JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мы представляем метод культивирования и редактирования генов первичных В-клеток макак-резусов с использованием CRISPR/Cas9 и рекомбинантного аденоассоциированного вируса серотипа 6 для изучения терапии В-клетками.

Аннотация

В-клетки и их потомство являются источниками высокоэкспрессируемых антител. Их высокая способность экспрессировать белок вместе с их изобилием, легким доступом через периферическую кровь и способностью к простым приемным переносам сделали их привлекательной мишенью для подходов к редактированию генов для экспрессии рекомбинантных антител или других терапевтических белков. Редактирование генов первичных В-клеток мыши и человека является эффективным, и мышиные модели для исследований in vivo показали многообещающие результаты, но осуществимость и масштабируемость для более крупных моделей животных до сих пор не были продемонстрированы. Поэтому мы разработали протокол редактирования первичных В-клеток макак-резусов in vitro , чтобы сделать возможными такие исследования. Мы сообщаем об условиях культивирования in vitro и редактирования генов первичных В-клеток макак-резуса из мононуклеарных клеток периферической крови или спленоцитов с использованием CRISPR/Cas9. Для достижения адресной интеграции больших (<4,5 кб) кассет был включен быстрый и эффективный протокол для подготовки рекомбинантного аденоассоциированного вируса серотипа 6 в качестве гомологически направленного шаблона репарации с использованием самоподавляющего аденовирусного вектора-помощника с поддержкой тетрациклина. Эти протоколы позволяют изучать перспективную терапию В-клетками у макак-резусов.

Введение

В-клетки являются основой гуморального иммунитета. При активации родственным антигеном и вторичными сигналами наивные В-клетки дают начало В-клеткам зародышевого центра, В-клеткам памяти и плазматическим клеткам1. Последний является источником секретируемых антител, которые опосредуют защитные функции большинства доступных в настоящее время вакцин2. Плазматические клетки были описаны как фабрики антител, поскольку они выделяют огромное количество антител в сыворотку - около 2 нг / день / клетка3, что составляет 7-16 г / л сыворотки, что делает антитела одним из трех наиболее распространенных белков в сыворотке4. В-клетки в изобилии содержатся в крови и, таким образом, могут быть легко получены и введены обратно в человека.

Эти черты сделали В-клетки мишенью клеточной терапии для редактирования генов рецептора В-клеток (BCR) и экспрессии широко нейтрализующих антител (bNAbs) к вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ)5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15 и другим белкам 16, 17,18,19,20,21. Такие подходы показали потенциал в многочисленных исследованиях на мышах in vivo 7,8,10,11,16,22. Тем не менее, для клинического перевода 9,15,23 все еще необходимо преодолеть несколько препятствий, среди которых безопасность, продолжительность и величина терапевтической эффективности, а также масштабирование на более крупных животных, таких как нечеловекообразные приматы (NHP). Действительно, NHP и, в частности, макаки-резусы, которые имеют долгую историю исследований антител и ВИЧ24,25, являются наиболее подходящей моделью для проверки этих параметров.

Здесь мы разработали протоколы, которые позволяют решать эти проблемы. На сегодняшний день в нескольких исследованиях предпринимались попытки культивировать В-клетки макак-резуса ex vivo, и сообщалось только о положительном отборе с использованием CD20 для очистки В-клеток макак-резусов26,27,28. Мы разработали протокол выделения нетронутых В-клеток макак-резусов путем отрицательного истощения других типов клеток. Кроме того, определены условия культивирования для целенаправленного редактирования генов В-клеток макак-резусов. В этом протоколе описывается использование рибонуклеопротеинов (РНП) CRISPR/Cas9 и рекомбинантного аденоассоциированного вируса серотипа 6 (rAAV6) в качестве гомологически направленного шаблона репарации (HDRT) для редактирования генов культивируемых В-клеток макаки-резуса. С помощью этого протокола была достигнута эффективность редактирования до 40% при больших (~1,5 кб) вставках. Мы также представляем быстрый и экономичный способ получения rAAV6 с использованием самоподавляющего аденовирусного хелпера29 с поддержкой тетрациклина, чтобы обеспечить быстрое тестирование HDRT в этом формате. В совокупности эти протоколы описывают эффективный рабочий процесс редактирования генов В-клеток макак-резусов (рис. 1), что позволяет оценивать терапию В-клетками в модели NHP.

Для начала экспериментов донорский материал может быть заказан из коммерческих источников или получен с помощью флеботомии или спленэктомии. В этом исследовании флеботомия и забор крови были выполнены, как описано ранее30 , с использованием антикоагулянта ЭДТА. Для получения В-клеток селезенки, первичных макак-резусов, частичная (25-50%) или полная спленэктомия проводилась с использованием методов, о которых сообщалось ранее31. Животные голодали в течение ночи перед операцией. Вкратце, во время операции брюшная полость была обрезана и подготовлена чередующимися скрабами из хлоргексидина и 70% изопропилового спирта три раза. В брюшной полости был сделан разрез (5-10 см) для идентификации и изоляции селезенки. Сосудистую сеть селезенки перевязывали либо швами, либо сосудистыми зажимами. Разрез был закрыт в два слоя полидиоксаноновыми швами 4-0 PDS. Спленэктомия была выполнена один раз для отдельного животного. Одноклеточные суспензии получали из селезенки макак путем мацерации через клеточные ситечки. Мононуклеарные клетки из суспензий клеток крови и селезенки готовили с использованием центрифугирования градиента плотности и хранили в жидком азоте.

протокол

Все процедуры и эксперименты на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, Национальных институтов здравоохранения. Краткое изложение следующих протоколов представлено на рисунке 1. Самцы и самки макак-резусов (Macaca mulatta) индийского генетического происхождения в возрасте от 2 до 8 лет содержались и ухаживали за ними в соответствии с руководящими принципами Комитета по уходу за лабораторными животными и их использованию на объекте 2-го уровня биобезопасности.

ВНИМАНИЕ: Все эксперименты проводились с соблюдением универсальных мер предосторожности в отношении патогенов, передающихся через кровь, с использованием стерильных/асептических методов и надлежащего оборудования уровня биобезопасности 2 в вытяжных шкафах с ламинарным потоком.

1. Производство rAAV6

  1. Подготовьте реагенты для производства rAAV6.
    1. Спроектируйте и клонируйте шаблон репарации, направленный на гомологию, между инвертированными концевыми повторами (ITR) AAV2 в векторе pAAV с использованием стандартных методов. Убедитесь, что плечи гомологии имеют не менее ~ 250.н. с каждой стороны, но может быть достаточно всего 60.н., хотя более длинные плечи гомологии предпочтительнее, если конструкция конструкции позволяет это. Если в HDRT присутствуют целевые последовательности какой-либо из используемых сгРНК, удалите их с помощью тихих мутаций, которые наиболее эффективны в соседнем мотиве протоспейсера или затравочной области целевого сайта.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Синтез генов в сочетании со сборкой Гибсона для эффективного клонирования32 может быть выполнен. Подготовьте Maxiprep правильного клона для трансфекции. Для дизайна sgRNA рекомендуется CHOPCHOP33, а список других инструментов можно найти на https://zlab.bio/guide-design-resources. Максимальная емкость упаковки для AAV, включая РМЭ, составляет ~ 4,7 КБ. AAV6 является наиболее часто используемым серотипом для редактирования гемопоэтических клеток, особенно В-клеток9. Другие серотипы AAV для редактирования генов В-клеток макак-резусов не тестировались, но AAV28 и AAV-DJ10,11 использовались в исследованиях на мышах.
    2. Подготовьте питательную среду 293AAV и продукционную среду в соответствии с таблицей 1 и таблицей 2. Стерильный фильтр через мембранный фильтрующий блок из полиэфирсульфона (PES) 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C.
    3. Приготовьте 1x раствор полиэтиленимина (PEI) (1 мг / мл, 100 мл).
    4. В стеклянном стакане объемом 250 мл нагрейте ~ 70 мл H2O в микроволновой печи в течение ~ 30 с, а затем добавьте 100 мг PEI. Добавьте магнитную мешалку и перемешивайте, пока PEI не растворится.
    5. Отрегулируйте pH до 7 с помощью 1 M HCl, затем долейте до 100 мл H2O, подождите 10 минут, снова проверьте pH и при необходимости отрегулируйте.
    6. Стерильно отфильтруйте раствор PEI через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм, аликвоту и храните при температуре -20 °C. После размораживания раствор можно хранить при температуре 4 °C до 2 месяцев.
    7. Приготовьте 5-кратный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ)/NaCl.
    8. Взвесьте 400 г ПЭГ, 8 000 и 24 г NaCl.
    9. Добавьте магнитную мешалку в стеклянный стакан объемом 2 л, добавьте взвешенный PEG 8,000 и NaCl и промойте ~ 550 мл деионизированной воды.
    10. Перемешайте при нагревании и доведите до кипения или 80-90 °C до полного растворения.
    11. Отрегулируйте pH до ~ 7,4 с помощью 1 М NaOH, затем отрегулируйте объем до 1 л с помощью мерного цилиндра и перелейте его в стеклянную бутылку объемом 2 л с помощью магнитной мешалки.
    12. Автоклавную бутылку, магнитную мешалку и раствор на водяной бане в течение 30 мин при 121 °С.
    13. После автоклавирования охладите раствор в холодном помещении, помешивая, используя магнитную мешалку, чтобы предотвратить разделение на разные фазы. При необходимости аликвотировать и хранить при температуре 4 °C.
    14. Подготовьте буфер для рецептуры.
    15. Смешайте 500 мл DPBS с 50 мкл 10% Pluronic F-68. Стерильный фильтр через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм и хранение при комнатной температуре (RT).
  2. Клеточная культура, трансфекция и трансдукция для производства rAAV6
    1. Размораживают, культивируют и замораживают клетки 293AAV, как описано производителем, используя вышеуказанную питательную среду 293AAV и трипсин-ЭДТА для расщепления. Рекомендуется заморозить некоторые ранние проходы и использовать клетки для производства AAV до того, как они достигнут прохода 40.
    2. Для производства rAAV6 посейте четыре чашки для клеточных культур диаметром 15 см по 5 x 106 клеток по 30 мл каждая. Клетки готовы к трансфекции обычно через 1-2 дня после посева, когда они достигают 80%-90% слияния.
    3. Разморозьте Maxiprep плазмиды pAAV, содержащей HDRT, для упаковки в AAV6. Ресуспендируют 85,6 мкг плазмиды pAAV в 3 мл чистой среды DMEM.
    4. Растворите 342 мкл 1 мг/мл раствора PEI в 3 мл чистой среды DMEM. Инкубируйте оба раствора в течение 10 мин при ЛТ.
    5. Смешайте обе пробирки по 3 мл в одну пробирку с ~ 6,4 мл смеси для трансфекции и инкубируйте в течение 20 мин при ЛТ.
    6. Тем временем разморозьте самомолчающий вспомогательный вектор RepCap6 с поддержкой тетрациклина из морозильной камеры с температурой -80 °C на водяной бане с температурой 37 °C. Чтобы трансдуцировать клетки 293AAV, добавьте вспомогательный вектор при кратности инфекции (MOI) 25, используя среднюю инфекционную дозу культуры тканей (TCID50) и предполагая, что 1,15 x 107 клеток / чашка; обычно используется 2-10 мкл на 15-сантиметровую тарелку. Аккуратно покачайте и взболтайте посуду, чтобы распределить.
    7. После инкубации смеси для трансфекции добавьте по каплям 1,6 мл в каждую из четырех 15-сантиметровых посуд. Инкубировать при 37 °C и 5% CO2 в течение ночи.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы, если интересующие векторы rAAV6 уже доступны, эти векторы могут быть использованы для обеспечения вирусного генома, подлежащего упаковке, что сводит на нет необходимость в каких-либо плазмидах с этой системой и дает сопоставимые титры rAAV6. Для этого подхода клетки 293AAV трансдуцируются совместно с желаемым rAAV6 при MOI 50 (на основе копий генома rAAV6 [GC] / мл) вместе со вспомогательным вектором.
    8. На следующий день тщательно аспирируйте и выбросьте питательную среду и замените 30 мл предварительно подогретой производственной среды. Инкубируйте еще 96 ч до сбора урожая. Для получения максимальной урожайности не рекомендуется дальнейшая смена среды.
  3. Сбор и очистка рекомбинантного AAV6 из среды
    1. Не вытесняя клетки из чашки, соберите всю надосадочную жидкость клеток в фильтрующий блок с мембраной PES размером 0,2 мкм, по крайней мере, на 50% больше, чем объем фильтруемой среды. Затем отфильтруйте надосадочную жидкость.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если желателен более высокий выход rAAV6, клетки могут быть собраны и rAAV извлечен из клеточного гранулирования с использованием коммерческих наборов или установленных протоколов34,35. Поскольку AAV6 в основном секретируется в среду36, использовался только надосадочная жидкость, что сокращало трудозатраты, затраты и время.
    2. Добавьте 5 растворов ПЭГ/NaCl в отфильтрованную надосадочную жидкость на 25% от собранного объема; обычно это 30 мл, если используются четыре 15-сантиметровые чашки по 30 мл.
    3. Хорошо перемешайте, перевернув, а затем инкубируйте в течение ночи при температуре 4 ° C, чтобы вирусные частицы выпали в осадок.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Частицы AAV стабильны до 2 дней в этом растворе.
    4. Предварительно охладите центрифугу с поворотным ведром с 250 мл пробирочных вкладышей до 4 °C. Подготовьте центробежный фильтрующий блок объемом 4 мл с отсечкой 100 кДа и гидрофильный шприцевой фильтр PES 0,22 мкм путем предварительной обработки каждой мембраны 2 мл 10% плюроника F-68 в течение не менее 1 ч при ЛТ.
    5. Переложите смесь AAV-PEG/NaCl в пробирку объемом 250 мл, центрифугу при 2 500 x g в течение 1 ч при 4 °C, а затем осторожно удалите всю надосадочную жидкость путем аспирации.
    6. Ресуспендируйте вирусную гранулу от бежевого до белого путем вихривания в 4 мл 1 M HEPES до полной ресуспендирования. При необходимости дайте ему постоять 5 минут и снова встряхните. Ресуспендируют с помощью серологической пипетки объемом 5 мл и переносят общий объем в пробирку объемом 15 мл.
    7. В вытяжном шкафу добавьте равный объем хлороформа к вирусной суспензии - обычно 4 мл.
    8. Энергично вихревите в течение 2 мин, а затем центрифугу при 1000 x g в течение 5 мин при RT.
    9. Соберите верхний слой (надосадочную жидкость, содержащую AAV) в новую пробирку объемом 50 мл и выбросьте нижний слой (хлороформ).
      ВНИМАНИЕ: Растворы, содержащие хлороформ, являются опасными отходами. Следуйте институциональным рекомендациям по его утилизации.
    10. Поместите надосадочную жидкость, содержащую AAV, под вытяжной шкаф и дайте оставшимся хлороформу испариться в течение 30 минут.
    11. Тем временем промойте предварительно обработанный центробежный фильтрующий блок и шприцевой фильтр.
    12. Добавьте 1,5 мл буфера для рецептуры в предварительно обработанный центробежный фильтрующий блок. Центрифуга при 3 500 x g в течение 10 мин при 15 °C в роторе качающегося ковша. Повторите этот шаг с 4 мл буфера состава, чтобы промыть мембрану.
    13. Дважды промойте фильтр шприца 5 мл буфера для рецептуры с помощью шприца объемом 5 мл.
    14. Загрузите ~ 4 мл надосадочной жидкости, содержащей AAV, полученной при экстракции хлороформа, в шприц объемом 5 мл, прикрепите промытый шприцевой фильтр и отфильтруйте непосредственно в центробежный фильтрующий блок.
    15. Центрифугу при 3,500 x g в течение 25 мин при 15 °C, а затем убедитесь, что раствор AAV в фильтре составляет около 50-100 мкл. Если объем раствора составляет >100 мкл, продолжайте центрифугу.
    16. После удаления фильтрата добавьте 4 мл буфера для рецептуры в чашку центробежного фильтрующего блока и равномерно перемешайте раствор пипеткой. Центрифугу при 3,500 x g в течение 25 мин при 15 °C, а затем убедитесь, что раствор AAV в фильтре составляет 50-100 мкл. Если объем раствора составляет >100 мкл, продолжайте центрифугу. Повторите этот шаг для еще одной стирки.
    17. После окончательного центрифугирования убедитесь, что объем раствора составляет 50-70 мкл; Если нет, продолжайте центрифугу. Переведите препарат в пробирку объемом 1,5 мл. При желании аликвотировать и хранить при температуре −80 °C.
  4. Определение титра рекомбинантного AAV6 методом кПЦР
    ПРИМЕЧАНИЕ: Праймеры для кПЦР отжигаются в области ИТР и, таким образом, должны быть пригодны для всех конструкций, клонированных в pAAV.
    1. Разморозьте аликвоту rAAV6, подлежащего титру, и аликвоту эталонного материала AAV6. Эталонный материал AAV6 должен быть близок к 4 x 1011 ГЦ/мл; В противном случае отрегулируйте разбавление соответствующим образом.
    2. Проведите дижест ДНКазы I, чтобы удалить оставшуюся свободную плазмидную ДНК в препарате rAAV6, объединив 2,0 мкл образца или эталонного материала AAV6 с 15,6 мкл безнуклеазного H 2 O,2,0мкл 10-кратного буфера ДНКазы I и 0,4 мкл ДНКазы I.
    3. Аккуратно перемешайте и выдержите в течение 30 минут при 37 °C, а затем переложите на лед. Это разбавление 1 (см. таблицу 3).
    4. Приготовьте пятикратное серийное разбавление всех образцов и эталонного материала AAV6, как показано в таблице 3 ниже, водой.
    5. Приготовьте мастер-микс для кПЦР SYBR Green. На лунку смешайте 4,7 мкл безнуклеазной воды с 10 мкл основной смеси SYBR Green, 0,15 мкл праймера ITR вперед при 100 мкМ и 0,15 мкл праймера ITR в обратном направлении при 100 мкМ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Каждая проба измеряется в двух экземплярах, с 16 скважинами для эталонного стандарта, 8 скважинами на образец и 2 скважинами для контроля без шаблона. Приготовьте на 10% больше мастер-микса, чтобы учесть ошибку пипетирования.
    6. В оптическую 96-луночную или 384-луночную реакционную пластину загрузите 15 мкл на лунку мастер-смеси SYBR Green qPCR.
    7. Затем загрузите 5 мкл образцов и эталонный материал AAV6 или воду без нуклеазы для контроля без шаблона. Для эталонного стандарта AAV6 разбавление нагрузки 2 до разбавления 9. Для образцов загружают разбавление 5 до разбавления 8. Измеряйте каждое разведение в двух экземплярах. Избегайте пузырьков.
    8. Запечатайте загруженную пластину оптической прозрачной пленкой, центрифугу при 800 x g в течение 1 минуты при RT и загрузите пластину в прибор qPCR с соответствующей установкой на 96 или 384 лунки.
    9. Настройте и запустите прибор qPCR с помощью детектирования SYBR со следующими условиями циклирования: 98 °C в течение 3 мин, затем 40 циклов 98 °C в течение 15 с и 58 °C в течение 30 с, после чего следует кривая плавления.
    10. Проанализируйте данные с помощью программного обеспечения прибора, используя концентрацию эталонного материала AAV6 в копиях генома на миллиметр (ГХ/мл) в качестве стандартной кривой (см. Таблицу 3). Рассчитайте конечную концентрацию образца путем умножения на коэффициент разбавления.
    11. Убедитесь, что стандартная кривая R2 близка к 1,0, эффективность ПЦР составляет 90% -110%, базовый уровень удален, кривая плавления показывает один пик, значения C t изменяются в соответствии с разведениями, а дубликаты находятся в пределах 0,5 Ct; В противном случае исключите выбросы. Ожидаем урожайность, как показано на рисунке 2.

2. Подготовка В-клеточных сред и стимулов

  1. Подготовьте размораживающую среду: смешайте RPMI-1640 с 20% FCS. Стерильный фильтр через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C.
  2. Подготовьте среду для культивирования В-клеток: смешайте реагенты, указанные в таблице 4, а затем проведите стерильную фильтрацию через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C.
  3. Ресуспендировать каждый из стимуляторов В-клеток, указанных в таблице 5 , в исходных концентрациях в среде для культивирования В-клеток, за исключением CpG ODN, который следует ресуспендировать в воде, не содержащей нуклеаз. Хранить при температуре −80 °C.
  4. При отрицательном истощении неВ-клеток (необязательный шаг 4) приготовьте DPBS (без кальция, без магния) с 2% FCS (DPBS 2% FCS). Стерильный фильтр через мембранный фильтрующий блок PES 0,2 мкм. Хранить при температуре 4 °C.

3. Получение и культивирование В-клеток макак-резусов

ПРИМЕЧАНИЕ: Криоконсервированные макак-резусы PBMC или спленоциты используются для создания клеточной культуры30,31.

  1. Предварительно подогрейте размораживающую среду и питательные среды В-клеток на водяной бане с температурой 37 °C. Разморозьте стимуляторы В-клеток из таблицы 5 на льду.
  2. Подготовьте трубку подходящего размера, содержащую предварительно разогретую талую среду. В идеале это должно быть более чем в 10 раз больше объема размороженных клеток.
  3. Разморозьте один-два криовиала PBMC или спленоцитов за раз на водяной бане с температурой 37 ° C и сцедите в подготовленную пробирку с предварительно подогретой средой. Промойте криотрубки, чтобы собрать все клетки.
  4. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 10 мин при RT.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти настройки центрифугирования снижают загрязнение тромбоцитов, сохраняя при этом выход PBMC. Можно использовать более высокие скорости, такие как 350 x g в течение 5 минут.
  5. Ресуспендируйте клетки в 10 мл размораживающей среды для промывки.
  6. Повторите шаги 3.4 и 3.5, в общей сложности три центрифугирования для удаления замораживающей среды. После последнего центрифугирования ресуспендируют клетки в расчетной дозе ~ 5 x 106 клеток/мл в среде для культивирования В-клеток.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В приведенном выше протоколе культивируют целые препараты PBMC или спленоцитов с контаминацией другими клетками. Если требуются более чистые культуры В-клеток, хотя и при значительно сниженном общем выходе В-клеток, переходите к шагу 4. Никаких различий в эффективности редактирования между этими двумя методами не наблюдалось.
  7. При необходимости разбавьте аликвоту 10 мкл клеток питательной средой В-клеток для подсчета. Подсчитывают с помощью гемоцитометра и окрашивают трипановым синим, сочетая равные объемы ресуспендированных клеток и 0,4% раствора трипанового синего.
  8. Отрегулируйте концентрацию клеток до 3 x 106 клеток / мл со средой для культивирования В-клеток в соответствии с количеством клеток. Затем добавьте стимуляторы В-клеток к их конечным концентрациям в соответствии с таблицей 5 и перемешайте.
  9. Перенесите клетки в соответствующую чашку для клеточных культур. В целом, рекомендуется 0,6 х 10 6-0,7 х 106 клеток/см2. Инкубируют клетки при 37 °C с 5%CO2 в течение 48 ч ± 2 ч.

4. Необязательное отрицательное истощение не-В-клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Выход и чистота зависят от процентного содержания В-клеток на входе среди PBMC, который может сильно различаться у отдельных макак-резусов27. Ожидайте чистоту 80%-95%, эффективность 60% и 1 x 10 6-1,5 x 106 ячеек от 1 x 107 PBMC.

  1. После последней промывки (этап 3.6) ресуспендируйте клетки в концентрации 1 x 108 клеток/мл в DPBS 2% FCS и человеческом Fc-блоке, разбавленном в соотношении 1:200. Количество ячеек основано на количестве размороженных ячеек.
  2. Инкубировать в течение 15 мин на льду, чтобы блокировать Fc-рецепторы, а затем добавить биотинилированные антитела, указанные в таблице 6. Инкубировать еще 20 мин на льду.
  3. Долейте в тюбик DPBS 2% FCS и отжимайте при 200 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  4. Ресуспендируют клетки в DPBS 2% FCS на 80% объема из шага 4.1 (т.е. 80 мкл на 1 x 107 клеток).
  5. Добавьте магнитные шарики стрептавидина в суспензию клетки в количестве 20% от объема из шага 4.1 (т.е. 20 мкл шариков на 1 x 107 ячеек).
  6. Инкубируйте клетки в течение 15 минут на льду и периодически перемешивайте.
  7. Между тем, на 1 х 108 ячеек подготовьте магнитный сепаратор с большой магнитной обеднительной колонной и фильтром предварительного разделения. Промойте фильтр и колонку предварительного разделения 2 мл DPBS 2% FCS под действием силы тяжести и откажитесь от проточного потока. Установите пробирку для сбора 15 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Использование других колонн, таких как колонны с положительным отбором или другие системы очистки магнитных шариков, может резко снизить чистоту.
  8. После инкубации дополните клетки до 0,5 мл DPBS 2% FCS, если объем составляет <0,5 мл. Если объем составляет ≥0,5 мл, просто продолжайте.
  9. Загрузите клеточную суспензию в фильтр предварительного разделения на подготовленной колонке и соберите проточный поток в пробирку объемом 15 мл.
  10. Дважды упраздните несвязанные обогащенные В-клетки, добавив 1 мл DPBS 2% FCS в фильтр предварительного разделения. Соберите несвязанные клетки в одну и ту же трубку под действием силы тяжести.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительное элюирование может незначительно увеличить урожайность. Чистота и эффективность могут быть оценены с помощью проточной цитометрии входных клеток, обогащенных клеток и клеток, удерживаемых на колонке. Чтобы получить ячейки, удерживаемые на колонке, снимите колонку с магнита и промойте 3 мл DPBS 2% FCS с помощью прилагаемого поршня. При желании оцените чистоту с помощью проточной цитометрии, как показано на рисунке 3 , используя реагенты в таблице 7.
  11. Центрифугируйте обогащенные В-клетки в дозе 200 x g в течение 10 мин при 4 °C.
  12. Ресуспендируют клетки при расчетной дозе ~ 5 x 106 клеток / мл в среде для культивирования В-клеток и продолжайте на шаге 3.7.

5. Первичное редактирование генов В-клеток макак-резусов

  1. После активации В-клеток макак-резусов в течение 48 ч ± 2 ч готовят реагенты для электропорации и трансдукции.
    1. Предварительно разогрейте ДМСО, безнуклеазный дуплексный буфер, буфер T и буфер E (набор для электропорации 10 мкл) или E2 (набор для электропорации 100 мкл) из набора для электропорации в RT.
    2. Разморозьте rAAV6 HDRT и В-клеточные стимуляторы из таблицы 5 на льду.
  2. Ресуспендировать сгРНК CRISPR-Cas9 при 100 мкМ в дуплексном буфере. Восстановите в течение 10 минут при RT и смешайте вихревом и щелчком. Храните восстановленные сгРНК на льду до использования. Хранить при температуре −80 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: СгРНК CRISPR-Cas9 могут быть разработаны с помощью различных онлайн-инструментов (см. 1.1.1) и могут сильно различаться по эффективности резки. Эмпирическое тестирование эффективности резки рекомендуется проводить с использованием таких анализов, как TIDE37 или ICE38.
  3. На 10 мкл электропорации готовят 550 мкл среды для культивирования В-клеток со всеми стимуляторами из таблицы 5 и добавляют 1% ДМСО. Увеличьте объемы в 10 раз для электропорации 100 мкл. Опционально 10% этой среды может быть приготовлено без антибиотика-антимикотика, что несколько повышает жизнеспособность клеток после трансфекции.
  4. На 10 мкл электропорации готовят лунку из 48-луночной клеточной культуральной пластины с 50 мкл питательной среды В-клеток со стимуляторами и без антибиотика-антимикотика, если он используется. Для электропорации 100 мкл пипеткой 500 мкл вводят в лунки 6-луночной пластины.
  5. Добавьте rAAV6 HDRT в среду в скважинах, до 20% объема в скважине. Стремитесь к MOI в диапазоне от 1 x 10 5-1 x 10 6 в зависимости от количества клеток на трансфекцию (электропорация 10 мкл: 5 x 10 5 клеток; электропорация 100 мкл:5 x 106 клеток) и GC в препарате rAAV6. Высокие концентрации запасов rAAV6 от 5 x 1013 ГХ/мл до 5 x 1014 ГХ/мл рекомендуются для достижения высоких MOI при небольших объемах.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкие MOI могут привести к снижению эффективности редактирования, а MOI 5 x 105 , как правило, близки к максимальной эффективности редактирования, которую мы видели. Влияние различных MOI на жизнеспособность В-клеток не наблюдалось. Рекомендуется включать контрольную группу без rAAV6 HDRT, без трансфекции RNP и без обоих.
  6. Предварительно разогрейте подготовленную посуду и оставшуюся среду, переложив их в инкубатор при 37 °C с 5% CO2.
  7. На 10 мкл электропорации приготовьте 1,15 мкл рибонуклеопротеина (РНП): смешайте 0,4 мкл 61 мкМ Cas9 с 0,75 мкл 100 мкМ сгРНК в дуплексном буфере. Подготовьте дополнительно (рекомендуется на 30% больше для однократной электропорации) из-за ошибки пипетирования и во избежание образования пузырьков при загрузке наконечников для электропорации. Уменьшите масштаб в 10 раз для наконечников объемом 100 мкл.
  8. Инкубируйте RNP в течение не менее 15 минут при RT перед смешиванием с клетками. После инкубации несколько RNP могут быть объединены, если необходимо одновременно нацеливаться на более чем один локус. Никаких существенных различий в эффективности не наблюдалось одновременно с тремя локусами.
  9. Тем временем подготовьте клетки к электропорации. Всегда держите клетки в режиме RT, чтобы избежать температурных скачков. Заготавливают клетки через 48 ч ± 2 ч культуры в соответствующий сосуд. Промойте посуду DPBS, чтобы собрать максимальное количество ячеек.
  10. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 10 мин при RT. Откажитесь от надосадочной жидкости и ресуспендируйте клетки в DPBS при ~ 2 x 106 клеток / мл.
  11. Соедините 10 мкл 0,4% раствора трипанового синего с 10 мкл клеточной суспензии и посчитайте с помощью гемоцитометра.
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе, из-за потери во время сбора урожая и промывки, ожидайте около 60% клеток, которые были помещены в культуру через 48 часов ± 2 часа раньше.
  12. Тем временем центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 10 минут при RT. Выбросьте надосадочную жидкость, убедившись, что все оставшиеся DPBS сведены к минимуму. Ресуспендируют клетки в предварительно нагретом (RT) буфере T при 5,55 x 107 клеток / мл в зависимости от приведенного выше количества клеток.
  13. Настройте систему трансфекции, включив аппарат и установив его на 1,350 В, 15 мс и 1 импульс. Поместите дозаторную станцию внутрь вытяжного шкафа с ламинарным потоком.
  14. Для каждого набора из 10 электропораций готовят трансфекционную трубку с 3 мл буфера E (для трансфекций 10 мкл) или E2 (для трансфекций 100 мкл). Вставьте трубку в дозатор.
  15. На 10 мкл электропорации объедините 1,15 мкл РНП с 9 мкл клеток. Убедитесь, что у вас достаточный объем (+ 30%), чтобы избежать аспирации воздуха в наконечник электропорации. Инкубировать при РТ в течение 1-2 мин перед электропорацией.
  16. Аспирируйте 10 мкл или 100 мкл РНП и клеточной смеси в электропорационный наконечник соответствующего размера на электропорационной пипетке, вставьте загруженную пипетку в дозаторную станцию и начните электропорацию. Убедитесь, что на наконечниках нет пузырьков воздуха, чтобы предотвратить искрение. Следите за электропорацией, чтобы убедиться, что дуга не возникает.
  17. Немедленно выталкивайте электропорированные ячейки в подготовленную, предварительно нагретую, небольшой объем среды с rAAV6 или без него внутри 48-луночной (10 мкл трансфекций) или 6-луночной пластины (100 мкл трансфекций). Повторите шаги 5.15-5.17 с оставшимися образцами. Добавьте контрольные образцы без трансфекции в культуральные лунки.
  18. Инкубируют клетки при 37 ° C с 5% CO 2 в течение 4 ч ±2 ч, а затем добавляют подготовленную, предварительно подогретую среду для культивирования В-клеток, содержащую стимуляторы, ДМСО и антибиотик / антимикотическое средство: 450 мкл для 10 мкл трансфекции или 4,5 мл для 100 мкл трансфекций.
  19. Продолжайте инкубацию при 37 °C с 5% CO2 в течение12-24 часов. Затем измените среду на среду для культивирования В-клеток, содержащую стимуляторы и антибиотик / антимикотик без ДМСО, если требуется расширенное культивирование. Анализ геномной ДНК можно сделать через 24 часа. Цифровая капельная ПЦР с использованием праймера вне плеча гомологии и праймера внутри вкладыша может быть использована для количественной оценки эффективности редактирования39. Выполните ПЦР для амплификации места вставки и секвенирование по Сэнгеру, чтобы проверить правильность редактирования.
  20. Для анализа уровня белка культивируют клетки в течение 40-48 ч после электропорации, чтобы обеспечить изменения экспрессии белка, и проводят анализ с помощью проточной цитометрии с использованием реагентов, указанных в таблице 7.

Результаты

Продуцирование rAAV6 с использованием самоподавляющего аденовирусного хелпера с поддержкой тетрациклина приводило к получению в среднем 4 х 10ГХ /мл среды для культивирования клеток, что в 30-40 раз превосходило производство при использовании стандартной, безхелперной тройной трансфекции (рис. 2).

Необязательная очистка В-клеток макаки-резуса привела к элиминации подавляющего большинства CD3+ Т-клеток и CD14+ и/или CD16+ миелоидных клеток, при этом обычно получают 80-95% CD20+ В-клеток (рис. 3). Основываясь на наших предыдущих разработках в мышиных В-клетках7, мы разработали метод редактирования специфичности В-клеточного рецептора В-клеток макак-резуса при одновременном поддержании аллельного исключения в подавляющем большинстве В-клеток путем удаления легких цепей эндогенных антител путем нарушения их постоянной области. Мы сконструировали HDRT без промотора, который будет вставлен в локус IGH между последним геном IGHJ и энхансером Eμ В-клеток макак-резуса (рис. 4). Эта конструкция использует эндогенный промотор VH естественным образом перестроенным выше по течению области VDJ в зрелых В-клетках и, таким образом, не экспрессируется эписомальными геномами AAV. Кроме того, эта конструкция требует сплайсинга с нисходящими константами тяжелой цепи антитела, которые должны экспрессироваться на поверхности клетки. Таким образом, специфическое связывание антигена на поверхности клетки, показанное проточной цитометрией, указывает на правильную интеграцию целевого локуса и на то, что вставленная последовательность функциональна.

Мы упаковали такую конструкцию, кодирующую антитело Ab1485, полученное из макаки-резуса против ВИЧ bNAb40, в rAAV6 и использовали его для редактирования активированных первичных культур спленоцитов макак-резуса или PBMC, как описано выше (рис. 5A). Протокол поддерживал высокую жизнеспособность клеток (~90%) при одновременном удалении экспрессии легкой цепи в ~80% В-клеток. Большинство В-клеток по-прежнему экспрессировали изотип IgM (рис. 5B). Добавление rAAV6, кодирующего Ab1485 HDRT, привело к редактированию генов и поверхностной экспрессии Ab1485 в 16-21% В-клеток (рис. 5A), хотя и с более низкой интенсивностью флуоресценции цепей антител, чем на неотредактированных В-клетках (рис. 5A справа, рис. 5C). Это может быть результатом эпитопной конкуренции между антигенным пятном и моноклоналами, используемыми для обнаружения поверхностного BCR в проточной цитометрии, а также фактического снижения экспрессии белка из-за полицистронной природы HDRT и менее эффективного сплайсинга. Добавление 1% ДМСО и расширенная концентрированная инкубация с rAAV6 HDRT обычно повышали эффективность редактирования (рис. 6A-C). Используя этот специфический метод, обычно 5-20% и до 40%, эффективность редактирования достигается в зависимости от отдельной макаки резуса (рис. 5А, рис. 6А-Е) и качества партии rAAV6 HDRT (рис. 6Е). В целом, мы представляем протоколы для эффективного производства rAAV6, а также культивирования, очистки и редактирования генов В-клеток макак-резусов.

РеагентовТомЗапасКонечная концентрация
DMEM, высокий уровень глюкозы500 мл1 х~ 88,5%
FCS, с отключением тепла50 мл1 х~ 8.85%
Антибиотик/Антимикотик5 мл100 х1 х
Глутамин5 мл200 мМ2 мМ
Пируват натрия5 мл100 мМ1 мМ

Таблица 1: Среда для культивирования клеток 293AAV.

РеагентовТомЗапасКонечная концентрация
DMEM, высокий уровень глюкозы500 мл1 х~ 95,2%
FCS, с отключением тепла10 мл1 х~ 1,9%
Антибиотик/Антимикотик5 мл100 х1 х
Глутамин5 мл200 мМ2 мМ
Пируват натрия5 мл100 мМ1 мМ

Таблица 2: Среда для производства ячеек 293AAV.

Серия разбавленияОбъем образца (мкл)Разбавитель и объемКоэффициент разбавленияПолное разбавлениеАртикул AAV6
ГХ/мл
Разбавление 1Образец 2 мкл или эталонный стандарт AAV при 4,1 x 1011 ГХ/мл18 мкл ДНКазы буфера и фермента10 х10 х4,1 х 1010
Разбавление 215 мкл Dil.160 мкл H2O5 х50 х8,2 х 109
Разбавление 320 мкл Dil.280 мкл H2O5 х250 х1,6 х 109
Разбавление 420 мкл Dil. 380 мкл H2O5 х1250 х3,3 х 108
Разбавление 520 мкл Dil.480 мкл H2O5 х6250х6,6 х 107
Разбавление 620 мкл Dil. 580 мкл H2O5 х31250 х1,3 х 107
Разбавление 720 мкл Dil. 680 мкл H2O5 х156250 х2,6 х 106
Разбавление 820 мкл Dil. 680 мкл H2O5 х781250 х5,24 х 105
Разбавление 920 мкл Dil. 780 мкл H2O5 х3906250 х1,05 х 105

Таблица 3: таблица разведения кПЦР.

РеагентТомЗапасКонечная концентрация
РПМИ-1640420 мл1 х84%
FCS, с отключением тепла50 мл1 х10%
Антибиотик/Антимикотик5 мл100 х1 х
Глутамин5 мл200 мМ2 мМ
Пируват натрия5 мл100 мМ1 мМ
ХЕПЕС5 мл1 м10 мМ
2-B-меркапто-этанол550 мкл55 мМ55 мкМ
Заменимые аминокислоты5 мл100 х1 х
Инсулин-трансферин-селен5 мл100 х1 х

Таблица 4: Среда для культивирования В-клеток.

РеагентРазбавлениеЗапасКонечная концентрация
MegaCD40L1:1000100 мкг/мл100 нг/мл
CpG ODN1:3001 мг/мл3,33 мкг/мл
Человеческий BAFF1:100040 мкг/мл40 нг/мл
Человеческий Ил-21:100050 мкг/мл50 нг/мл
Человеческий Ил-101:100050 мкг/мл50 нг/мл

Таблица 5: В-клеточные стимуляторы.

АнтителоКлонРазбавлениеЗаключительный конс.
античеловеческий CD3ФН-181:402,5 мкг/мл
античеловеческий CD8aРПА-Т81:2002,5 мкг/мл
античеловеческий CD14М5Е21:2002,5 мкг/мл
античеловеческий CD163Г81:2002,5 мкг/мл
античеловеческий CD33АС104.3Э31:501 тест
античеловеческий CD6410.11:8000,625 мкг/мл
античеловеческий CD66ТЕТ21:111 тест
античеловеческий CD89А591:8000,625 мкг/мл

Таблица 6: Антитела к необязательному истощению не-В-клеток.

РеагентТип/клонРабочее разбавление/концентрация
античеловеческий CD14 AlexaFluor647М5Е21:50
античеловеческий CD16 AlexaFluor7003Г81:50
античеловеческий CD20 PECy72Ч71:50
античеловеческий CD3 PEСП34-21:50
Зомби-НИР-1:500
античеловеческий HLA-DR BV605Л2431:200
античеловеческая легкая цепь Ig лямбда-БТРМХЛ-381:50
античеловеческая легкая цепь Kappa FITCполиклональный1:500
античеловеческий IgM BV421МХМ-881:50
Антиген RC1, случайно биотинилированный-5 мкг/мл
Стрептавидин-ПЭ-1:500

Таблица 7: Проточные цитометрические реагенты для анализа.

figure-results-12268
Рисунок 1: Схематический обзор продукции rAAV6 и редактирования генов первичных В-клеток макак-резусов. Протоколы разделены на продуцирование rAAV6 (этап 1) и редактирование генов В-клеток макак-резуса (этапы 2-5), включая необязательный этап истощения не-В-клеток (этап 4). Шаги в протоколах обозначены красными кружками. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-12967
Рисунок 2: Высокие выходы rAAV6 с использованием самоподавляющего аденовирусного помощника. rAAV6 был получен с использованием методов, описанных здесь (трансфекция pAAV [TF] + самоподавляющий помощник RepCap6, самоподавление аденовирусного помощника) или типичная безхелперная тройная трансфекция pAAV, pHelper и pRepCap6 (pRC6). rAAV6 был очищен только из надосадочной жидкости клетки. Методы, использующие самосайленсирующие аденовирусные вспомогательные векторы, произвели в 30-40 раз больше rAAV, титрованного с помощью кПЦР, как описано выше. Каждая точка представляет собой индивидуальное производство rAAV с использованием различных конструкций pAAV от 2 до 20 независимых экспериментов. Среднее значение ± SEM построено. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-14073
Рисунок 3: Обогащение В-клеток отрицательным истощением не-В-клеток. В-клетки макак-резусов были обогащены из PBMC с использованием описанного протокола и обогащены до чистоты 90%. Показаны входы и выходы предварительного обогащения после обогащения. Закрытый на живых, синглетных PBMC. Представитель пяти независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-14782
Рисунок 4: Стратегия таргетинга, используемая для редактирования специфичности В-клеточного рецептора В-клеток макаки-резуса. rAAV6 был выпущен с изображением HDRT. HDRT состоит из плеча гомологии 266.н. 5', за которым следует 111.н. акцептора сращивания экзона 1 экзона 1 макаки-резуса, затем GSG-линкера с саморасщепляющейся пептидной последовательностью 2A вируса Thosea asigna (T2A ), за которой следует лидерная последовательность и полная легкая цепь антитела к макаке-резусу Ab1485 как макака-резус IGLC1. Затем следует сайт расщепления фурина, линкер GSG и последовательность пептида 2A саморасщепляющегося тешовируса свиньи (Furin-P2A), за которой следует еще одна лидерная последовательность и переменная тяжелой цепи Ab1485, за которой следуют 52.н. последовательности донора сплайсинга макаки-резуса IGHJ4, чтобы обеспечить сплайсинг в нисходящие константные области тяжелой цепи антител и плечо гомологии 514.н. Эта конструкция была нацелена на локус IGH между последним геном IGHJ и энхансером Eμ с использованием целевой последовательности сгРНК GAGATGCCAGAGCAAACCAG. Оба плеча гомологий были спроектированы так, чтобы заканчиваться на месте разреза этой сгРНК, тем самым удаляя целевую последовательность и обеспечивая оптимальную эффективность интеграции. Одновременно, чтобы поддерживать аллельное исключение и экспрессию одного В-клеточного рецептора, мы удаляли эндогенные легкие цепи с использованием sgRNA, нацеленных на IGKC макаки-резуса с целевой последовательностью GGCGGGAAGATGAAGACAGA и IGLC1, IGLC2, IGLC3, IGLC6 и IGLC7S с использованием целевой последовательности CTGATCAGTGACTTCTACCC. HDRT включал молчаливые мутации, предотвращающие расщепление последовательности IGLC1 этой сгРНК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-16883
Рисунок 5: Редактирование генов первичных В-клеток макаки-резуса . (A) Первичные спленоциты (верхняя панель) или PBMC (нижняя панель) от одной и той же макаки резусов культивировали без истощения не-В-клеток и редактировали, как описано выше. Стратегия таргетинга была такой, как показано на рисунке 4. Через два дня после электропорации клетки были собраны и окрашены на поверхность для проточного цитометрического анализа. Левый столбец был закрыт на синглетных ячейках, а другие столбцы затем были закрыты, как указано в верхней строке. Жизнеспособность клеток, чистота В-клеток, эффективность делеции легких цепей и эффективность нокаутирования Ab1485 путем окрашивания специфическим антигеном RC141 указаны в необработанных, трансфицированных RNP или трансфицированных RNP + rAAV6 трансдуцированных образцах (MOI = 5 x 105). Представитель шести независимых экспериментов с клетками разных макак-резусов. (B) экспрессия IgM на культивируемых В-клетках макак-резусов или после редактирования и (C) средняя геометрическая интенсивность флуоресценции (gMFI) IgM на В-клетках, которые не потеряли экспрессию Ig из-за нацеливания на IgLC и IgKC (неотредактированные) или В-клетки, которые связывают ожидаемый антиген (отредактированный). Красная точка указывает на gMFI культивируемых нетрансфицированных контрольных В-клеток. Указывает p < 0,0001 в парном t-критерии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

figure-results-18753
Рисунок 6: Влияние ДМСО, длительной концентрированной инкубации с rAAV6 HDRT, качества партии rAAV и воспроизводимости среди различных донорских NHP на эффективность редактирования генов в первичных В-клетках макак-резусов. (A) Спленоциты культивировали и редактировали, как описано. После электропорации 5 x 10 5 клеток культивировали в среде с 1% ДМСО или без него и инкубировали в 50 мкл среды, содержащей rAAV6 HDRT, при MOI 5 x 10 5 в течение 2 ч или5 ч перед добавлением еще 450 мкл среды. Клетки анализировали через 2 дня после электропорации методом проточной цитометрии, как показано на рисунке 5. Представитель четырех независимых экспериментов. (B) Количественная оценка (A) в четырех независимых экспериментах. Точками обозначены технические реплики с настройками трансфекции 1,350 В, 10-20 мс и продолжительностью 1 импульсной электропорации и концентрациями ДМСО в диапазоне от 0.75% до 1.25%. (C) Среднее изменение эффективности редактирования по сравнению с (B). * p > 0,05 в U-критерии Манна-Уитни. (D) Эффективность редактирования по сравнению с независимыми экспериментами с различными макаками с использованием менее эффективной коммерческой партии rAAV6. (E) Эффективность редактирования с использованием двух разных коммерческих партий rAAV6, в которые одна и та же конструкция была упакована в В-клетки двух разных NHP в одном и том же эксперименте. Точками обозначены технические реплики с настройками трансфекции 1,350 В, 10-20 мс и 1 импульсной электропорацией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Обсуждение

Представленные здесь протоколы обеспечивают быстрый и эффективный метод получения высоких урожаев и титров rAAV6 в виде HDRT и новые методы эффективного редактирования генов первичных В-клеток макак-резуса in vitro.

Производственный протокол rAAV6 сравнительно прост и быстр, что позволяет производить и тестировать множество различных конструкций одновременно без чрезмерных трудозатрат. При желании rAAV6 может быть дополнительно очищен с использованием установленных протоколов, таких как ультрацентрифугирование34 градиента йодиксанола или водное двухфазное разделение35 перед буферным обменом и концентрацией.

Несмотря на то, что это снизило общий выход, мы решили использовать только среду для культивирования клеток с восстановленной сывороткой для очистки rAAV6 вместо очистки от клеточной гранулы, поскольку большая часть rAAV6 высвобождается в среду36, а очистка из клеточной гранулы увеличивает затраты и трудозатраты. Использование самоинактивирующегося аденовирусного хелпера увеличивало урожайность в среднем в 30-40 раз, что позволяло тестировать конструкции, упакованные в AAV6 в одной 15-сантиметровой чашке. Хотя наш метод очистки является базовым, используя этот метод, мы получаем относительно небольшие вариации эффективности редактирования генов или жизнеспособности клеток от партии к партии после трансдукции с использованием различных клеточных линий или других первичных клеток (данные не показаны).

Мы разработали протокол очистки В-клеток макаки-резуса для получения нетронутых первичных В-клеток с использованием отрицательного истощения нежелательных популяций. Хотя это и не является необходимым для редактирования генов этих клеток, оно дает возможность получить относительно чистую популяцию первичных В-клеток макак-резуса для этого или других применений, если другие типы клеток мешают экспериментальным целям. Однако чистота достигается за счет снижения общего выхода В-клеток. Примечательно, что как для обогащенных, так и для необогащенных культур В-клеток доля В-клеток в исходных препаратах PBMC или спленоцитов имеет решающее значение. В частности, для PBMC мы рекомендуем проводить скрининг различных макак у людей с высоким процентом В-клеток в периферической крови, чтобы получить большое количество В-клеток для экспериментов, поскольку это значение может сильно различаться у людей27. PBMC могут быть получены путем регулярного кровотечения или лейкафереза42.

Протокол редактирования генов приводит к эффективному редактированию генов, как правило, от 60% до 80% нокаутов и 5-20% от нокаута В-клеток, хотя мы достигли до 90% нокаута BCR и 40% нокаута BCR В-клеток (рис. 5 и рис. 6).

Основными параметрами эффективного редактирования В-клеток макак-резусов являются эффективность резки сгРНК, параметры электропорации, MOI и качество препарата rAAV6. Эффективность резки сгРНК-кандидатов должна быть определена эмпирически, чтобы обеспечить оптимальное редактирование и дизайн HDRT. Представленные здесь параметры электропорации уравновешивают эффективность с жизнеспособностью для получения максимального общего количества отредактированных В-клеток, а не наибольшего процента отредактированных В-клеток. Если требуется более высокий процент отредактированных ячеек, рекомендуется повышенное напряжение (до 1,750 В) или измененная длина импульса (10-30 мс), хотя может наблюдаться большая гибель клеток. Мы также отметили несколько более высокую эффективность редактирования в В-клетках селезенки по сравнению с В-клетками из PBMC того же человека (рис. 5); Однако основная причина этого в настоящее время неизвестна.

Мы обнаружили, что добавление 1% ДМСО после электропорации значительно увеличило эффективность редактирования генов на ~ 40% в В-клетках макак-резусов, не влияя на жизнеспособность клеток (рис. 6A-C), в соответствии с отчетами в других клетках43. Однако следует избегать расширенного культивирования в 1% ДМСО, который может повлиять на жизнеспособность клеток. При желании ДМСО может быть полностью опущен.

Культивирование клеток в небольшом объеме после электропорации в течение нескольких часов вместе с rAAV6 приводит к более высокой эффективности редактирования, вероятно, из-за лучшей трансдукции HDRT rAAV6 и, таким образом, более высокой внутриклеточной концентрации HDRT в соответствующее время, когда Cas9 активен. Мы обнаружили, что культивирование клеток таким образом в течение 8 часов не влияло на жизнеспособность клеток, но эффективность редактирования не увеличивалась резко после 5 часов (рис. 6). Если требуется только нокаут, а не нокаут, этот шаг можно пропустить.

В заключение мы представляем комплексные протоколы редактирования генов В-клеток макак-резуса in vitro и производства rAAV6 HDRT, необходимого для эффективного нокаутирования желаемых конструкций. Эти протоколы позволяют быстро и экономически эффективно тестировать многие конструкции, упакованные как rAAV6, и позволяют проводить доклинические испытания осуществимости и масштабируемости терапии В-клетками в более релевантной модели приматов.

Раскрытие информации

Конкурирующие интересы не декларируются.

Благодарности

Мы хотели бы поблагодарить Гарри Б. Гристика и Памелу Бьоркман за предоставление антигена RC1, а также все лаборатории Нуссенцвейга и Мартина за критическое обсуждение. Эта работа была поддержана грантом Фонда Билла и Мелинды Гейтс INV-002777 (M.C.N.) и Программой внутренних исследований Национального института аллергии и инфекционных заболеваний Национальных институтов здравоохранения. (Р.Г. и М.А.М.). M.C.N. является следователем HHMI.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL tube sterile, Dnase, Rnase and purogen freeStellar ScientificT17-125or similar
10 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-freeCorning4488or similar
15 cm tissue culture dishFalcon353025or similar
15 mL polypropylene conical tybeFalcon352097or similar
25 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-freeCorning4489or similar
250 mL polypropylene conical tybeCorning430776or similar
293AAV cell lineCell BiolabsAAV-100
2-B-mercapto-ethanol, 55mM (1000x)Gibco21985-023
48-well tissue culture plateCorning3548or similar
5 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-freeCorning4487or similar
5 mL syringes with Luer-Lok TipBD309646or similar
50 mL polypropylene conical tybeFalcon352070or similar
50 mL serological pipette, polystyrene, sterile, nonpyrogenic, DNase-/RNase-free, and Human DNA-freeCorning4490or similar
6-well tissue culture plateFalcon353046or similar
AAV-6 Packaging System (plasmids)Cell BiolabsVPK-406
AAV6 Reference Materials (full capsids)Charles RiverRS-AAV6-FL
Accu-jet S Pipette ControllerBrand26350or similar pipette controller
Antibiotic/Antimycotic 100xGibco15260-062
anti-human CD14 AlexaFluor647Biolegend301812
anti-human CD14 biotinBioLegend301826
anti-human CD16 AlexaFluor700BD Biosciences557920
anti-human CD16 biotinBioLegend302004
anti-human CD20 PECy7Biolegend302312
anti-human CD3 biotinThermo FisherAPS0309
anti-human CD3 PEBD Biosciences552127
anti-human CD33 biotinMiltenyi130-113-347
anti-human CD64 biotinBioLegend305004
anti-human CD66 biotinMiltenyi130-100-143
anti-human CD89 biotinBioLegend354112
anti-human CD8a biotinBioLegend301004
anti-human HLA-DR BV605Biolegend307640
anti-human Ig light chain lambda APCBiolegend316610
anti-human IgM BV421Biolegend314516
anti-Human Kappa Light Chain FITCFisher ScientificA18854
AutoclaveSterisAmsco Lab 250or similar
Cell culture CO2 incubatorFisher Scientific51026331or similar
Centrifugal Filter Unit (Amicon Ultra - 4, 100 kDa)MilliporeUFC810024
Centrifuge 5920 REppendorfEP022628188or any other, coolable swinging bucket centrifuge with inserts for 96-well plates, 15, 50 and 250 mL size tubes
ChloroformFisher ScientificC298SK-4
Cpg ODNInvivogentlrl-2395
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich34869-500ML
DMEM, High GlucoseGibco11965092
DNaseI (RNase-free)New England BiolabsM0303L
DPBS, no calcium, no magnesiumGibco14190144
Electroporation kit (Neon Transfection System 10 µL)Fisher ScientificMPK1096or other sizes or 100 uL transfection kit MPK 10096
Electroporation system (Neon Transfection System)Fisher ScientificMPK5000
FCSHycloneSH30910.03*
Ficoll-PM400 (Ficoll-Paque PLUS)Cytiva17144002or similar
Fume HoodFisher ScientificFH3943810244or similar
Glutamine 200 mMGibco25030-081
Graduated Cylinder 1LCorning3022-1Lor similar
HemocytometerSigma-AldrichZ375357-1EAor similar
HEPES 1MGibco15630-080
HEPES 1MGibco15630-080
Hot Plate Magnetic StirrerFisher ScientificSP88857200or similar
Human BAFFPeprotech 310-13
Human BD Fc BlockBD564220
Human IL-10Peprotech 200-10
Human IL-2Peprotech 200-02
Hydrochloric acidFisher ScientificA144S-500
Hydrophilic Polyethersulfone Syringe Filters, (Supor membrane), Sterile - 0.2 µm, 25 mm Pall4612
Insulin-Transferin-Selenium, 100xGibco41400-045
ITR primer forward: GGAACCCCTAGTGATGGAGTTIntegrated DNA Technologiescustom
ITR primer reverse: CGGCCTCAGTGAGCGAIntegrated DNA Technologiescustom
Laminar flow biosafety cabinetThe Baker CompanySG403Aor similar
Large magnetic depletion (LD) ColumnMiltenyi Biotec130-042-901
Magentic seperator (MidiMACS separator and multistand)Miltenyi Biotec130-090-329
Magnetic stir barFisher Scientific14-512-127or similar
Magnetic streptavidin beads (Streptavidin MicroBeads)Miltenyi Biotec130-048-101
Maxiprep kitMachery-Nagel740414.5or similar
Media Bottles 2L with capCole-ParmerUX-34514-26or similar
MegaCD40LEnzoALX-522-110-C010
MicroAmp Optical 384-well Reaction PlateFisher Scientific4309849
MicroAmp Optical Adhesive FilmFisher Scientific4311971
Microcentrifuge 5424 REppendorf5404000014or any other table top centrifuge for 1.5 mL tubes
Microwave ovenPanasonicNN-SD987SAor similar
Nikon TMS Inverted Phase Contrast MicroscopeNikonTMSor any other Inverted phase-contrast microscope for cell culture
Non-essential amino acids, 100xGibco11140-050
Nuclease-free Duplex bufferIntegrated DNA Technologies11-01-03-01
Nuclease-free WaterQiagen129115
pH meterMettler Toledo30019028or similar
Pipetman Classic Starter Kit, 4 Pipette Kit, P2, P20, P200, P1000 and tipsGilsonF167380or similar set of pipettes and tips
Pluronic F-68 10 %Gibco24040-032
Polyethylene Glycol 8000Fisher ScientificBP233-1
Polyethylenimine, Linear, MW 25000, Transfection Grade (PEI 25KPolysciences23966-100
Precision BalanceMettler ToledoME4001TEor similar
Pre-Separation Filters (30 µm)Miltenyi Biotec130-041-407
Pyrex glass beaker 2 LCole-ParmerUX-34502-13or similar
Pyrex glass beaker 250 mLMillipore SigmaCLS1000250or similar
qPCR InstrumentFisher Scientific4485691or similar
RC1 antigen randomly biotinylatedBjorkman lab, CalTechin house
RPMI-1640Gibco11875-093
S.p. Cas9 NucleaseIntegrated DNA Technologies1081059
Scientific 1203 Water BathVWR24118or any water bath set to  37 °C
Sodium chlorideSigma-AldrichS7653-5KG
Sodium hydroxideSigma-AldrichS8045-500G
Sodium Pyruvate 100 mMGibco11360-070
Sterile Disposable Filter Units with PES MembranesThermo Scientific Nalgene 567-0020 
Streptavidin-PEBD Biosciences554061
SYBR Green Master Mix Fisher ScientificA25742
Tetracycline-enabled, self-silencing adenoviral vector RepCap6 OxgeneTESSA-RepCap6
Trypan Blue Solution, 0.4%Gibco15250061
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol redGibco25300054
Water Purification SystemMillipore SigmaZEQ7000TRor similar
Zombie-NIRBiolegend423106

Ссылки

  1. Victora, G. D., Nussenzweig, M. C. Germinal centers. Annual Review of Immunology. 40, 413-442 (2022).
  2. Plotkin, S. A. Correlates of protection induced by vaccination. Clinical and Vaccine Immunology. 17 (7), 1055-1065 (2010).
  3. Brinkmann, V., Heusser, C. H. T cell-dependent differentiation of human B cells into IgM, IgG, IgA, or IgE plasma cells: High rate of antibody production by IgE plasma cells, but limited clonal expansion of IgE precursors. Cellular Immunology. 152 (2), 323-332 (1993).
  4. Chernecky, C. C., Berger, B. J. . Protein Electrophoresis - Serum., 6th edition. , 917-920 (2013).
  5. Balazs, A. B., et al. Antibody-based protection against HIV infection by vectored immunoprophylaxis. Nature. 481 (7379), 81-84 (2011).
  6. Greiner, V., et al. CRISPR-mediated editing of the B cell receptor in primary human B cells. iScience. 12, 369-378 (2019).
  7. Hartweger, H., et al. HIV-specific humoral immune responses by CRISPR/Cas9-edited B cells. Journal of Experimental Medicine. 216 (6), 1301-1310 (2019).
  8. Huang, D., et al. Vaccine elicitation of HIV broadly neutralizing antibodies from engineered B cells. Nature Communications. 11, 5850 (2020).
  9. Jeske, A. M., Boucher, P., Curiel, D. T., Voss, J. E. Vector strategies to actualize B cell-based gene therapies. Journal of Immunology. 207 (3), 755-764 (2021).
  10. Nahmad, A. D., et al. In vivo engineered B cells secrete high titers of broadly neutralizing anti-HIV antibodies in mice. Nature Biotechnology. 40 (8), 1241-1249 (2022).
  11. Nahmad, A. D., et al. Engineered B cells expressing an anti-HIV antibody enable memory retention, isotype switching and clonal expansion. Nature Communications. 11, 5851 (2020).
  12. Voss, J. E., et al. Reprogramming the antigen specificity of B cells using genome-editing technologies. eLife. 8, 42995 (2019).
  13. Pesch, T., et al. Molecular design, optimization, and genomic integration of chimeric B cell receptors in murine B cells. Frontiers in Immunology. 10, 2630 (2019).
  14. Cheong, T. C., Compagno, M., Chiarle, R. Editing of mouse and human immunoglobulin genes by CRISPR-Cas9 system. Nature Communications. 7, 10934 (2016).
  15. Rogers, G. L., Cannon, P. M. Genome edited B cells: A new frontier in immune cell therapies. Molecular Therapy. 29 (11), 3192-3204 (2021).
  16. Hung, K. L., et al. Engineering protein-secreting plasma cells by homology-directed repair in primary human B cells. Molecular Therapy. 26 (2), 456-467 (2018).
  17. Johnson, M. J., Laoharawee, K., Lahr, W. S., Webber, B. R., Moriarity, B. S. Engineering of primary human B cells with CRISPR/Cas9 targeted nuclease. Scientific Reports. 8, 12144 (2018).
  18. Wu, C. M., et al. Genetic engineering in primary human B cells with CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins. Journal of Immunological Methods. 457, 33-40 (2018).
  19. Luo, B., et al. Engineering of alpha-PD-1 antibody-expressing long-lived plasma cells by CRISPR/Cas9-mediated targeted gene integration. Cell Death and Disease. 11 (11), 973 (2020).
  20. Laoharawee, K., et al. Genome engineering of primary human B cells using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (165), e61855 (2020).
  21. Laoharawee, K., Johnson, M. J., Moriarity, B. S. CRISPR/Cas9-mediated genome engineering of primary human B cells. Methods in Molecular Biology. 2115, 435-444 (2020).
  22. Moffett, H. F., et al. B cells engineered to express pathogen-specific antibodies protect against infection. Science Immunology. 4 (35), (2019).
  23. Hartweger, H., Nussenzweig, M. C. CRISPR comes a-knock-in to reprogram antibodies in vivo. Nature Biotechnology. 40 (8), 1183-1184 (2022).
  24. Nishimura, Y., Martin, M. A. Of mice, macaques, and men: Broadly neutralizing antibody immunotherapy for HIV-1. Cell Host & Microbe. 22 (2), 207-216 (2017).
  25. Shedlock, D. J., Silvestri, G., Weiner, D. B. Monkeying around with HIV vaccines: Using rhesus macaques to define 'gatekeepers' for clinical trials. Nature Reviews Immunology. 9 (10), 717-728 (2009).
  26. Kreuser, S., et al. Efficient methods for generation and expansion of, and gene delivery to rhesus macaque plasma B cells. bioRxiv. , (2021).
  27. Gujer, C., Sundling, C., Seder, R. A., Karlsson Hedestam, G. B., Lore, K. Human and rhesus plasmacytoid dendritic cell and B-cell responses to Toll-like receptor stimulation. Immunology. 134 (3), 257-269 (2011).
  28. Kim, J. S., et al. Cell enrichment-free massive ex-vivo expansion of peripheral CD20(+) B cells via CD40-CD40L signals in non-human primates. Biochemical and Biophysical Research Communications. 473 (1), 92-98 (2016).
  29. Su, W., et al. Self-attenuating adenovirus enables production of recombinant adeno-associated virus for high manufacturing yield without contamination. Nature Communications. 13, 1182 (2022).
  30. Endo, Y., et al. Short- and long-term clinical outcomes in rhesus monkeys inoculated with a highly pathogenic chimeric simian/human immunodeficiency virus. Journal of Virology. 74 (15), 6935-6945 (2000).
  31. Balaphas, A., Buchs, N. C., Meyer, J., Hagen, M. E., Morel, P. Partial splenectomy in the era of minimally invasive surgery: The current laparoscopic and robotic experiences. Surgical Endoscopy. 29 (12), 3618-3627 (2015).
  32. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nature Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  33. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: Expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).
  34. Strobel, B., Miller, F. D., Rist, W., Lamla, T. Comparative analysis of cesium chloride- and iodixanol-based purification of recombinant adeno-associated viral vectors for preclinical applications. Human Gene Therapy Methods. 26 (4), 147-157 (2015).
  35. Guo, P., et al. Rapid and simplified purification of recombinant adeno-associated virus. Journal of Virological Methods. 183 (2), 139-146 (2012).
  36. Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
  37. Brinkman, E. K., Chen, T., Amendola, M., van Steensel, B. Easy quantitative assessment of genome editing by sequence trace decomposition. Nucleic Acids Research. 42 (22), 168 (2014).
  38. Conant, D., et al. Inference of CRISPR edits from Sanger trace data. The CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).
  39. Wilkinson, A. C., et al. Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice. Nature Communications. 12, 686 (2021).
  40. Wang, Z., et al. A broadly neutralizing macaque monoclonal antibody against the HIV-1 V3-Glycan patch. eLife. 9, 61991 (2020).
  41. Escolano, A., et al. Immunization expands B cells specific to HIV-1 V3 glycan in mice and macaques. Nature. 570 (7762), 468-473 (2019).
  42. Pathiraja, V., Matar, A. J., Gusha, A., Huang, C. A., Duran-Struuck, R. Leukapheresis protocol for nonhuman primates weighing less than 10 kg. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 52 (1), 70-77 (2013).
  43. Stratigopoulos, G., De Rosa, M. C., LeDuc, C. A., Leibel, R. L., Doege, C. A. DMSO increases efficiency of genome editing at two non-coding loci. PLoS One. 13 (6), 0198637 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

JoVE192CRISPR Cas9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены