (2014).
  17. Chávez-García, C., et al. Ophthalmic indications of amniotic membrane transplantation in Mexico: an eight years Amniotic Membrane Bank experience. Cell and Tissue Banking. 17 (2), 261-268 (2015).
  18. Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase. Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).
  19. Bhatnagar, B. S., Bogner, R. H., Pikal, M. J. Protein stability during freezing: separation of stresses and mechanisms of protein stabilization. Pharmaceutical Development and Technology. 12 (5), 505-523 (2007).
  20. McClain, A. K., McCarrel, T. M. The effect of four different freezing conditions and time in frozen storage on the concentration of commonly measured growth factors and enzymes in equine platelet-rich plasma over six months. BMC Veterinary Research. 15 (1), 292(2019).
  21. Tamhane, A., et al. Evaluation of amniotic membrane transplantation as an adjunct to medical therapy as compared with medical therapy alone in acute ocular burns. Ophthalmology. 112 (11), 1963-1969 (2005).
  22. Shtein, R., et al. Autologous serum-based eye drops for treatment of ocular surface disease. Ophthalmology. 127 (1), 128-133 (2020).
  23. Shahriari, H., Tokhmehchi, F., Reza, M., Hashemi, N. Comparison of the effect of amniotic membrane suspension and autologous serum on alkaline corneal epithelial wound healing in the rabbit model. Cornea. 27 (10), 1148-1150 (2008).
  24. Schuerch, K., Baeriswyl, A., Frueh, B., Tappeiner, C. Efficacy of amniotic membrane transplantation for the treatment of corneal ulcers. Cornea. 39 (4), 479-483 (2019).
  25. Chen, H., et al. Amniotic membrane transplantation for persistent corneal ulcers and perforations in acute fungal keratitis. Cornea. 25 (5), 564-572 (2006).
  26. Guo, Q., et al. A comparison of the effectiveness between amniotic membrane homogenate and transplanted amniotic membrane in healing corneal damage in a rabbit model. Acta Ophthalmologica. 89 (4), 315-319 (2011).
  27. Sabater, A., Perez, V. Amniotic membrane use for management of corneal limbal stem cell deficiency. Current Opinion in Ophthalmology. 28 (4), 363-369 (2017).
  28. Ahmad, T., et al. Autolysis of bovine skin, its endogenous proteases, protease inhibitors and their effects on quality characteristics of extracted gelatin. Food Chemistry. 265, 1-8 (2018).
  29. Mullegama, S. V., et al. Nucleic acid extraction from human biological samples. Methods in Molecular Biology. 1897, 359-383 (2019).
  30. Skog, M., et al. The effect of enzymatic digestion on cultured epithelial autografts. Cell Transplantation. 28 (5), 638-644 (2019).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

188

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены