Культура и визуализация органотипических срезов опухоли псевдомиксомы брюшины ex vivo из резецированных образцов опухолей человека

Резюме

Мы описываем протокол производства, культивирования и визуализации рака человека, который метастазировал на поверхности брюшины. Резецированные образцы опухоли разрезают с помощью вибратома и культивируют на проницаемых вставках для повышения оксигенации и жизнеспособности, после чего следует визуализация и последующий анализ с использованием конфокальной микроскопии и проточной цитометрии.

Аннотация

Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким заболеванием, которое возникает в результате распространения муцинозной первичной опухоли и, как следствие, накопления муцин-секретирующих опухолевых клеток в брюшной полости. ПМП может возникать при различных типах рака, включая аппендикулярный, яичниковый и колоректальный, хотя аппендикулярные новообразования на сегодняшний день являются наиболее распространенной этиологией. PMP сложно изучать из-за его (1) редкости, (2) ограниченных мышиных моделей и (3) муцинозной бесклеточной гистологии. Представленный здесь метод позволяет в режиме реального времени визуализировать и опрашивать эти типы опухолей с использованием органотипических срезов, полученных пациентом ex vivo , в препарате, где микроокружение опухоли (TME) остается нетронутым. В этом протоколе мы сначала описываем приготовление опухолевых срезов с использованием вибратома и последующего длительного посева. Во-вторых, мы описываем конфокальную визуализацию опухолевых срезов и способы мониторинга функциональных показаний жизнеспособности, визуализации кальция и локальной пролиферации. Короче говоря, срезы загружаются красителями для визуализации и помещаются в камеру визуализации, которая может быть установлена на конфокальный микроскоп. Покадровое видео и конфокальные изображения используются для оценки первоначальной жизнеспособности и клеточной функциональности. Эта процедура также исследует трансляционное клеточное движение и паракринные сигнальные взаимодействия в TME. Наконец, мы описываем протокол диссоциации опухолевых срезов, который будет использоваться для анализа проточной цитометрии. Количественный анализ проточной цитометрии может быть использован для терапевтического тестирования от скамьи до постели больного для определения изменений, происходящих в иммунном ландшафте и содержании эпителиальных клеток.

Введение

Псевдомиксома брюшины (ПМП) является редким синдромом с частотой заболеваемости 1 на миллион человек в год¹. Большинство случаев ПМП вызвано метастазами из аппендикулярных новообразований. Учитывая, что у мышей нет аппендикса, похожего на человеческий, моделирование этого типа рака остается чрезвычайно сложной задачей. В то время как первичное заболевание часто излечивается хирургической резекцией, варианты лечения метастатического заболевания ограничены. Таким образом, обоснование разработки этой новой органотипической модели среза заключается в изучении патобиологии PMP. На сегодняшний день не существует аппендикулярных моделей органоидов, которые можно было бы постоянно культивировать; Однако было показано, что недавняя модель полезна для фармакологического тестирования терапевтических агентов и иммунотерапии². Таким образом, мы адаптировали органотипическую систему культивирования срезов, которая использовалась при других типах рака человека, таких как рак головного мозга, молочной железы, поджелудочной железы, легких, яичников и других 3,4,5,6.

В дополнение к аппендикулярным новообразованиям, ПМП иногда возникает при других типах опухолей, включая рак яичников⁷, а в редких случаях - внутрипротоковые папиллярные муцинозные новообразования⁸ и рак толстой кишки⁹. Кроме того, эти опухоли, как правило, растут медленно, с низкими показателями приживления в моделях ксенотрансплантата пациента (PDX)^10,11. Учитывая эти проблемы, существует неудовлетворенная потребность в разработке моделей для изучения этого заболевания, чтобы начать понимать патобиологию PMP и то, как эти раковые клетки: рекрутируются на поверхности брюшины, размножаются и избегают иммунного надзора.

Несмотря на то, что опухолевые срезы вырезаны из системного сосудистого кровообращения, они содержат клеточные и бесклеточные компоненты, включая внеклеточный матрикс, стромальные клетки, иммунные клетки, раковые клетки, эндотелиальные клетки и нервы. Это полуинтактное микроокружение позволяет проводить функциональное исследование этих типов клеток, что является уникальным преимуществом по сравнению с 3D-органоидными культурами, которые состоят только из раковых клеток¹². Хотя органотипические культуры срезов в некоторых отношениях являются преимуществами, они также по своей сути являются подходом, основанным на низкой пропускной способности, по сравнению с 3D-органоидами, которые могут быть расширены, и подходят для мультиплексного скрининга исследуемых терапевтических препаратов^13,14,15. В случае ПМП не было никаких отчетов, документально подтверждающих надежное укоренение и постоянное прохождение органоидов, полученных из ПМП¹⁶. Вероятно, это связано с медленно растущей природой опухолевых клеток, полученных из PMP, а также с низким количеством злокачественных эпителиальных клеток, обнаруженных в этих муцинозных опухолях. Учитывая необходимость разработки моделей для изучения ПМП, органотипические срезы уникально подходят для изучения этого заболевания. Мы представляем протокол подготовки, визуализации и анализа PMP из образцов человека.

протокол

Деидентификация и приобретение всех тканей были выполнены в соответствии с протоколом, одобренным IRB в Калифорнийском университете в Сан-Диего.

1. Подготовка тканей ПМП человека к тканевой обработке и культивированию

1. Транспорт опухолевых тканей и микродиссекция
   1. Подготовьте транспортную и культуральную среду: 10% (об./об.) модифицированной орлиной среды Дульбекко (DMEM), 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 1% пенициллина/стрептомицина (Pen-стрептококк).
   2. По прибытии ткани и в соответствии с протоколом, одобренным IRB, перенесите опухолевые ткани PMP в 35 чашек диаметром 6 см, содержащих полный DMEM.
   3. Микропрепарируют твердые участки опухоли от любого разжиженного муцина с помощью скальпеля. В то время как узелки муцина, встроенные в твердые части ткани, могут быть разрезаны, удалите все разжиженные области опухоли. В дополнение к удалению любого разжиженного муцина или областей высокомуцинозной ткани, удалите любую ткань, которую трудно разрезать скальпелем. Разрежьте тканевые узелки на более мелкие кусочки, размером примерно 1 см³ .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Получение опухолевых узелков, очищенных от муцина и плотного ECM, будет иметь важное значение для успешного разрезания с использованием вибратомы. В качестве контроля качества опухолевая ткань, поступающая в исследовательскую лабораторию, сначала разрезается патологоанатомом, который впоследствии распределяется биорепозиторием UCSD. Доноры тканей, которые подвергаются паллиативному удалению сальникового пирога, являются оптимальными случаями для этого протокола, учитывая высокое бремя болезни, что позволяет производить больше срезов за счет увеличения массы ткани, доступной для исследований.
      ВНИМАНИЕ: Для работы с тканями человека требуется сертификация уровня биобезопасности 2 (BSL2). Обратитесь в учебное заведение для обучения процедурам BSL2.
2. Приготовление агарозы и заделка тканей
   1. Готовят 5% раствор низкоплавкой агарозы в ПБС без ФБС в тот же день поступления ткани. Обратите пристальное внимание на раствор агарозы, так как он имеет тенденцию быстро кипеть.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Агароза с низким содержанием расплава необходима для встраивания кусочков ткани. Агароза с высоким расплавом затвердевает при более высоких температурах, снижая жизнеспособность срезов ткани при встраивании. Кроме того, FBS в растворяющем растворе вызывает образование осадков.
   2. Поместите полученные кусочки ткани в 6-сантиметровую посуду без жидкости. Поместите не более 2-3 штук на 6-сантиметровую посуду, чтобы их можно было снять в виде кубиков агарозы, не нарушая и не касаясь других тканей.
   3. Добавьте жидкий 5% раствор агарозы в 6-сантиметровую посуду, содержащую 1 см³ опухолевых образца. Добавьте достаточное количество агарозы, чтобы покрыть образец. После добавления поместите встроенные салфетки в холодильник с температурой 4 °C на 30 минут.
3. Монтаж образцов тканей на вибратоме
   1. Достаньте застывший агар из холодильника и нарежьте кубики агарозы чуть больше ширины ткани с помощью скальпеля.
   2. Нанесите суперклей на стадию вибратома и аккуратно поместите кубик агарозы на суперклей. Подождите 1-2 минуты, чтобы клей застыл. В этот момент агарозный кубик с тканью следует зафиксировать на этапе.
   3. Закрепите лезвие на вибратоме и установите нужную толщину участка ткани. Для оптимальной последующей визуализации с использованием конфокальной микроскопии срезы должны составлять примерно от 150 до 250 микрон. Нажмите кнопку «Пуск » и продолжайте циклически резать блок агарозной ткани, пока ткань не будет полностью разрезана.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не разрезается или выбивается из агарозного куба, рассмотрите возможность встраивания ткани в агарозу более высокой концентрации и обрежьте любые дополнительные кусочки ткани, которые могут быть слишком плотными для разрезания или прилипать к лезвию вибратомы.
4. Культивирование срезов тканей на проницаемых вставках
   1. Подготовьте проницаемую вставную пластину для культивирования, добавив 2 мл полной среды DMEM над и 3 мл под проницаемой мембраной.
   2. Аккуратно извлеките кусочки ткани из режущей камеры вибратома с помощью тонкой кисти и поместите от двух до четырех ломтиков в проницаемые питательные чашки, содержащие полный носитель DMEM. Через 24 ч аспирируйте носитель с помощью пипетки и замените носитель свежими питательными средами.
   3. Культивируйте срезы до 7 дней при 37 °C/5% CO₂, заменяя среду каждые 24 часа. В этот момент времени добавьте контроль за уничтожением клеток (бортезомиб) и тестируемую химиотерапию 5-фторурацил (5-FU) в питательную среду для выполнения фармакологического вмешательства.
   4. После 7 дней культивирования ожидайте потерю жизнеспособности примерно на 15-25% по сравнению с моментом времени 0 дня (сразу после срезки) в условиях, не обработанных лекарственными препаратами (полный DMEM). Измерьте жизнеспособность, используя живо-мертвые красители, такие как кальцеин AM (живой) и йодид пропидия (мертвый).

2. Конфокальная визуализация срезов тканей живого человека

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как органотипические срезы опухоли были подготовлены, важно определить жизнеспособность тканей для проведения эффективного и оптимизированного последующего анализа. Учитывая, что образцы опухолей имеют толщину 150-250 мкм, настоятельно рекомендуется конфокальная или двухфотонная микроскопия для определения исследований in situ. Проточная цитометрия также может быть использована для определения жизнеспособности и клеточных популяций (методы приведены ниже). Однако пространственное разрешение теряется во время анализа проточной цитометрии, и жизнеспособность, вероятно, недооценивается, учитывая необходимость диссоциации опухолевых срезов механическими и химическими методами.

1. Приготовление реагентов и экспериментальная установка
   1. Поместите срезы опухоли для анализа конфокальной визуализации в одну лунку 12-луночной чашки, содержащей PBS с 1% FBS. Для экспериментов по визуализации кальция вместо PBS инкубируют срезы во внеклеточном растворе кальция, приготовленном следующим образом: 125 мМ NaCl, 5,9 мМ KCl, 2,56 мМ CaCl 2, 1 мМ MgCl₂, 25 мМ HEPES, 0,1% BSA, pH 7,4, 3 мМ глюкозы, стерильно отфильтрованный. Приготовьте этот раствор заранее и храните его до 1 месяца при температуре 4 °C (см. раздел 2.1.8).
   2. Следуя концентрациям и протоколам, рекомендованным производителем, окрашивайте образцы красителями для визуализации (см. Таблицу материалов) для определения жизнеспособности срезов тканей. Изображение в течение 10 мин-1 ч после добавления жизнеспособного красителя.
   3. После инкубации переложите ломтики в оптически прозрачную чашку Петри со стеклянным дном, содержащую PBS с 1% FBS, для использования для визуализации на конфокальном устройстве визуализации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для конфокальной съемки использовалась конфокальная платформа Nikon A1R.
   4. Откройте программное обеспечение для конфокальной визуализации. Начните визуализацию с 10x и выберите режим визуализации XYZ. Затем настройте параметры сбора данных следующим образом.
      1. Включите следующие лазеры: 488 нм и 561 нм. Отрегулируйте усиление до 100 с мощностью лазера 1%. Отрегулируйте мощность и усиление лазера по мере необходимости во время получения изображения. В зависимости от желаемого качества изображения выберите 512 x 512 пикселей или 1024 x 1024 пикселей для более высокого разрешения.
   5. Выберите "Удалить блокировку", а затем выберите "Сканировать", чтобы начать создание образа.
   6. Для визуализации кальция инкубируйте срезы тканей с помощью Fluo-4-AM в течение 1 часа в защищенном от света месте. Следуйте протоколу производителя для растворения Fluo-4-AM в ДМСО. Через 1 ч промойте ломтики 3 раза внеклеточным раствором кальция и следуйте протоколу визуализации на этапах 2.1.4-2.1.5.
   7. Для экспериментов по визуализации кальция с использованием Fluo-4-AM выберите XYZT и снимите выбор с лазера 561 нм, чтобы увеличить скорость захвата. Кроме того, используйте резонансный сканер для дальнейшего увеличения скорости визуализации.

3. Диссоциация живых срезов для проточной цитометрии

ПРИМЕЧАНИЕ: Диссоциация срезов живой ткани может быть использована для нескольких последующих применений, включая иммунотипирование, оценку жизнеспособности и опрос изменений в клеточных популяциях после фармакологического вмешательства. Следует предпринять шаги для обеспечения того, чтобы качество тканей и жизнеспособность клеток поддерживались во время процесса диссоциации.

1. Отрежьте небольшой кусочек от конца наконечника пипетки объемом 1 мл, чтобы расширить отверстие, чтобы обеспечить энергичную механическую диссоциацию путем пипетки в течение 1 минуты.
2. Инкубируйте ломтики при 37 ° C с вращением в течение 5-15 минут в 1 мл буфера для пищеварения, состоящего из DMEM с высоким содержанием глюкозы, 10% щадящей коллагеназы / гиалуронидазы (GCH), 10% FBS и 10% DNaseI (1 мг / мл).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Часто встречаются пакетозависимые изменения коллагеназы/гиалуронидазы.
3. Выполняют энергичное разрушение тканей с помощью механической диссоциации 2-3 раза во время инкубации. Обязательно проверяйте пищеварение на глаз каждые 5 минут на наличие признаков полного пищеварения. При необходимости остановите ферментативное пищеварение, перейдя к шагу 3.1.4.
4. После переваривания срезы и среду для разложения пипеткой помещают поверх фильтра 70 мкм, помещенного поверх конической трубки объемом 50 мл. Собирайте более крупные кусочки с помощью стерильных щипцов или пипетки.
5. Используя тупой задний конец пластикового шприца объемом 5 мл, разомните все более крупные недиссоциированные ломтики и дополнительно промойте 4 мл PBS, содержащего 2% FBS.
6. Возьмите надосадочную жидкость диссоциированной клетки в конической пробирке объемом 50 мл и вращайте при 300 x g в течение 5-10 минут. Удалите надосадочную жидкость и промойте гранулы 1 мл PBS, содержащего 2% FBS.
7. Чтобы подготовить образец к проточной цитометрии, добавьте блокирующий буфер, содержащий 50 мкл человеческого Fc-блока, и оставьте при комнатной температуре на 15 минут. Проведите внеклеточное окрашивание с использованием соответствующих антител в 50 мкл PBS, содержащего 2% FBS.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует множество систем проточной цитометрии. После того, как образец подготовлен к проточной цитометрии, обратитесь к протоколу производителя для работы устройства.

4. Фармакологическое вмешательство с использованием срезов живых тканей для анализа жизнеспособности и пролиферации

ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как органотипические срезы опухоли были подготовлены, интервенционные подходы могут быть выполнены с использованием нескольких методов, включая тестирование лекарств, миРНК, а также вирусную инфекцию срезов живых тканей. Здесь мы обсудим тестирование на наркотики, а также последующие функциональные показания, которые включают анализ жизнеспособности с использованием локальной пролиферации.

1. Приготовьте 10 мл 10% v/v полного DMEM с 10% FBS, 2 мМ L-глютамина, 1% стрептококка.
2. Aliquot 5 мл полной среды для контроля и условий лечения. К оставшимся 5 мл среды добавьте бортезомиб (2 мкМ), чтобы вызвать гибель клеток в опухолевых срезах в качестве положительного контроля.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Бортезомиб в высоких концентрациях является цитотоксическим препаратом, вызывающим гибель клеток. Другие цитостатические препараты могут быть использованы в качестве положительного контроля для уничтожения клеток.
3. Используя от двух до четырех срезов ткани, которые были нанесены на проницаемую посуду, добавляют среду, приготовленную на шаге 4.2, в чашку, а также любые дополнительные комбинированные методы лечения, которые будут использоваться для последующего анализа жизнеспособности LIVE/DEAD с использованием конфокальной микроскопии, как описано на шаге 2.1.2, или используют коммерческий люминесцентный анализ жизнеспособности с использованием последовательно подобранных срезов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательное сопоставление срезов имеет важное значение для анализа люминесцентной жизнеспособности, учитывая, что анализ люминесцентной жизнеспособности основан на клеточном содержании АТФ. Поскольку внутренний контроль теряется во время лизиса клеток, требуются срезы одинакового размера, поскольку результаты зависят от начального количества жизнеспособных клеток (т. е. несбалансированные срезы приведут к несбалансированным результатам). Если пользователь не получает последовательные срезы, люминесцентный анализ жизнеспособности невозможен, и поэтому потребуется другой метод оценки жизнеспособности (проточная цитометрия или анализ живых клеток на основе конфокальной визуализации).
4. Срезы тканей оставляют в культуре, содержащей полный ДМЭМ, на 2-5 дней, меняя среду, а также бортезомиб и 5-ФУ через день.
5. Для анализа люминесцентной жизнеспособности добавьте 500 мкл PBS в 12-луночную чашку и перенесите последовательно подобранные срезы ткани в раствор PBS с помощью кисти или осторожно используйте всасывание пипетки объемом 1 мл, чтобы перенести их.
6. Удалите PBS и добавьте приготовленный люминесцентный раствор для анализа жизнеспособности. Смотрите инструкцию по приготовлению реагента.
7. Добавляют 500 мкл люминесцентного жизнеспособного раствора в каждом условии и инкубируют при медленном вращении на шейкере при комнатной температуре в течение 30 мин. Считывание люминесценции с помощью считывателя люминесцентных пластин.

Результаты

Короче говоря, образцы опухолей человека из PMP получают в соответствии с протоколом, одобренным IRB. Ткань подготавливают, микропрепарируют и затвердевают в агарозной форме для разрезания с помощью вибратома (рис. 1А; Видео 1). После разрезания срезы ткани помещаю?...

Обсуждение

В этой рукописи описывается метод, который может быть использован для культивирования, опроса и анализа образцов опухолей псевдомиксомы брюшины человека (ПМП). Мы использовали многочисленные последующие функциональные анализы для опроса иммунного микроокружения опухоли и платформу ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096x4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA