Синтез гидрогелей внеклеточного матрикса децеллюляризованного хряща

Резюме

В данной работе представлен новый метод синтеза гидрогелей децеллюляризованного хрящевого внеклеточного матрикса (DC-ECM). Гидрогели DC-ECM обладают отличной биосовместимостью и обеспечивают превосходное микроокружение для роста клеток. Поэтому они могут быть идеальными клеточными каркасами и системами биологической доставки.

Аннотация

Гидрогели децеллюляризованного хрящевого внеклеточного матрикса (DC-ECM) являются перспективными биоматериалами для тканевой инженерии и регенеративной медицины благодаря своей биосовместимости и способности имитировать естественные свойства тканей. Этот протокол направлен на получение гидрогелей DC-ECM, которые точно имитируют нативную ECM хрящевой ткани. Протокол включает в себя комбинацию физического и химического разрушения и ферментативного расщепления для удаления клеточного материала с сохранением структуры и состава ECM. DC-ECM сшивается с помощью химического агента с образованием стабильного и биологически активного гидрогеля. Гидрогель DC-ECM обладает отличной биологической активностью, пространственной структурой и функцией биологической индукции, а также низкой иммуногенностью. Эти характеристики полезны для стимулирования клеточной адгезии, пролиферации, дифференцировки и миграции, а также для создания превосходной микросреды для роста клеток. Этот протокол является ценным ресурсом для исследователей и клиницистов в области тканевой инженерии. Биомиметические гидрогели потенциально могут способствовать разработке эффективных стратегий тканевой инженерии для восстановления и регенерации хряща.

Введение

Инженерия хрящевой ткани является быстро развивающейся областью, направленной на регенерацию поврежденной или больной хрящевой ткани¹. Одной из ключевых задач в этой области является разработка биомиметических каркасов, которые могут поддерживать рост и дифференцировку хондроцитов, клеток, ответственных за производство хряща^. ВКМ хрящевой ткани играет важнейшую роль в регуляции поведения хондроцитов. DC-ECM является эффективным каркасом для применения в тканевой инженерии³.

Для получения DC-ECM из хрящевой ткани был разработан ряд методов, включая химический, ферментативный и физический методы. Однако эти методы часто приводят к получению гидрогелей ECM, которые недостаточно биомиметичны, что ограничивает их потенциал для использования в тканевой инженерии ^4,5. Таким образом, возникает необходимость в более эффективном способе получения гидрогелей DC-ECM.

Разработка этого метода важна, потому что он может продвинуть вперед область тканевой инженерии, обеспечивая новый подход к созданию биомиметических каркасов, которые могут поддерживать регенерацию и восстановление тканей. Кроме того, эта технология может быть легко адаптирована для производства гидрогелей ECM из других тканей, тем самым расширяя возможности ее применения.

В более широкой литературе наблюдается растущий интерес к использованию DC-ECM в качестве каркаса для приложений тканевой^{инженерии 6}. Многочисленные исследования продемонстрировали эффективность гидрогелей DC-ECM в стимулировании роста и дифференцировки клеток в различных тканях, включая хрящ ^7,8. Поэтому разработка протокола получения гидрогелей DC-ECM, которые точно имитируют естественную ECM хрящевой ткани, является значительным вкладом в эту область.

Протокол, представленный в этой статье, удовлетворяет эту потребность, предоставляя новый метод получения гидрогелей DC-ECM, которые точно имитируют естественную ECM хрящевой ткани. Протокол включает в себя децеллюляризацию хрящевой ткани, выделение полученной ВКМ и создание гидрогеля путем сшивания ВКМ биосовместимым полимером. Полученный гидрогель показал многообещающие результаты в поддержке роста и дифференцировки хондроцитов.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Это исследование было одобрено Комитетом по этике больницы Тундэ провинции Чжэцзян.

1. Приготовление гидрогеля DC-ECM

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании хрящ был получен из коленных суставов 12-месячных миниатюрных свиней породы Бама, избегая скопления костной ткани.

1. Возьмите собранный хрящ, заблокируйте и разрежьте скальпелем на³ части размером 1-2 мм.
2. Поместите 20 г измельченного хряща в центрифужную пробирку объемом 50 мл и добавьте 20 мл гипотонического буфера Tris-HCl (10 мМ Tris-HCl, pH 8,0), чтобы полностью погрузить ткань. Поместите центрифужную пробирку в морозильную камеру с температурой −80 °C на 3 часа, а затем в духовку с температурой 37 °C на 3 часа. Повторите этап замораживания и нагрева шесть раз. На этом этапе гипотонический буфер Tris-HCl не нуждается в замене.
3. Встряхните центрифужную пробирку в течение 30 секунд с помощью вихревого смесителя со скоростью 1 000 об/мин. Поместите сито из нержавеющей стали (размер пор: ~250 мкм) на новую центрифужную пробирку объемом 50 мл.
4. Медленно сцедите децеллюляризованный хрящ в сито из нержавеющей стали, трижды промойте ткань стерильным PBS и соберите хрящ.
5. Добавьте 10 мл раствора трипсина (0,25% трипсина в PBS) и поместите пробирку в шейкер при температуре 37 °C на 24 часа. В течение этого периода заменяйте трипсин каждые 4 ч. Отфильтруйте суспензию с помощью сита из нержавеющей стали и сохраните ткань. Трипсин можно обрабатывать в течение ночи во время одного из процессов пищеварения, и это не повлияет на окончательное пищеварение.
6. Трипсинизированную ткань промывают гипертоническим буфером (1,5 М NaCl, 50 мМ Tris-HCl, рН 7,6).
7. Добавьте 10 мл раствора нуклеазы (50 ед/мл дезоксирибонуклеазы и 1 ед/мл рибонуклеазы в 10 мМ Tris-HCl, рН 7,5) и поместите пробирку в шейкер при температуре 37 °C на 4 ч.
8. Удалить раствор нуклеазы, трижды промыть хрящ стерильным ПБС и добавить гипотонический раствор Tris-HCl. Поместите центрифужную пробирку на шейкер и промывайте в течение 20 ч при комнатной температуре (RT).
9. Гипотонический раствор Tris-HCl удалить, трижды промыть хрящ стерильным PBS и добавить 1% раствор Triton X-100, чтобы погрузить ткань на 24 ч.
10. Удалите раствор Triton X-100 и тщательно промойте децеллюляризованный хрящ дистиллированной водой в течение 3 дней, меняя дистиллированную воду каждые 12 ч.
11. Замочите хрящ в растворе надуксусной кислоты (0,1% ПАА в 4% этаноле) на 4 ч. Удалите раствор надуксусной кислоты и трижды промойте хрящ стерильной дистиллированной водой.
12. Поместите сито из нержавеющей стали (размер пор: ~250 мкм) на центрифужную пробирку объемом 50 мл. Медленно сцедите децеллюляризованный хрящ в сито из нержавеющей стали и соберите хрящ. Проверьте степень децеллюляризации и удержания матрикса хряща, оценив содержание ДНК, коллагена и гликозаминогликанов (ГАГ).
13. Поместите децеллюляризованный хрящ в чашу для измельчения, добавьте жидкий азот и измельчите децеллюляризованный хрящ до образования порошка. Возьмите 2 г децеллюляризованного хрящевого порошка, добавьте 80 мл 0,5 М уксусной кислоты и 20 мг пепсина и переваривайте в течение 24 ч. Центрифуга при 400 х г в течение 10 мин; выбросьте осадок и соберите раствор надосадочной жидкости (раствор DC-ECM).
14. Декантировать 1 мл раствора DC-ECM на лунку в 6-луночные планшеты. Поместите 6-луночные планшеты в лиофилизатор. Заморозьте решение DC-ECM. Как только температура в сублимационной сушилке упадет до −40 °C, включите вакуумный насос и поддерживайте степень вакуума на уровне 10 Па в течение 22 часов.
15. Выньте лиофилизированный раствор DC-ECM, поместите его в центрифужные пробирки и храните при температуре −20 °C. Минимальный срок хранения сублимированного раствора DC-ECM превышает полгода.
16. Добавьте 1 мл стерильной дистиллированной воды, чтобы растворить 20 мг лиофилизированного раствора DC-ECM в центрифужной пробирке. Встряхивайте в течение 1 мин с помощью вихревого миксера со скоростью 1 000 об/мин при RT. Добавьте 1 мг витамина B2 (0,1% по массе) в раствор DC-ECM, инкубируйте при 37 °C в течение 60 мин и облучайте ультрафиолетовым светом (370 нм, 3,5 мВт/^см2) в течение 3 мин с образованием гидрогеля (гидрогель DC-ECM).

2. Обнаружение децеллюляризованного хряща

1. Определение содержания ДНК децеллюляризованного хряща
   ПРИМЕЧАНИЕ: Извлеките ДНК с помощью набора крови и тканей DNEasy.
   1. Сначала возьмите 20 мг хряща DC-ECM в центрифужной пробирке. Добавьте 180 мкл буферного GTL и 20 мкл протеиназы K путем вихревых колебаний и инкубируйте хрящ при 56 °C в течение 4 ч до полного растворения.
   2. Встряхивайте центрифужную пробирку в течение 15 с с помощью вихревой мешалки со скоростью 1 000 об/мин при RT. Затем добавьте 200 мкл буфера GL и безводного этанола и тщательно перемешайте вихревой вибрацией. Центрифугируют образцы в течение 1 мин со скоростью 6 000 x g при 4 °C.
   3. Добавьте 500 мкл буфера GW1 в адсорбционную колонну и центрифугируйте образцы в течение 1 мин со скоростью 12 000 x g при 4 °C. Добавьте 500 мкл буфера GW2 в адсорбционную колонку и центрифугируйте при 20 000 x g при 4 °C в течение 1 минуты. Наконец, добавьте 50 мкл стерилизованной воды в адсорбционную колонку и центрифугируйте в течение 1 мин со скоростью 6 000 x g при 4 °C для сбора раствора ДНК. Определите содержание ДНК с помощью спектрофотометра.
2. Определение содержания коллагена в децеллюляризованном хряще
   1. Чтобы определить содержание коллагена в децеллюляризованном хряще, используйте гидроксипролин в качестве аминокислотного маркера коллагена. Подкислить 5 мг децеллюляризованного хряща 5 мл 6 М соляной кислоты при 100 °С в течение 20 мин, а затем нейтрализовать 5 мл 6 М раствора гидроксида натрия.
   2. Рассчитайте содержание гидроксипролина, измерив абсорбцию образца при длине волны 570 нм с помощью спектрофотометра. Получить концентрационно-абсорбционную линейную регрессию с использованием стандартного образца гидроксипролина.
3. Определение содержания ГАГ в децеллюляризованном хряще
   ПРИМЕЧАНИЕ: Содержание ГАГ в хряще DC-ECM определяли с помощью тканевого колориметрического набора для количественного детектирования ГАГ. Все перечисленные ниже реагенты имеются в наборе.
   1. Возьмите 200 мг хрящевого порошка DC-ECM и добавьте 500 мкл реагента А путем вихревых колебаний. Инкубируют образец при 4 °C в течение 16 ч, а затем центрифугируют при 14 000 x g в течение 10 мин.
   2. Возьмите 50 мл раствора пробы и добавьте 50 мкл раствора с высоким содержанием соли (реагент В) и 50 мкл раствора кислоты (реагент С) путем вихревых колебаний. Инкубируют образец в течение 10 мин.
   3. Добавьте 750 мкл раствора красителя (реагент D) путем вихревых колебаний и инкубируйте образец в течение 30 мин в темных условиях. Центрифугу образца при 14 000 x g в течение 10 мин, а затем выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Добавьте 1 мкл чистящего раствора (реагент Е) и хорошо перемешайте. Центрифугируют образец при 14 000 x g в течение 10 мин и выбрасывают надосадочную жидкость.
   5. Добавьте к образцу 1 мкл раствора диссоциации (реагент F) и хорошо перемешайте. Инкубируйте образец в течение 30 мин в темных условиях. Наконец, определите содержание ГАГ с помощью спектрофотометра на длине волны 600 нм.
4. Анализ децеллюляризованного хряща с помощью сканирующего электронного микроскопа (СЭМ) и просвечивающего электронного микроскопа (ПЭМ)
   1. Сравните децеллюляризованный хрящ и нормальную хрящевую ткань. Образец помещают в 2,5%-ный раствор глутарового альдегида, инкубируют при 4 °C в течение ночи, а затем трижды промывают PBS.
   2. Закрепляют пробу в 1% OsO4 в течение 1 ч, а затем трижды промывают PBS.
   3. Обезвоживают образец путем последовательного погружения в 50%, 70%, 90% и 100% этанол, а также 100% ацетон в течение 15 мин каждый. Образец помещают в смешанный раствор гексаметилдиссилазана и этанола (1:1) на 15 мин с последующим погружением в чистый гексаметилдисилазан на 15 мин.
   4. Поместите образец в сушилку HCP-2, а затем высушите с помощью жидкого азота. Затем полностью высохший образец покрыть тонким слоем золото-палладия с помощью напыления и получить изображение с помощью SEM. Нанесение покрытия методом напыления проводилось при мощности 120 Вт в течение 5 мин. Эксперимент проводился при следующих условиях: рабочее напряжение 15 кВ, степень вакуума ниже 5 х 10⁻⁵ Па.
   5. Для анализа ПЭМ помещают образец в смесь безводного ацетона и смолы (1:1) в течение 1 ч, а затем в смесь безводного ацетона и смолы (1:3) в течение 3 ч. Затем поместите образец в смолу на ночь.
      1. Поместите образец во вложенные капсулы со средним наполнением и нагревайте при 70 °C в течение 9 ч.
      2. После встраивания разрежьте образец на тонкие ломтики толщиной 70 нм с помощью ультратонкого микротома и поместите на медную сетку.
      3. Налейте пипетку 20 мкл раствора для окрашивания уранилацетата на медную сетку и окрашивайте в течение 15 мин при RT. Удалите раствор для окрашивания, осторожно дважды промыв сетку дистиллированной водой.
      4. Затем нанесите 20 мкл раствора для окрашивания цитрата свинца на медную сетку и окрашивайте в течение 15 минут при RT. Промойте сетку три раза дистиллированной водой.
      5. Поместите медную сетку на чистую чашку Петри, выстланную фильтровальной бумагой. После высыхания на воздухе сфотографируйте срезы с помощью ПЭМ. Зонд прикладывался с нисходящей силой 500 нН, сканировался с частотой 1 Гц и имел константу упругости (k-значение) 40 ^Нм-1. Радиус наконечника зонда был измерен равным 8 нм.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Чтобы получить более совершенный гидрогель хряща DC-ECM, мы изучили и проанализировали предыдущую литературу и сравнили различные протоколы децеллюляризации с точки зрения коэффициента децеллюляризации, иммуногенности и механической функциональности⁹.

На э...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Данный протокол обеспечивает системный подход к получению децеллюляризованных хрящевых внеклеточных матриксных гидрогелей, которые точно имитируют нативную ВКМ хрящевой ткани. Протокол включает в себя комбинацию физических, химических и ферментативных нарушений для удаления клето...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 M Tris-HCl, pH7.6	Beyotime	ST776-100 mL
1 M Tris-HCl, pH8.0	Beyotime	ST780-500 mL
-80 °C Freezer	Eppendorf	F440340034
Deoxyribonuclease	Aladdin	D128600-80KU
DNEasy Blood &Tissue Kit	Qiagen	No. 69506
GAG colorimetric quantitative detection kit	Shanghai Haling	HL19236.2
HCP-2 dryer	Hitachi	N/A
Nanodrop8000	Thermo Fisher	N/A	Spectrophotometer
PBS (10x)	Gibco	70011044
Ribonuclease	Aladdin	R341325-100 mg
Sigma500	ZIESS	N/A	Scanning electron microscope
Spectra S	Thermo Fisher	N/A	Transmission electron microscope
Stainless steel sieve	SHXB-Z-1	Shanghai Xinbu
Triton X-100	Beyotime	P0096-500 mL
Trypsin	Gibco	15050065
Ultraviolet lamp	Omnicure 2000	N/A
Vitamin B2	Gibco	R4500-5G
Vortex mixer	Shanghai Qiasen	78HW-1