3-D покадровая визуализация динамики клеточной стенки с использованием калькофтора в Моховом Фискомитриум Патенсе

Резюме

В этой рукописи представлен подробный протокол для изображения динамики 3-D клеточной стенки живой ткани мха, что позволяет визуализировать отслоение клеточных стенок у мутантов ggb и утолщение паттернов клеточных стенок в диком типе во время развития в течение длительного периода.

Аннотация

Покадровая визуализация с флуоресцентной микроскопией позволяет наблюдать динамические изменения роста и развития на клеточном и субклеточном уровнях. В целом, для наблюдений в течение длительного периода метод требует трансформации флуоресцентного белка; однако для большинства систем генетическая трансформация либо отнимает много времени, либо технически недоступна. В этой рукописи представлен протокол для 3-D покадровой визуализации динамики клеточной стенки в течение 3-дневного периода с использованием калькофторового красителя (который окрашивает целлюлозу в клеточную стенку растения), разработанного во мхе Physcomitrium patens. Сигнал калькофторового красителя от клеточной стенки стабилен и может длиться в течение 1 недели без явного распада. С помощью этого метода показано, что отслойка клеток у мутантов ggb (при которой выбавливается бета-субъединица белка геранилгеранилтрансферазы-I) вызвана нерегулируемым расширением клеток и дефектами целостности клеточной стенки. Кроме того, паттерны окрашивания калькфтором меняются с течением времени; менее интенсивно окрашенные области коррелируют с будущими участками расширения/ветвления клеток в диком типе. Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.

Введение

Клеточные стенки растений претерпевают динамические изменения при расширении и развитии клеток ^1,2,3. Поддержание целостности клеточной стенки имеет решающее значение для адгезии растительных клеток во время роста и развития, а также для реакции на сигналы окружающей среды. Хотя визуализация динамики клеточной стенки живых клеток в течение длительного периода времени имеет решающее значение для понимания того, как клеточная адгезия поддерживается во время развития и адаптации к изменениям окружающей среды, современные методы непосредственного наблюдения динамики клеточной стенки все еще сложны.

Покадровая визуализация клеточных изменений может обеспечить информативную динамику развития организма с помощью флуоресцентного микроскопа высокого разрешения 4,5,6,7. В то время как покадровая 3D-визуализация имеет большой потенциал для изучения динамических изменений формы клеток во время роста и развития, метод обычно требует преобразования флуоресцентного белка 4,5,6,7. Однако для большинства систем генетические трансформации либо отнимают много времени, либо технически сложны. В качестве альтернативы уже давно доступны флуоресцентные красители, которые прикрепляются к клеточным компонентам. Флуоресцентные красители могут излучать флуоресцентный свет после облучения светом определенной длины волны. Распространенными примерами являются Edu, DAPI, PI, FM4-64 и кальцифтор белый ^8,9,10. Одним из основных недостатков, однако, является то, что эти красители обычно могут использоваться только в фиксированной ткани или для коротких экспериментов, отчасти из-за вреда, который они наносят клетке ^8,9,10.

Согласно протоколу, представленному здесь, сигналы калькофтора стабильны, когда белый калькофтор смешивается в среде во время покадровых экспериментов во мхе P. patens. Используя этот метод, отслоение клеток у мутантов ggb с использованием 3-D покадровой визуализации наблюдалось в течение 3-дневного периода³ (рисунок 1). Этот метод может быть применен ко многим другим системам, которые содержат клеточные стенки и которые могут быть окрашены калькофтором.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Список материалов и оборудования см. в Таблице материалов , а в Таблице 1 - список решений, которые будут использоваться в настоящем протоколе.

1. Подготовка растений для стеклянной нижней посуды

1. Выращивайте протонемальную ткань мха в агаровой среде BCDAT в чашке Петри 13 см при постоянном белом свете (~50 мкмоль ^{м-2 с-1}) в течение 7 дней при 25 °C в камере роста.
2. Фильтруют-стерилизуют калькофтор белого цвета и хранят при 4 °C до использования. Реагент стабилен в течение нескольких месяцев.
3. Диспергируйте 7-дневную ткань мха в микропробирку объемом 1,5 мл, содержащую 20 мкл стерилизованной воды. Убедитесь, что протонемальная ткань мха достаточно диспергирована в виде небольших кусочков в воде. Для дикого типа (WT) используйте щипцы для отделения протонематы; для мутанта ggb используйте пипетку P-1000.
4. Добавьте 10 мкл стерилизованного белого калькофтора в микропробирку объемом 1,5 мл и оставьте микротрубку вертикально в капюшоне на 2 мин для окрашивания.
5. Сразу после окрашивания смешайте растения с 200 мкл охлажденного BCDATG, содержащего среду BCDAT, дополненную 0,5% (мас./об.) глюкозы и 0,4% (мас./об.) геллановой камеди, путем пипетки P-1000 пять раз.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что среда BCDATG достаточно охлаждена (непосредственно перед затвердеванием среды), чтобы избежать стресса для растений.
6. Переложите смесь, содержащую растения и среду BCDATG, в стеклянную базовую посуду диаметром 27 мм. Убедитесь, что объем BCDATG для смешивания клеток составляет не более 200 мкл и что 200 мкл BCDATG с образцами равномерно распределены по поверхности стеклянной нижней тарелки 7 мм для получения тонкого слоя пленки, так что образцы находятся в пределах объективного рабочего расстояния во время визуализации.
7. После затвердевания в течение 2 мин при комнатной температуре накройте тонкий слой 3 мл охлажденного BCDATG и дайте ему затвердеть в течение 10 мин, чтобы снова затвердеть.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что этапы 1.2-1.5 проводятся в стерильной вытяжке во избежание загрязнения.
8. На дне тарелки нарисуйте по девять линий в параллельном и перпендикулярном направлениях (рисунок 2). Пометьте строки символами от a до h и отметьте столбцы цифрами от 1 до 8. Используйте верхнюю, нижнюю, правую, среднюю и левую стороны, чтобы отметить позиции в пределах каждого квадрата. Например, если растение находится в квадрате во втором ряду и шестом столбце и расположено в верхней левой части квадрата, то этому растению дается название «b6_upper_left».
9. Предварительно культивируйте стеклянную нижнюю посуду, содержащую растения под красным светом в течение 5 дней при 25 °C в камере роста, а затем под белым светом в течение 1-2 дней, прежде чем подвергаться покадровой визуализации каждый день в течение 3 дней. Для WT прекультуру растений в слабом красном свете (0,5 мкмоль ^{m-2 s-1}) сверху в течение 5 дней индуцировать фототропный ответ протонемата, чтобы растения могли прикрепляться к нижней части посуды¹¹.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Слабый красный свет обеспечивается путем пропускания белого света через красный акриловый пластиковый фильтр толщиной 3 мм в светонепроницаемые коробки. Для мутантов ggb предварительная обработка в красный свет является необязательной, так как мутанты ggb не имеют фототропного ответа³.

2. Визуализация и 3D-реконструкция

1. Поместите стеклянную нижнюю тарелку, содержащую растения, на сцену перевернутого конфокального микроскопа, со стеклянным дном, обращенным к цели. Используйте конфокальный микроскоп для визуализации калькофтора с объективом 20x. Делайте снимки с помощью лазера 405 нм, точечного отверстия при 1,0, усиления HV при 100, регулировки смещенного фона при 0, мощности лазера при 5%-7%, размера сканирования 1,024 x 1,024 и скорости сканирования 1/2 кадра/с. Соберите оптические секции 17-30 z-серии с размером шага 1,0 мкм. Назовите изображения с помощью кода на шаге 1.6, например "b6_upper_left-day0", и сохраните.
   1. Выберите канал DAPI в разделе Приобретение и установите флажок Z в ND Acquisition. Чтобы установить нижний и верхний пределы для Z-стека, нажмите кнопки Сверху и Снизу .
2. Чтобы восстановить 3D-изображения, откройте файл .nd2 (рисунок 3A; см. Таблица материалов) и щелкните Том (Рисунок 3B).

3. Визуализация одних и тех же растений в разные моменты времени

1. После каждого снимка поместите стеклянную базовую тарелку обратно в камеру роста.
2. Повторите шаг 2.1 для визуализации и 3D-реконструкции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы найти те же растения, используйте код, упомянутый на шаге 1.6, и дайте название «b6_upper_left-day1» или «b6_upper_left-day2» в зависимости от возраста растений.

Результаты

Этот метод позволяет наблюдать динамику клеточной стенки во время развития у мутантов дикого типа и ggb (рисунок 1). Результаты показали, что области с меньшим утолщением клеточной стенки коррелируют с участками расширения/ветвления клеток, что позволяет прогнозиро?...

Обсуждение

Покадровая 3D-реконструкция, или 4-D визуализация, является мощным инструментом для наблюдения за динамикой клеточной морфологии во время процессов развития. В этом протоколе, путем смешивания белого калькофтора в среде, динамика морфологии 3-D клеток может наблюдаться у мха P. patens. И?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
3-mm-thick red plastic light filter	Mitsubishi	no.102
27 mm diameter glass base dish	Iwaki	3930-035
Agar	Sigma	A6924
Calcofluor white	Sigma	18909-100ML-F	Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L
Confocal microscope	Nikon	A1	NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. com/en_AOM/products/software/nis-elements/viewer
Fluorescence microscope	Nikon	TE200	Equipped with a DS-U3 camera;
Gellan gum	Nacali Tesque	12389-96
Plant Growth Chambers	SANYO	Sanyo MLR-350H
Sterilized syringe 0.22 μm filter	Millipore	SLGV033RS