Количественная оценка циркулярных РНК с использованием цифровой капельной ПЦР

Резюме

Этот протокол описывает подробный метод цифровой капельной ПЦР (dd-PCR) для точной количественной оценки уровней круговой РНК (циркРНК) в клетках с использованием расходящихся праймеров.

Аннотация

Цифровая капельно-полимеразная цепная реакция (dd-PCR) является одним из наиболее чувствительных методов количественной оценки; он фракционирует реакцию почти на 20 000 капель воды в масле, и ПЦР происходит в отдельных каплях. dd-PCR имеет несколько преимуществ по сравнению с обычной qPCR в реальном времени, включая повышенную точность в обнаружении мишеней с низкой плотностью, пропуск эталонных генов для количественной оценки, устранение технических реплик для образцов и демонстрацию высокой устойчивости к ингибиторам в образцах. В последнее время дд-ПЦР стала одним из самых популярных методов точной количественной оценки целевой ДНК или РНК для анализа экспрессии генов и диагностики. Круговые РНК (циркРНК) представляют собой большое семейство недавно обнаруженных ковалентно закрытых молекул РНК, не имеющих 5' и 3' концов. Было показано, что они регулируют экспрессию генов, действуя как губки для РНК-связывающих белков и микроРНК. Кроме того, циркРНК секретируются в жидкости организма, и их устойчивость к экзонуклеазам делает их биомаркерами для диагностики заболеваний. Эта статья направлена на то, чтобы показать, как выполнить дизайн дивергентного праймера, экстракцию РНК, синтез кДНК и анализ dd-PCR для точной количественной оценки конкретных уровней циркулярной РНК (циркРНК) в клетках. В заключение мы демонстрируем точную количественную оценку циркРНК с помощью dd-PCR.

Введение

Последние достижения в технологиях секвенирования РНК и новых вычислительных алгоритмах обнаружили нового члена растущего семейства некодирующих РНК, называемого круговой РНК (циркРНК)¹. Как следует из названия, циркРНК представляют собой семейство одноцепочечных молекул РНК без свободных концов. Они образованы неканоническим сращиванием голова к хвосту, называемым обратным сращиванием, где восходящий акцептор сращивания соединяется ковалентно с нисходящим донорским сайтом сращивания, образуя стабильный круг РНК ^1,2. Этот процесс может быть опосредован несколькими факторами, включая инвертированные повторяющиеся элементы Alu, присутствующие в восходящем и нисходящем потоке циркуляризированных экзонов, или может быть опосредован некоторыми факторами сплайсинга или РНК-связывающими белками (RBP)^2,3. Круговые РНК, генерируемые исключительно из экзонной или интронной последовательности, классифицируются как экзонные циркРНК и циркулярные интронные РНК или ci-РНК, тогда как некоторые экзонные циркРНК сохраняют интрон и называются экзон-интронными циркРНК (EIcircRNAs)^3,4. Функции циркРНК многогранны, включая губку миРНК и/или RBP, регулирующую транскрипцию и регулирующую клеточную функцию путем трансляции в пептиды 3,5,6,7. В нескольких докладах подчеркивается значение циркРНК при различных заболеваниях и физиологических процессах⁸. Кроме того, тканеспецифические паттерны экспрессии и резистентность к перевариванию экзонуклеазы делают ее функциональным биомаркером для диагностики заболеваний, и ее также можно использовать в качестве подходящей терапевтической мишени⁸. Учитывая его важность в регулировании здоровья и заболеваний, точная количественная оценка экспрессии циркРНК является необходимостью часа.

Было разработано несколько биохимических методов для количественной оценки циркРНК в биологических образцах⁹. Одним из наиболее удобных и широко распространенных методов количественного определения циркРНК является обратная транскрипция с последующей количественной полимеразной цепной реакцией (RT-qPCR) с использованием дивергентных пар праймеров¹⁰. Тем не менее, большинство циркРНК находятся в низком изобилии по сравнению с линейными мРНК, что затрудняет их количественную оценку¹¹. Чтобы преодолеть эту проблему, мы стремились использовать цифровую капельную ПЦР (dd-PCR) для точной количественной оценки количества циркРНК в данном образце. dd-PCR - это передовая технология ПЦР, которая следует принципу микрофлюидики; он генерирует несколько водных капель в масле, и ПЦР происходит в каждой капле как индивидуальная реакция¹². Реакция возникает в отдельных каплях и анализируется с помощью капельного считывателя, который дает количество положительных или отрицательных капель для интересующего гена¹². Это наиболее чувствительный метод точной количественной оценки интересующего гена, даже если в данном образце есть только одна копия. Снижение чувствительности к ингибиторам, лучшая точность и пропуск эталонного гена для количественной оценки делают его более выгодным, чем обычный qPCR 13,14,15. Он широко использовался в качестве исследовательского и диагностического инструмента для абсолютной количественной оценки интересующего гена^16,17. Здесь мы описываем подробный протокол dd-PCR для количественной оценки циркРНК в дифференциации миотубок C2C12 мыши и пролиферирующих миобластов C2C12 мыши с использованием расходящихся праймер.

протокол

РНК чувствительна к РНКазам; поэтому все реагенты, инструменты и рабочие места должны быть свободны от РНКазы и обрабатываться с осторожностью.

1. Дивергентная конструкция грунтовки для циркРНК (см. Рисунок 1)

1. Извлеките зрелую последовательность из данных аннотации циркРНК с помощью BEDTools или из браузера генома UCSC, соединив последовательность экзон/интрон, присутствующую между координатами стыкового соединения^18,19.
2. Подготовьте шаблонную последовательность ПЦР длиной 200 нуклеотидов, соединив последние 100 нуклеотидов общей длины последовательности циркРНК с первыми 100 нуклеотидами последовательности¹⁰ циркРНК.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Если длина циркРНК меньше 200 нуклеотидов, то разделите ее на две равные половины и присоедините нуклеотиды от последней половины до начала первой половины.
3. Используйте приведенную выше последовательность шаблонов для проектирования праймера с помощью веб-инструмента Primer3 и установки длины продукта ПЦР в диапазоне от 120 до 180 нуклеотидов в длину²⁰.
4. Используйте настройки primer3 по умолчанию для других параметров, таких как Tm и длина грунтовки. Последовательности праймеров для circBnc2 приведены в таблице 1.
5. Закажите расходящиеся последовательности праймеров для синтеза у любой олигосинирующей компании.

2. Выделение РНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Изолируйте общую РНК из клеток C2C12 мыши, используя любые коммерчески доступные наборы или собственный метод выделения РНК. Внутренний метод изоляции РНК, используемый здесь, был описан ранее²¹. Магнитные кварцевые шарики получают в лаборатории с использованием ранее опубликованного протокола²². Эти магнитные бусины также могут быть приобретены у различных поставщиков.

1. Возьмите одну чашку размером 10 см, содержащую около 5 х 10⁶ пролиферирующих клеток миобластов C2C12 и одну 4-дневную дифференцированную миотубу C2C12 для выделения РНК.
2. Промыть ячейки 10 мл 1x PBS три раза и выбросить PBS с помощью пипетки.
3. Соскоблите ячейки в 1 мл 1x PBS с помощью клеточного скребка, центрифугируйте их при 4 °C в течение 5 мин при 750 x g и выбросьте PBS с помощью пипетки.
4. Добавьте 1 мл реагента выделения РНК (RIR) и лизируйте клетки путем энергичного пипетирования²¹.
5. Добавьте 200 мкл (1/5 объема RIR) хлороформа и вихря в течение 15 с. Центрифугируйте трубку при 4 °C в течение 10 мин при 12 000 х г.
6. Возьмите 400 мкл верхнего водного слоя, загрузите его на кремнеземную колонну и центрифугируйте в течение 1 мин при 12 000 х г при комнатной температуре. Возьмите проточную трубу в новую трубку и добавьте 600 мкл 100% этанола.
7. Добавьте 20 мкл магнитных кварцевых шариков и поместите трубку на термомикшер, установленный при 25 °C и 1 200 об/мин в течение 5 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем шарика может быть увеличен или уменьшен в зависимости от начальных чисел клеток, взятых для лизиса. Магнитные кварцевые шарики могут быть приобретены у коммерческих поставщиков.
8. Поместите трубку на магнитную подставку на 30 с или до тех пор, пока раствор не станет прозрачным. Осторожно выбросьте супернатант с помощью пипетки.
9. Повторное суспендирование шариков магнитного кремнезема в буфере промывки объемом 500 мкл, содержащем 90% этанола. Поместите трубку на магнитную подставку на 30 с. Дважды поверните трубку на магнитной подставке, чтобы вымыть бусины. Дайте бусинам осесть к магниту и выбросьте буфер с помощью пипетки.
10. Повторите шаг 2.9 дважды. После стирки ненадолго раскрутите трубку и поместите ее обратно на магнитную подставку на 30 с. Отбросьте оставшийся буфер для стирки. Высушите трубку на воздухе при 50 °C в течение 3 мин на термомиксаторе, держа крышку открытой.
11. Добавьте 20 мкл воды без нуклеазы и повторно суспендируйте шарики.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Объем элюирования РНК может быть уменьшен до 10 мкл для увеличения концентрации РНК.
12. Поместите в тубы на 2-3 мин при комнатной температуре. Поместите трубку обратно на магнитную подставку и дайте ей постоять в течение 30 с. Соберите растворенную РНК в новую трубку для оценки количества и качества с помощью спектрофотометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: РНК может храниться при −20 °C или −80 °C для длительного хранения. Для получения оптимального результата рекомендуется приступить к этапу синтеза кДНК на следующий день.

3. Синтез кДНК

1. Измерьте концентрацию РНК с помощью спектрофотометра и возьмите 1 мкг РНК для синтеза кДНК.
2. Смешайте 1 мкг общей РНК с 1 мкл смеси dNTP (по 10 мМ каждого из dATP, dTTP, dGTP и dCTP), 4 мкл буфера 5x обратной транскриптазы (RT), 2 мкл 10x RT случайного праймера, 0,25 мкл фермента обратной транскриптазы (200 Ед / мкл) и 0,5 мкл ингибитора РНКАЗЫ (40 Ед / мкл) и составляйте объем до 20 мкл с использованием воды без нуклеазы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Объем фермента обратной транскриптазы может быть изменен в зависимости от исходной концентрации РНК, взятой для синтеза кДНК.
3. Постучите по трубке, чтобы перемешать реакцию и ненадолго вращать. Поместите тубу при температуре 25 °C в течение 10 мин, а затем при 50 °C в течение 1 ч.
4. Чтобы инактивировать фермент, поместите трубку при 85 °C в течение 5 мин.
5. Лед охлаждает трубку в течение 2 мин и добавляет в трубку 480 мкл воды без нуклеазы, чтобы концентрация кДНК достигла 2 нг/мкл.
   ПРИМЕЧАНИЕ: кДНК может храниться при -20 °C или немедленно использоваться для анализа dd-PCR.

4. Рабочий процесс цифровой капельной ПЦР (dd-PCR)

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс dd-PCR включает в себя несколько этапов, начиная с подготовки образца, за которым следует генерация капель, амплификация ПЦР, подсчет капель и анализ данных. Каждый шаг имеет решающее значение для точной генерации данных, поскольку dd-PCR включает в себя абсолютную количественную оценку продуктов и не нуждается в какой-либо стандартной кривой. Следовательно, каждый из различных этапов ДД-ПЦР был описан ниже.

1. Получение реакции дд-ПЦР.
   1. Настройте реакцию ПЦР 22 мкл в ПЦР-трубках или полосках 0,2 мл вместе с отрицательной контрольной трубкой и трубками NTC (нешаблонный контроль).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая отдельная расходящаяся пара праймеров для обнаружения различных циркРНК должна иметь реакцию NTC вместе с тестовыми образцами.
   2. Добавьте 11 мкл мастер-микса dd-PCR (например, EvaGreen Supermix) и 11 мкл воды без нуклеазы, чтобы создать отрицательную контрольную реакционную трубку.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разморозьте мастер-смесь dd-PCR при комнатной температуре с последующим коротким вихрем, чтобы получить однородную смесь. Используйте ту же воду без нуклеаз для установки отрицательной контрольной реакционной трубки и трубок NTC, которые использовались для разбавления кДНК.
   3. Добавьте 11 мкл мастер-микса dd-PCR, 5,5 мкл циркРНК-специфической прямой и обратной праймерной смеси концентрации 1 мкМ и 5,5 мкл воды без нуклеазы для создания реакционных трубок NTC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавить прямые и обратные круговые РНК-специфические расходящиеся праймеры запаса 100 мкМ и перемешать для получения рабочей концентрации 1 мкМ прямой и обратной циркрнК-праймерной смеси; таким образом, конечная концентрация праймера составляет 250 нМ в реакции 22 мкл.
   4. Добавьте 11 мкл мастер-микса dd-PCR, 5,5 мкл циркРНК-специфической прямой и обратной праймерной смеси концентрации 1 мкМ и 5,5 мкл кДНК (2 нг/мкл) для создания пробирок.
   5. За вихрем следует кратковременное центрифугирование всех реакционных трубок для получения однородной реакционной смеси в нижней части трубок.
2. Генерация капель.
   1. Перенесите 20 мкл ПЦР-смеси из ПЦР-пробирок 0,2 мл в пробоотборники картриджа генератора капель.
   2. Осторожно добавьте 70 мкл масла для генерации капель в нефтяные скважины картриджа генератора капель с помощью многоканальной пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Инкубируйте масло для образования капель при комнатной температуре в течение 15 мин перед использованием.
   3. Накройте картридж генератора капель резиновой прокладкой и поместите его в машину генератора капель, чтобы получить пробно-масляную капельную смесь, образующуюся в капельных колодцах картриджа.
3. ПЦР-амплификация.
   1. Перенесите 40 мкл смеси образцов и капель масла из капельных колодцев картриджа генератора капель на 96-луночную ПЦР-пластину с помощью многоканальной пипетки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Осторожно переложите пробу масляной капельной смеси, делая угол к скважинам через кончики многоканальной пипетки, чтобы избежать разрушения капель при переносе их на 96-луночную пластину dd-PCR.
   2. Запечатайте 96-луночную ПЦР-пластину герметизатором из алюминиевой фольги, поместите ее в машинный блок пластинчатого герметика, предварительно нагретый при 80 °C, и нажмите на уплотнение для уплотнения пластины ПЦР.
   3. Теперь поместите пластину в термоциклер dd-PCR и установите программу, как указано в таблице 2 , с температурой крышки, установленной на уровне 105 ° C, и скоростью рампы 2 ° C / с.
4. Подсчет капель.
   1. После того, как ПЦР закончится, поместите пластину на аппарат для счетчика капель dd-PCR с держателем пластины в правильном положении для подсчета капель.
   2. Откройте программное обеспечение для анализа капель и настройте запуск, предоставив входные данные для информации образца.
   3. Нажмите на опцию настройки. Затем нажмите на опцию шаблона , чтобы открыть новый шаблон.
   4. Определите каждую скважину, указав детали эксперимента, такие как название образца (используемая кДНК или отрицательный контроль или NTC), целевое имя (название праймера циркРНК) и тип (неизвестно), а также тип эксперимента как ABS (абсолютная количественная оценка) и Supermix (dd-PCR EvaGreen Supermix) и т. Д.
   5. Наконец, сохраните шаблон и начните запуск, щелкнув опцию запуска и выбрав подсчет по строкам или столбцам. Позвольте машине завершить подсчет капель, который занимает около 1 мин/лунку.
   6. Нажмите кнопку Анализ , чтобы проанализировать данные после завершения считывания капель.
   7. Нажмите кнопку 1D Amplitude , чтобы увидеть положительные и отрицательные капли
   8. Чтобы отделить положительные капли от отрицательных капель, поставьте общую пороговую линию для всех образцов с одной и той же мишенью.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Общее количество капель в каждом образце должно превышать 10 000, чтобы считаться абсолютным количественным показателем. NTC не должен показывать положительное количество капель. Наличие положительных капель в НТК свидетельствует о загрязнении реагентов или усилении праймерных димеров. Трудно выяснить, имеют ли положительные капли праймерные димеры или неспецифические продукты в НТЦ. Рекомендуется проверять праймеры и избегать любого загрязнения реагентов в качестве общей практики для любой ПЦР, включая dd-PCR.
   9. Нажмите кнопку Экспорт , чтобы экспортировать данные о подсчете циркРНК в виде файла .csv. Экспортированные данные показывают количество циркРНК, присутствующих в каждом образце.
   10. Вручную рассчитайте количество циркРНК в каждом образце на нанограмм РНК, учитывая общее количество кДНК, используемой в каждой реакции.

Результаты

Абсолютное число циркРНК в каждом образце может быть получено из экспортированных данных ДД-ПЦР. Количественный анализ ПЦР в реальном времени показал дифференциальную экспрессию circBnc2 в дифференцированных миотрубах C2C12 (данные не показаны). Здесь мы хотели проверить абсолютное чи...

Обсуждение

Исследования CircRNA выросли в последнее десятилетие с открытием высокопроизводительных технологий секвенирования. В результате он был рассмотрен как потенциальная молекула для будущей РНК-терапии. Кроме того, известно, что он действует как биомаркер при нескольких заболеваниях, включа...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.5 ml microcentifuge tube	Tarson	500010
0.2 ml tube strips with cap	Tarson	610020, 510073
Filter Tips	Tarson	528104
DNase/RNase-Free Distilled Water	Thermo Fisher Scientific	10977023
Phosphate-buffered saline (PBS)	Sigma	P4417
Cell scrapper	HiMedia	TCP223
Chloroform	SRL	96764
DNA diluent	HiMedia	MB228
Random primers	Thermo Fisher Scientific	48190011
dNTP set	Thermo Fisher Scientific	R0181
Murine RNase inhibitor	NEB	M0314S
Maxima reverse transcriptase	Thermo Fisher Scientific	EP0743
QX200 dd-PCR Evagreen Supermix	Bio-Rad	1864033
Droplet generation oil for Evagreen	Bio-Rad	1864006
PCR Plate Heat Seal, foil, pierceable	Bio-Rad	1814040
DG8 Cartridges and Gaskets	Bio-Rad	1864007
DG8 Cartridge holder	Bio-Rad	1863051
QX200 Droplet Generator	Bio-Rad	1864002
ddPCR 96-Well Plates	Bio-Rad	12001925
PX1 PCR Plate Sealer	Bio-Rad	1814000
C1000 Touch Thermal Cycler with 96–Deep Well Reaction Module	Bio-Rad	1851197
QX200 Droplet Reader	Bio-Rad	1864003
Quantasoft Software	Bio-Rad	1864011
Silica column	Umbrella Life Science	38220090
UCSC Genome Browser		https://genome.ucsc.edu/
Primer 3		https://primer3.ut.ee/