Определение мультииндексных компонентов в гранулах родиолы тибетской медицины in vitro

Резюме

Здесь мы тестируем растворение гранул родиолы (RG) in vitro, рисуем кривые растворения салидрозида, галловой кислоты и этилгаллата в сверхчистой воде и подгоняем кривые к различным математическим моделям. Этот протокол содержит информацию и рекомендации по биоэквивалентности in vivo и корреляционным исследованиям RG in vivo-in vitro .

Аннотация

Состав гранул родиолы тибетской медицины (RG) сложен, и общее качество RG трудно определить. Поэтому создание метода определения многокомпонентного растворения RG in vitro имеет большое значение для контроля качества. В этом исследовании используется второй метод весла четвертого общего правила 0931 из Китайской фармакопеи (издание 2020 г.), совместимый с аппаратом 2 Фармакопеи США (USP). Аппарат растворения был настроен на скорость вращения 100 об/мин со сверхчистой водой в качестве среды растворения. Объем образца 1 мл был собран в каждый момент времени. Кроме того, с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) определяли кумулятивное растворение галловой кислоты, салидрозида и этилгалловой кислоты в RG в разные моменты времени. Наконец, были построены кривые растворения, и кривые были подогнаны к уравнениям GompertzMod, Gompertz, Logistic и Weibull. Результаты показали, что кумулятивное растворение галловой кислоты в RG составляло более 80% через 1 мин, кумулятивное растворение салидрозида и этилгалловой кислоты составляло более 65% через 5 мин, а кумулятивное растворение каждого компонента индекса уменьшалось через 30 мин. Подгонка кривой показала, что уравнение ГомперцаМода является наиболее подходящей моделью для каждого компонента индекса RG. В заключение, метод испытания на растворение, описанный в этом протоколе, является простым, точным и надежным. Он может охарактеризовать растворение компонентов индекса в RG in vitro, что обеспечивает методологическую основу для контроля качества RG и оценки качества других этнических соединений.

Введение

В Китае распространенность сердечно-сосудистых заболеваний продолжает расти, а показатели заболеваемости и смертности от сердечно-сосудистых заболеваний занимают первое место среди жителей Китая¹. Стенокардия ишемической болезни сердца вызвана стенозом просвета из-за коронарного атеросклероза, что приводит к относительно недостаточному коронарному кровоснабжению и ишемии миокарда и гипоксии². В последние годы лечебный эффект традиционной китайской медицины в лечении ишемической болезни сердца признан многими^{врачами3}.

Традиционная китайская медицина играет важную роль в облегчении клинических симптомов и улучшении качества жизни пациентов⁴. Гранулы родиолы (RG) извлекаются и очищаются из лекарственного растения Тибетского нагорья Rhodiola rosea L. Основными компонентами RG являются салидрозид, родиозин и флавоноиды ^5,6. RG дополняет Qi⁷, активирует и улучшает кровообращение, облегчая боль. Клинически он используется для лечения обструкции грудной клетки, вызванной дефицитом Ци и застоем крови, ишемической болезнью сердца, стенокардией⁸. Само по себе определение содержания не в полной мере отражает внутреннее качество лекарств, поскольку как распад, так и растворение in vitro могут влиять на биодоступность и эффективность лекарств ^9,10. Методы проверки растворения китайской медицины включают метод вращающейся корзины, метод лопасти и метод маленькой чашки. Недостатком метода вращающейся корзины является то, что только внешняя часть вращающейся корзины вступает в контакт со средой растворения во время вращения, что не отражает реального поведения растворения. Метод весла может преодолеть вышеуказанный недостаток, что делает его более подходящим, чем метод корзины, для некоторых твердых препаратов китайской медицины¹¹. В настоящее время нет данных об анализе растворения RG in vitro. С целью более полного контроля качества РГ исследовали растворение трех индексных компонентов (галловой кислоты, салидрозида и этилгаллата) в РГ. В данном исследовании представлены данные для контроля качества РГ и методический справочник по оценке качества других препаратов этнических соединений.

протокол

1. Приготовление раствора

1. Приготовьте исходный раствор эталонного вещества: взвесьте 10,6 мг салидрозида, 5,24 мг галловой кислоты и 5,21 мг этилгалловой кислоты отдельно на электронных аналитических весах и добавьте их по отдельности в мерную колбу объемом 5 мл. Затем добавьте метанол класса ВЭЖХ для растворения и разбавления до 5 мл. Наконец, хорошо встряхните, чтобы получить исходный раствор эталонного вещества с массовой концентрацией 2,120 мг/мл, 1,048 мг/мл и 1,042 мг/мл соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Исходный раствор эталонного вещества содержит 2,120 мг/мл салидрозида, 1,048 мг/мл галловой кислоты и 1,042 мг/мл этилгаллата в качестве исходного раствора каждого раствора на последующей стандартной кривой.
2. Приготовьте раствор испытуемого образца. Извлеките 2,8 г RG (Таблица материалов) с 10 мл метанола класса ВЭЖХ с помощью ультразвуковой очистительной машины (мощность: 200 Вт, частота: 40 кГц) в течение 30 минут, а затем отфильтруйте его с помощью фильтра 0,22 мкм для проверки адаптивности системы.
3. Приготовьте смешанный эталонный раствор, содержащий 0,590 мг/мл салидрозида, 2,030 мг/мл галловой кислоты и 1,930 мг/мл этилгаллата.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый стандарт (2,950 мг салидрозида, 10,150 мг галловой кислоты и 9,650 мг этилгалловой кислоты) растворяют в мерной колбе объемом 5 мл в метаноле класса ВЭЖХ в качестве среды для растворения.
4. Получено теоретическое содержание каждого характеристического компонента РГ для экстракции сверхчистой воды.
   1. Поместите 2,8 г RG в коническую колбу объемом 500 мл, добавьте 200 мл сверхчистой воды и ультразвуковое извлечение (мощность: 200 Вт, частота: 40 кГц) в течение 60 мин. Затем отфильтруйте его с помощью фильтра 0,22 мкм.
   2. Определите содержание испытуемого раствора в соответствии с линейным уравнением, полученным в следующем эксперименте.

2. Хроматографическое состояние

1. Установите хроматографические условия, как показано в таблице 1 для высокоэффективной жидкостной хроматографии. Для получения подробной информации об используемом инструменте см. Таблицу материалов.

3. Тест на адаптивность системы

1. Исследуйте линейную зависимость.
   1. Разбавьте эталонные исходные растворы галловой кислоты и этилгаллата в 5, 10, 25, 50 и 125 раз, а эталонные исходные растворы салидрозида в 2, 4, 8, 16 и 32 раза, чтобы получить раствор градиентной концентрации для построения стандартной кривой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте коэффициент разбавления стандартной кривой в соответствии с предварительным экспериментом по обработке образца. В предварительном эксперименте исходные растворы трех стандартов сначала разбавляли в 5, 10, 25, 50 и 125 раз, а затем строили первую стандартную кривую. Однако, когда концентрация испытуемого образца была обнаружена, было обнаружено, что концентрации салидрозида не попадали в линейный диапазон этой стандартной кривой и, следовательно, концентрации были скорректированы для включения их в кривую. Таким образом, вышеуказанные предварительные эксперименты были использованы для определения конечных концентраций разбавления трех тестовых образцов для последующих экспериментальных исследований.
2. Прецизионное тестирование: Вводите 10 мкл смешанного эталонного раствора в систему ВЭЖХ шесть раз в день и запускайте образцы в тех же условиях ВЭЖХ, описанных на шаге 2.1. Запишите пиковую область каждого компонента.
3. Эксперименты по проверке стабильности: Введите 10 мкл приготовленного раствора образца и определите пиковые площади ВЭЖХ в соответствии с хроматографическими условиями через 0 ч, 6 ч, 10 ч, 12 ч, 14 ч, 16 ч, 18 ч, 20 ч и 24 ч соответственно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пиковые площади автоматически регистрируются системой ВЭЖХ.
4. Испытание на воспроизводимость: Отбирают шесть образцов одной и той же партии RG для приготовления раствора испытуемого образца в соответствии с методом, описанным на шаге 1.2. Введите 10 мкл каждого образца в систему ВЭЖХ. Запустите примеры, как описано на шаге 2.1, и определите воспроизводимость.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяемость оценивали путем сравнения разницы концентраций между шестью образцами.
5. Восстановительный эксперимент
   1. Приготовьте шесть порций одной и той же партии RG для испытуемого раствора. Затем добавьте около 50% эталонного вещества каждого компонента индекса в испытуемый раствор, чтобы рассчитать степень извлечения. Запустите эти образцы в системе ВЭЖХ с теми же условиями, которые описаны на шаге 2.1.
   2. Рассчитайте скорость восстановления.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость извлечения = (C - A) / B x 100, где A - количество компонента, подлежащего измерению в испытуемом растворе, B - количество добавленного эталонного вещества, а C - измеренное значение раствора, содержащего эталонное вещество и образец RG. Обратитесь к шагу 2.1 для хроматографических условий для выполнения вышеуказанных шагов (т.е. этапы 3.1-3.5).

4. Тест на растворение in vitro

1. Проведите испытание на растворение, используя лопастной метод второго метода общего правила 0931 из Китайской фармакопеи (издание 2020 г.)¹².
   ПРИМЕЧАНИЕ: Техника и оборудование для отбора проб: Аппарат для растворения лекарственного средства (таблица материалов) имеет чашку для растворения, лопасть, систему контроля температуры и систему регулировки скорости. Перед началом эксперимента по растворению воду предварительно нагревают до заданной температуры, а затем устанавливают соответствующую скорость. Начните запись времени сразу после добавления RG.
2. Добавьте 100 мл сверхчистой воды в чашку для растворения аппарата для растворения препарата и поддерживайте температуру на уровне 37 °C ± 0,5 °C. Установите скорость вращения на 100 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Аппарат растворения имеет нагревательное устройство, которое позволяет устанавливать температуру в системе. Не было существенной разницы в скорости растворения салидрозида в воде, искусственном желудочном соке (16,4 мл разбавленной соляной кислоты [234 мл концентрированной соляной кислоты, разбавленной до 1000 мл водой] примерно 800 мл воды и 10 г пепсина, хорошо встряхнутых и разбавленных водой до 1000 мл) и искусственном кишечном соке (фосфатный буфер [рН 6,8], содержащий трипсин)¹³. В качестве среды растворения была выбрана наиболее легкодоступная вода (сверхчистая).
3. Добавьте 2,8 г RG в чашку для растворения и немедленно начните регистрировать продолжительность растворения. Соберите в общей сложности 1 мл образца с помощью инжектора (см. Таблицу материалов) через 1 мин, 5 мин, 10 мин, 20 мин, 30 мин и 60 мин и немедленно составьте объем в чашке для растворения с растворяющей средой при той же температуре.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Пробоотборная трубка в чашке для растворения не может собирать небольшие объемы пробы, поэтому для сбора образца используется инжектор. Образцы должны быть собраны быстро, чтобы не пропустить указанные моменты времени сбора.
4. Немедленно отфильтруйте собранные образцы через микропористую мембрану 0,22 мкм и возьмите последующий фильтрат. Определите содержание каждого компонента в каждый момент времени с помощью ВЭЖХ (как показано на шаге 2.1) и рассчитайте кумулятивное растворение.
   1. Чтобы рассчитать кумулятивное растворение, вычислите растворение каждого момента времени (X_n):
      X_n = A / B x 100, где A - количество компонентов, измеренных в каждый момент времени, а B - теоретическое содержание каждого компонента.
   2. Затем рассчитайте кумулятивное растворение (Y):
      Y = X n + (X 1 + ... + X_n-1) x V 2 / V 1, где V ₁ - общий объем растворяющей среды, а V_{2 -} объем растворенного вещества, добавляемого после каждого отбора проб.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за низких значений отклика салидрозида и галловой кислоты на хроматограмме кумулятивное растворение салидрозида и этилгаллата в момент времени 1 мин не было нанесено на кривую растворения.

5. Подгонка модели роспуска

1. Импортируйте кумулятивные данные о растворении в каждый момент времени в программное обеспечение для анализа данных.
2. Используйте подключаемый модуль анализа растворения лекарственного средства в программном обеспечении для анализа данных, чтобы соответствовать уравнению GompertzMod, уравнению Гомперца, логистическому уравнению и уравнению Вейбулла¹⁴. Чем больше значение R², тем лучше эффект подгонки кривой.
   1. Запустите программное обеспечение, выберите окно Book1 , чтобы войти в окно редактирования исходных данных .
   2. В первом столбце A(X)-Long Name введите Time, определите Time как время и введите время определения каждого растворения. Введите данные во второй столбец B(Y)-длинное имя, определите данные как кумулятивное растворение, введите кумулятивный процент растворения каждого времени определения растворения.
   3. После ввода данных выберите столбцы A(X) и B(Y), выберите подключаемый модуль « Анализ растворения лекарственного средства » в строке меню программного обеспечения и нажмите « Подобрать данные о растворении» > «Конкатенировать соответствие» > «ОК». Программное обеспечение генерирует результаты подгонки каждой модели.

Результаты

В этом исследовании точность, стабильность, повторяемость и извлечение образцов RG находились в пределах методологического диапазона, указанного в Китайской фармакопее (том 4, 2020)¹², что указывает на то, что метод осуществим. После повторной отладки было определено, что гради...

Обсуждение

Тест на растворение является идеальным методом in vitro для имитации распада и растворения твердых пероральных препаратов в желудочно-кишечном тракте¹⁵. Это важный показатель для оценки и контроля качества твердых пероральных препаратов. Таким образом, тест на растворен...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Chromatographic column	ZORBAX Eclipse	XDB-C18	4.6 mm x 250 mm, 5 µm
Drug dissolution tester	Shanghai Huanghai Pharmaceutical Inspection Instrument Co., Ltd.	RCZ-6B3
Electronic analytical balance	Shanghai Liangping Instruments Co., Ltd.	FA1004
Ethyl gallate (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM006301
Function drawing software	OriginLab Corporation, Northampton, MA, USA	2022
Gallic acid (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DSTDM000802
High performance liquid chromatography	Agilent Technologies Singapore (International) Pte. Ltd.	Agilent 1260 Infinity
HPLC grade methanol	Thermo Fisher Scientific (China) Co., Ltd.	216565
Injector	Chengdu Xinjin Shifeng Medical Apparatus & Instrument Co., Ltd.	0.7 (22 G)
Millipore filter	Tianjin Jinteng Experimental Equipment Co., Ltd	φ13 0.22 Nylon66
Rhodiola granules	Tibet Nodikang Pharmaceutical Co., Ltd.	210501
Salidroside (HPLC, ≥98%)	Chengdu Desite Biotechnology Co., Ltd.	DST200425-037
Ultra pure water systemic	Merck Millipore Ltd.	Milli-Q
Ultrasonic cleansing machine	Ningbo Xinyi Ultrasonic Equipment Co., Ltd	SB-8200 DTS