JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В настоящем протоколе описывается способ выделения, расширения и перепрограммирования клеток, полученных из мочи приматов человека и нечеловека, в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК), а также инструкции по поддержанию вновь генерируемых ИПСК без фидера.

Аннотация

Межвидовые подходы к изучению плюрипотентных стволовых клеток приматов и их производных имеют решающее значение для лучшего понимания молекулярных и клеточных механизмов заболевания, развития и эволюции. Чтобы сделать индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) приматов более доступными, в этой статье представлен неинвазивный метод получения ИПСК человека и нечеловека приматов из клеток, полученных из мочи, и их поддержание с использованием метода культивирования без фидера.

Моча может быть взята из нестерильной среды (например, клетки животного) и обработана коктейлем антибиотиков широкого спектра действия во время первичной клеточной культуры для эффективного снижения загрязнения. После размножения клеток, полученных из мочи, ИПСК генерируются модифицированным методом трансдукции коммерчески доступной системы векторного вируса Сендай. Первые колонии ИПСК могут быть видны уже через 5 дней и могут быть собраны не ранее чем через 10 дней. Рутинное пассирование комков с бесферментным диссоциационным буфером поддерживает плюрипотентность сгенерированных ИПСК в течение более чем 50 пассажей.

Введение

Геномные сравнения человека и нечеловекообразных приматов (NHP) имеют решающее значение для понимания нашей эволюционной истории и эволюции специфических для человека черт1. Кроме того, эти сравнения позволяют сделать вывод о функции путем идентификации консервативных последовательностейДНК 2, например, для определения приоритетности вариантов3, связанных с заболеванием. Сравнения молекулярных фенотипов, таких как уровни экспрессии генов, имеют решающее значение для лучшей интерпретации геномных сравнений и обнаружения, например, клеточных фенотипических различий. Кроме того, они, подобно сравнениям на уровне ДНК, обладают потенциалом для вывода о функциональной значимости и, следовательно, для лучшей интерпретации медицинских различий у людей4. Включение всеобъемлющих молекулярно-фенотипических данных в эти сравнительные исследования требует соответствующих биологических ресурсов (т.е. ортологичных клеток разных видов). Однако этические и практические причины затрудняют или делают невозможным доступ к таким сопоставимым клеткам, особенно во время развития. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) позволяют генерировать такие недоступные типы клеток in vitro5,6, доступны экспериментально и используются для сравнения приматов 6,7,8,9,10,11,12,13,14.

Чтобы генерировать ИПСК, необходимо приобрести первичные клетки, подлежащие перепрограммированию. Клетки, выделенные из мочи, имеют то преимущество, что они могут быть отобраны неинвазивным путем у приматов и что они могут быть легко перепрограммированы, вероятно, из-за их молекулярных профилей, подобных стволовым клеткам15. Условия культивирования для поддержания ИПСК приматов так же важны, как и перепрограммирование; Классически культура плюрипотентных стволовых клеток человека требовала неопределенной среды на основе сыворотки и совместной культуры эмбриональных фибробластов мыши - так называемых фидерных клеток, которые обеспечивают необходимые питательные вещества и каркас для эмбриональных стволовых клеток (ЭСК)16. С момента разработки химически определенных и не содержащих питательных культур17,18 в настоящее время существуют различные варианты коммерчески доступных питательных сред и матриц ИПСК. Тем не менее, большинство из этих условий культивирования были оптимизированы для ЭСК и ИПСК человека и, следовательно, могут работать хуже в культуре НПК ИПСК. В этом видеопротоколе мы предоставляем инструкции по созданию и поддержанию ИПСК человека и NHP, полученных из культуры мочевых клеток.

С момента первого сообщения о генерации ИПСК путем принудительной экспрессии определенных факторов в фибробластах в 2006 году этот метод применялся ко многим различным типам клеток различного происхождения 19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31 ,32. Среди них только клетки, полученные из мочи, могут быть получены совершенно неинвазивным способом. Основываясь на ранее описанном протоколе Zhou et al.33, можно выделять и расширять клетки из мочи приматов даже из нестерильных образцов, добавляя антибиотики широкого спектра действия15. Примечательно, что клетки, полученные из мочи, отобранные по этому протоколу, демонстрируют высокий потенциал для продуцирования ИПСК в течение более короткого периода времени (колонии становятся видимыми через 5-15 дней), чем обычное перепрограммирование фибробластов (20-30 дней, по нашему опыту), и с достаточно высокой вероятностью успеха. Эти клетки, полученные из мочи, были классифицированы как смешанная популяция мезенхимальных стволовых клеток, подобных клеткам, и эпителиальных клеток мочевого пузыря, что обусловливало высокую эффективность перепрограммирования15.

В дополнение к различиям в первичных ячейках, методы перепрограммирования для генерации ИПСК также различаются в зависимости от цели использования. Обычные процедуры перепрограммирования для соматических клеток человека проводились путем сверхэкспрессии факторов перепрограммирования ретровирусными или лентивирусными векторами, что позволило интегрировать экзогенную ДНК в геном 5,34,35. Чтобы сохранить геномно сгенерированные ИПСК нетронутыми, исследователи разработали широкий спектр неинтегрирующихся систем - акцизный вектор PiggyBac 36,37, эписомальный вектор38,39, неинтегрирующиеся вирусные векторы, такие как вирус Сендай 40 и аденовирус 41, трансфекциямРНК 42, трансфекция белка 43,44 и обработка химическими соединениями 45. Из-за эффективности и простоты в обращении в этом протоколе используются векторы перепрограммирования на основе вирусов Sendai. Инфекцию первичных клеток проводят в суспензионной культуре клеток и вирусов за 1 ч при кратности инфекции (MOI) 5 до нанесения покрытия. Эта модифицированная стадия может увеличить вероятность контакта между клеточными поверхностями и вирусами по сравнению с традиционным методом, при котором вирусы добавляются непосредственно к адгезивной клеточной культуре и, таким образом, дают больше колоний iPSC15.

Пассаж плюрипотентных стволовых клеток человека и NHP может быть осуществлен путем пассажирования комков и пассажа отдельных клеток. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА) является экономичным хелатирующим агентом, который связывает ионы кальция и магния и, таким образом, предотвращает адгезивную активность кадгерина и интегрина. ЭДТА также используется в качестве мягкого селективного реагента диссоциации, поскольку недифференцированные клетки отделяются раньше дифференцированных клеток из-за их различных молекул адгезии. Полная диссоциация индуцирует массивную гибель клеток ИПСК приматов через Rho/Rho-ассоциированную спиральную спираль, содержащую протеинкиназу (Rho/Rock)-опосредованную гиперактивацию миозина. Следовательно, добавление в питательную среду ингибитора Rho/Rock имеет важное значение для экспериментов, требующих одиночных клеток в суспензии46,47. В этом протоколе мы рекомендуем пассажирование сгустков в качестве рутинного метода пассажа и рекомендуем пассирование одной ячейки только тогда, когда это необходимо, например, когда требуется заполнение определенных номеров ячеек или во время субклонирования.

протокол

Эта экспериментальная процедура была одобрена ответственным этическим комитетом по экспериментам на людях (20-122, Ethikkommission LMU München). Все эксперименты проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перед началом экспериментов, связанных с образцами человека и NHP, необходимо получить одобрение соответствующего этического комитета. Все экспериментальные процедуры должны выполняться в соответствии с соответствующими руководящими принципами и правилами. Каждый из следующих шагов должен быть выполнен с использованием стерильной техники в шкафу биологической безопасности. Все композиции буферов и сред можно найти в дополнительной таблице S1. Перед добавлением в ячейки убедитесь, что все среды нагреты до комнатной температуры (22 °C). Каждый этап центрифугирования следует выполнять при комнатной температуре, если не указано иное.

1. Выделение клеток из образцов мочи

ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что доноры не заражены вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), вирусом гепатита В (ВГВ) и вирусом гепатита С (ВГС). Для NHP убедитесь, что возможные доноры / клетки свободны от специфических патогенов - вируса B (BV), вируса иммунодефицита обезьян (SIV), бетаретровируса обезьян (SRV) и лимфотропного вируса обезьян Т-клеток (STLV).

  1. Подготовьте 12-луночную пластину с желатиновым покрытием, добавив 500 мкл 0,2% желатина на лунку, и распределите жидкость, перемещая пластину. Поместите при температуре 37 ° C не менее чем на 30 минут до необходимости.
  2. Соберите образцы мочи человека в конические пробирки объемом 50 мл. Для приматов собирайте мочу с пола животного помещения с помощью шприца.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Было доказано, что объема мочи в 5 мл достаточно для выделения по крайней мере одной колонии в 42% попыток. Тем не менее, рекомендуется использовать больший объем ~ 50 мл мочи, чтобы увеличить вероятность изоляции колоний. Мочу NHP следует отбирать как можно более свежей, желательно сразу после мочеиспускания. Хранение образцов мочи при температуре 4 °C в течение 4 часов не оказало негативного влияния на успешность протокола, но более длительные сроки хранения не тестировались.
  3. Центрифугируйте пробирку, содержащую мочу, при 400 × г в течение 10 мин и тщательно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя примерно 1 мл в пробирке.
  4. Ресуспендировать гранулу в остаточном 1 мл жидкости. Объедините суспензии в одну трубку, если было собрано несколько пробирок с мочой.
  5. Промойте клетки, добавив в пробирку 10 мл буфера для промывания мочи (см. Дополнительную таблицу S1), содержащего 2,5 мкг/мл амфотерицина, и тщательно перемешайте суспензию с помощью серологической пипетки.
  6. Центрифугируйте пробирку при 200 × г в течение 10 мин и осторожно аспирируйте надосадочную жидкость, оставляя в пробирке примерно <0,2 мл.
  7. Ресуспендировать клеточную гранулу в 1 мл первичной среды мочи (см. Дополнительную таблицу S1), содержащей 0,5 мкг/мл амфотерицина на 50 мл первоначально обработанной мочи (ресуспендировать в 1 мл, даже если было обработано менее 50 мл мочи).
  8. Аспирируют желатин из лунок (приготовленных на стадии 1.1) и пластину 1 мл суспензии со стадии 1.7 в одну лунку 12-луночного планшета. Повторите для любого количества лунок или для любого количества миллилитров суспензии.
    Дополнительно: Чтобы избежать загрязнения, вызванного антисанитарным сбором проб, добавляйте 100 мкг/мл антимикробного реагента в клетки с этого момента до первого прохождения.
  9. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5% CO2 .
  10. Добавляйте 1 мл первичной среды мочи в лунку ежедневно до 5-го дня, не удаляя существующую среду.
  11. На 5-й день аспирируют 4 мл среды из пластины, оставляя примерно 1 мл среды. Добавьте 1 мл среды REMC (см. Дополнительную таблицу S1) на лунку, чтобы получить смесь 1:1 с новой питательной средой.
  12. Заменяйте половину среды средой REMC каждый день до появления первых колоний (рис. 1A, B). Поэтому удалите 1 мл старой среды и добавьте 1 мл свежей среды REMC на лунку.

2. Расширение мочевыводящих клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Пассаж мочевых клеток следует проводить до того, как культура достигнет 90% слияния.

  1. Подготовьте желаемое количество 12-луночных пластин с желатиновым покрытием, как указано в шаге 1.1.
  2. Аспирируйте старую среду и промойте клетки, добавив 1 мл фосфатного буферного физиологического раствора Дульбекко (DPBS).
  3. Аспирируйте DPBS и добавьте 300 мкл 0,5-кратного фермента диссоциации, разбавленного DPBS. Выдерживайте пластину при 37 °C в течение 5 мин.
  4. Добавьте 700 мкл среды REMC, чтобы остановить ферментативную реакцию. Аккуратно нанесите суспензию с помощью пипетки P1000 до тех пор, пока клетки не диссоциируют на отдельные клетки.
  5. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл и центрифугируйте пробирку при 200 × г в течение 5 мин.
  6. Тщательно аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 1 мл среды REMC.
  7. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток (гемоцитометра или автоматического счетчика клеток).
  8. Для расширения мочевых клеток планшет 1,5 × 10от 4 до 3 × 104 клеток в 1 мл среды REMC в одну 12-луночную пластину, покрытую 0,2% желатином.
  9. Выполняйте последующие смены среды через день, пока культура не достигнет 80%-90% слияния. Поэтому аспирируйте старую среду и добавьте 1 мл свежей среды REMC.

3. Генерация ИПСК при вирусной векторной инфекции Сендай

ПРИМЕЧАНИЕ: Рабочий процесс процедуры перепрограммирования см. на рисунке 2A. Мочевые клетки, используемые для перепрограммирования, должны быть как можно моложе, но заметной потери эффективности перепрограммирования не наблюдается до прохождения 4. Комплект для перепрограммирования вирусов Sendai должен использоваться на объекте BL-2. Работайте с вирусами в шкафу биологической безопасности с ламинарным потоком и всегда используйте соответствующее защитное оборудование для предотвращения воздействия на слизистую оболочку.

  1. Подготовьте 12-луночную пластину с матричным покрытием из базальной мембраны, добавив 500 мкл матрицы базальной мембраны на лунку, и распределите жидкость, перемещая пластину. Инкубируйте пластину при 37 °C в течение не менее 1 часа и замените матрицу базальной мембраны 900 мкл среды REMC. Храните пластину при температуре 37 °C до использования.
  2. Быстро разморозьте компоненты комплекта для перепрограммирования Sendai на водяной бане при температуре 37 °C. Смешайте вирусы Сендай (полицистронные KLF4-OCT3/4-SOX2, cMYC и KLF4) с MOI 5 и добавьте среду REMC до 100 мкл. Используйте уравнение (1):
    figure-protocol-7106
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку титры вируса различаются между партиями, всегда проверяйте титр в сертификате анализа, предоставленном производителем.
    Дополнительно: Используйте зеленый флуоресцентный белок (GFP) вируса Сендай в качестве положительного контроля эффективности трансдукции. Для этого подготовьте дополнительные 3,5 × 104 клеток в отдельной пробирке на этапе 3.3.
  3. Для диссоциации мочевых клеток выполните шаги 2.2-2.4. Подсчитайте клетки с помощью счетчика клеток и перенесите 7 × 104 мочевых клеток в пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Центрифугируйте пробирку при 200 × г в течение 5 мин и осторожно удалите надосадочную жидкость, не нарушая клеточную гранулу. Ресуспендируют гранулы в 100 мкл смеси SeV, приготовленной на этапе 3.2. Инкубировать пробирку в течение 1 ч при 37 °C при суспензионной инфекции.
  5. Пластинчатую суспензию на 12-луночные пластины с матричным покрытием базальной мембраны, которые были приготовлены на шаге 3.1. Обычно табличка 1 × 10 4 и 2,5 × 104 ячейки на лунку в двух экземплярах.
  6. Инкубируют клетки при 37 °C и 5%CO2. Замените среду 1 мл свежей среды REMC через 24 часа после трансдукции и на 3-й день.
  7. На 5-й день после трансдукции смените среду на среду генерации PSC (см. Дополнительную таблицу S1) с последующей сменой среды через день. Поэтому удалите старую среду и добавьте 1 мл среды генерации PSC на лунку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: До появления первых колоний может пройти до 15 дней.
  8. Собирают отдельные колонии ИПСК, когда размер колонии превышает 1 мм. Для этого соскребит и аккуратно собирает одну колонию пипеткой р10 под микроскопом. Перенесите колонию в новую лунку 12-луночной пластины, покрытой матрицей базальной мембраны, содержащей 750 мкл питательной среды PSC.
    Дополнительно: Ополаскивание пластины DPBS и обработка в течение 1 минуты 0,5 мМ ЭДТА перед сбором может поддержать надежную культуру дальнейших шагов. Если клетки должны культивироваться дольше, чтобы дождаться более поздних появляющихся колоний, не выполняйте этот этап лечения ЭДТА.
  9. Выращивают клетки при 37 °C и 5% CO2 с последующей сменой среды через день, как указано в разделе 4 протокола. Когда собранная колония достигнет диаметра 2 мм, продолжайте рутинное прохождение ИПСК, как описано в разделе 5 протокола.

4. Среднее изменение

ПРИМЕЧАНИЕ: Питательную среду следует менять через день, пока колонии не станут достаточно большими для прохождения.

  1. Аспирируйте старую среду и добавьте 750 мкл свежей среды на 12-луночную пластину. Чтобы переключиться на другой тип носителя, замените носитель по крайней мере через 1 день после прохождения.

5. Пассаж

ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки следует проходить, когда колонии ИПСК становятся достаточно большими (диаметр > 2 мм) или колонии вот-вот коснутся друг друга. Обычно ИПСК можно разделять примерно каждые 5 дней. Используйте комковатое пассажирование (этап 5.1) для рутинного обслуживания и одноклеточное пассажирование (этап 5.2) для экспериментов, где требуется определенное количество клеток. В случае, если ИПСК сильно дифференцируются, сбор колоний (этап 5.3) может помочь улучшить чистоту культур.

  1. Комковатое прохождение
    1. Подготовьте 12-луночную пластину с матричным покрытием из базальной мембраны, добавив 500 мкл матрицы базальной мембраны на лунку, и распределите жидкость, перемещая пластину. Инкубировать пластину при 37 °C не менее 1 ч. Замените матрицу базальной мембраны 500 мкл питательной среды PSC и храните пластину при температуре 37 °C до использования.
    2. Аспирируйте среду из культивируемых клеток и промойте клетки, осторожно добавив 500 мкл DPBS. Удалите DPBS и добавьте в лунку 500 мкл 0,5 мМ ЭДТА.
    3. Инкубируйте пластину при RT в течение 2-5 минут, пока колонии не начнут отделяться. Внимательно наблюдайте за клетками под микроскопом.
    4. Когда края колоний начнут отслаиваться и станут видны промежутки между клетками (рис. 3А), удалите ЭДТА и осторожно добавьте 500 мкл DPBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Всегда прикладывайте пипетку к боковой стенке лунки и никогда не наносите непосредственно на клетки, чтобы не отрывать клетки от пластины.
    5. Аспирируйте DPBS и промойте лунку 500 мкл питательной среды PSC с помощью пипетки p1000. Пипеткой вверх и вниз 1x-5x, чтобы распределить колонии в комки соответствующего размера (рис. 3A). Не делайте пипетку слишком много.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если ИПСК случайно слишком сильно пипетированы, добавьте в среду 10 мкМ ингибитора Rock Y-27632. Это может повысить выживаемость, так как ИПСК не способны выжить в виде одиночных клеток.
    6. Перенесите 1/10-1/50 суспензии сгустков ячеек в новые лунки. Соотношение зависит от слияния лунки перед расщеплением, желаемой плотности засеянных клеток и предпочтения клонального iPSC.
    7. Равномерно распределите комки в лунке, осторожно перемещая пластину вперед и назад несколько раз. Инкубируйте пластину не менее 30 минут при 37 °C, чтобы комки прикрепились.
    8. Замените среду 750 мкл питательной среды PSC, если наблюдается много плавающих мертвых клеток; в противном случае добавьте 250 мкл питательной среды PSC. Поместите планшет при температуре 37 ° C и 5% CO2 в инкубатор.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замена среды через 30 минут имеет решающее значение, особенно для нестабильных клеточных линий (например, NHP).
    9. Меняйте среду каждые 2-3 дня, пока колонии не станут достаточно большими для пассажа. Для среднего изменения выполните шаг 4 протокола.
  2. Пассаж одной клетки
    1. Готовят культуральную пластину, покрытую матричным покрытием базальной мембраны, как указано на этапе 5.1.1, с добавлением 10 мкМ Y-27632 в питательную среду PSC.
      Дополнительно: Добавьте 10 мкМ Y-27632 в клетки за 1-3 ч до пассажа для повышения выживаемости чувствительных клеточных линий.
    2. Аспирируйте среду и промойте клетки, добавив 500 мкл DPBS. Удалите DPBS и добавьте в лунки 300 мкл отслойного раствора.
    3. Инкубируйте пластину при 37 °C в течение 5-10 минут. Когда под микроскопом наблюдается достаточная отслойка клеток, добавляют 700 мкл питательной среды PSC или DPBS.
    4. Пипетка вверх и вниз 5-10 раз с помощью пипетки p1000 до тех пор, пока клетки не диссоциируют на отдельные клетки. Не делайте пипетку слишком много, чтобы предотвратить повреждение клеток.
    5. Перенесите клеточную суспензию в пробирку объемом 15 мл, содержащую, по крайней мере, 2 мл DPBS, чтобы разбавить раствор отслойки.
    6. Центрифугируют пробирку при 200 × г в течение 5 мин и полностью аспирируют раствор, не нарушая клеточную гранулу.
    7. Ресуспендировать гранулу в 500 мкл питательной среды PSC с добавлением 10 мкМ Y-27632.
    8. Подсчитайте ячейки и засейте 5000-7000 клеток на 12-луночную пластину с матричным покрытием базальной мембраны, подготовленную на шаге 5.2.1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если требуется другой номер ячейки, измените его на больший или меньший колодец соответственно.
    9. Инкубируйте пластину не менее 30 минут при 37 °C и 5% CO2 , чтобы клетки прикрепились.
    10. Замените среду на 750 мкл питательной среды PSC + 10 мкМ Y-27632, если наблюдается много мертвых клеток; в противном случае добавьте 250 мкл + 10 мкМ Y-27632.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг имеет решающее значение, особенно для нестабильных клеточных линий (например, NHP).
    11. Поместите планшет при температуре 37 ° C и 5% CO2 в инкубатор.
    12. Через 1-2 дня после расщепления замените среду на культуральную среду PSC без Y-27632, чтобы клетки снова продемонстрировали классическую морфологию колонии (рис. 3B).
    13. Меняйте среду каждые 2 дня, пока колонии не станут достаточно большими. Для изменения среды следуйте разделу 4 протокола.
  3. Прохождение ИПСК путем сбора колоний
    1. Подготовьте 12 лунок с матричным покрытием фундаментальной мембраны, как указано на шаге 5.1.1.
    2. Аспирируйте среду и промойте клетки, осторожно добавив 500 мкл DPBS. Удалите DPBS и добавьте в лунку 500 мкл 0,5 мМ ЭДТА.
    3. Инкубируйте пластину при ЛТ в течение 1-3 мин и наблюдайте за клетками под микроскопом, пока на границах не будет видно отслоение колонии.
    4. Удалите ЭДТА и осторожно добавьте 500 мкл DPBS. Аспирируйте жидкость перед тем, как медленно добавить 500 мкл питательной среды PSC в лунку, не отделяя клетки.
    5. Используйте пипетку p200, чтобы выбрать нужную колонию под микроскопом, не собирая дифференцированные клетки. Для этого аккуратно поцарапайте колонию, взяв среду, содержащую клетки.
    6. Пересадите каждую собранную колонию в одну лунку с матричным покрытием базальной мембраны, как это подготовлено на этапе 5.3.1. Диссоциируйте клетки на небольшие скопления с помощью пипетки p1000, пипетируя клетки 2-5 раз.
    7. Инкубируйте пластину в течение 30 минут при 37 ° C и 5% CO2, позволяя сгусткам прикрепиться.
    8. Замените среду 750 мкл питательной среды PSC, если наблюдается много плавающих мертвых клеток; в противном случае добавьте 250 мкл питательной среды PSC.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Замена среды через 30 минут имеет решающее значение, особенно для нестабильных клеточных линий (например, NHP).
    9. Поместите планшет при температуре 37 ° C и 5% CO2 в инкубатор.
    10. Меняйте среду каждые 2-3 дня, пока колонии не станут достаточно большими для пассажа. Для этого следуйте разделу 4 протокола.

6. Замораживание мочевых клеток и ИПСК для длительного хранения

ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно ИПСК замораживают в виде комков в среде для замораживания клеток без подсчета. Пипетирование должно быть минимальным, чтобы избежать диссоциации на единичные клетки. Для мочевых клеток, как правило, 1,5 × 10от 4 до 3 × 104 клеток замораживаются в одной пробирке, что позволяет пользователю размораживать одну пробирку непосредственно в одной лунке 12-луночной пластины без необходимости еще одного этапа подсчета.

  1. Приготовьте 5 мл DPBS в пробирке объемом 15 мл.
  2. Для замораживания мочевых клеток следуйте шагам 2.2-2.4 протокола. Для замораживания ИПСК выполните шаги 5.1.2-5.1.5 из протокола прохождения комков.
  3. Перенесите суспензию в пробирку объемом 15 мл, приготовленную на шаге 6.1. Для замораживания мочевых клеток отсчитайте 10 мкл клеточной суспензии с помощью гемоцитометра. Центрифугируют клетки в течение 5 мин при 200 × г и полностью аспирируют надосадочную жидкость.
  4. Ресуспендируйте гранулу ячейки в 400 мкл среды для замораживания клеток на пробирку и распределите клетки по желаемому количеству криотрубок.
  5. Немедленно переместите криотрубки в -80 °C. Перенесите замороженные пробирки в морозильную камеру с температурой -150 °C или жидкий азот через 1 день после замораживания при -80 °C для длительного хранения.

7. Размораживание мочевых клеток и ИПСК

  1. Для размораживания мочевых клеток подготовьте желаемое количество 12-лунок, покрытых желатином, как указано на шаге 1.1 протокола. Для ИПСК подготовьте 12-луночные пластины с матричным покрытием базальной мембраны, как указано на этапе 5.1.1. В обоих случаях не следует менять матрицу на среднюю.
  2. Подготовьте пробирку объемом 15 мл, содержащую 4 мл DPBS, и храните ее при температуре 37 °C.
  3. Быстро поместите замороженный флакон с клетками на водяную баню с температурой 37 °C для оттаивания, пока не станет виден кусок плавающего льда.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протирайте криотрубку этанолом до и после инкубации на водяной бане, чтобы избежать загрязнения.
  4. Добавьте 500 мкл среды REMC для мочевых клеток или 500 мкл питательной среды PSC для ИПСК в суспензию, содержащую лед, и немедленно перенесите суспензию в предварительно нагретую пробирку объемом 15 мл, приготовленную на этапе 7.2.
  5. Центрифугируйте пробирку при 200 × г в течение 5 мин и полностью выбросьте надосадочную жидкость.
  6. Для мочевых клеток ресуспендируют гранулу в 1 мл среды REMC. Для ИПСК осторожно ресуспендируют гранулу в 750 мкл питательной среды PSC. Избегайте слишком частого пипетирования, чтобы сохранить комки нетронутыми.
    Дополнительно: добавление в среду 10 мкМ Y-27632 может поддерживать выживание ИПСК после размораживания.
  7. Аспирируйте матрицу из 12-луночных пластин, подготовленных на шаге 7.1, и осторожно перенесите суспензию ячейки в лунку.
  8. Поместите планшет на ночь при температуре 37 °C и 5% CO2 в инкубатор.
  9. На следующий день замените среду питательной средой PSC, без Y-27632 для ИПСК и REMC для мочевых клеток.
  10. Выращивайте клетки при 37 ° C и 5% CO2 в инкубаторе.
  11. Меняйте среду каждые 2-3 дня, пока клетки не станут достаточно большими для пассажа. Для изменения среды следуйте разделу 4 протокола.

8. Иммуноцитохимия

ПРИМЕЧАНИЕ: Иммуноокрашивание антителами, нацеленными на маркеры, связанные с плюрипотентностью, такие как NANOG, OCT3/4, SOX2, TRA-1-60 и EpCAM, является одним из наиболее широко используемых подтверждений недавно сгенерированных ИПСК. Дополнительную информацию об антителах и разведениях можно найти в таблице материалов.

  1. Планшетные ИПСК за 1-3 дня до использования в соответствующем количестве 12-луночных планшетов. Аспирируйте среду, промойте клетки, добавив 500 мкл DPBS, и удалите DPBS. Добавьте 400 мкл 4% параформальдегида (PFA) в лунку и зафиксируйте ячейки на 15 мин при RT.
  2. Удалите 4% ПФА и промойте ячейки 3 раза с помощью DPBS. Добавьте 400 мкл блокирующего буфера на лунку и инкубируйте пластину в течение 30 минут при RT.
  3. Аспирируйте блокирующий буфер и добавьте антитела, разбавленные в 400 мкл буфера разбавления антител (ADB), в каждую лунку. Инкубируйте тарелку при температуре 4 °C в течение ночи.
  4. Удалите ADB, содержащий первичные антитела, и промойте клетки 3 раза с помощью DPBS.
  5. Аспирируйте DPBS и добавьте 400 мкл вторичных антител, разведенных в ADB на лунку. Выдерживают пластину в течение 1 ч при РТ в темноте.
  6. Снимите ADB и промойте ячейки 3 раза с помощью DPBS. Добавьте 1 мкг/мл 4',6-диамидино-2-фенилиндол (DAPI), разведенный в DPBS на лунку, и инкубируйте в течение 3 мин при RT.
  7. Аспирируйте раствор DAPI и промойте ячейку 3 раза с помощью DPBS. Добавьте 500 мкл DPBS для визуализации.

Результаты

При выделении клеток из мочи человека и NHP различные типы клеток могут быть идентифицированы непосредственно после выделения. Плоскоклеточные клетки, а также различные более мелкие круглые клетки выводятся с мочой; женская моча содержит гораздо больше плоскоклеточных клеток, чем мужс...

Обсуждение

ИПСК являются ценными типами клеток, поскольку они позволяют генерировать иначе недоступные типы клеток in vitro. В качестве исходных материалов для перепрограммирования, например, фибробласты не всегда доступны для всех видов приматов, в этой статье представлен протокол генерации ?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликтов интересов, которые необходимо раскрывать.

Благодарности

Эта работа была поддержана DFG EN 1093/5-1 (номер проекта 458247426). М.О. был поддержан JSPS Overseas Research Fellowship. Все фигурки были созданы с BioRender.com. Проточная цитометрия проводилась с помощью проточной цитометрии Core Facility в Биомедицинском центре Мюнхена. Мы хотели бы поблагодарить Макото Шиду и Томоё Муто из ASHBi, Киотский университет, за поддержку видеосъемки.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Accumax™ cell detachment solution (Detachment solution)Sigma-AldrichSCR006
Amphotericin B-SolutionMerckA2941-100ML
Anti-Human TRA-1-60 Mouse Antibody Stem Cell Technologies60064Dilution: 1/200
Anti-Human TRA-1-60 PE-conjugated Antibody Miltenyi Biotec130-122-965Dilution: 1/50
Bambanker™ (Cell freezing medium)Nippon GeneticsBB01
Bovine Serum Albumin (BSA)Sigma-AldrichA3059-100G
Cell culture multiwell plate, 12-well CELLSTARGreiner BIO-ONE665180
Countess™ II automated cell counterThermo Fisher ScientificAMQAX1000
CryoKing® 1.5 mL Tubes with 2D Barcode (Cryotubes)Sued-Laborbedarf52 95-0213Different types of Cryotubes can be used for freezing. The 2D barcode tubes have the advantage that the sample info can be stored in a database with unique tube information.
CytoTune™ EmGFP Sendai Fluorencence Reporter (GFP Sendai virus)Thermo Fisher ScientificA16519
CytoTune™-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit (Sendai virus reprogramming kit)Thermo Fisher ScientificA16518
DAPI 4',6-Diamidine-2'-phenylindole dihydrochlorideSigma-Aldrich10236276001
DMEM High GlucoseTH.GeyerL0102
DMEM/F12 w L-glutamineFisher Scientific15373541
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 488Thermo Fisher ScientificA-21202Dilution: 1/500
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor™ 594Thermo Fisher ScientificA-21207Dilution: 1/500
DPBS w/o Calcium w/o MagnesiumTH.GeyerL0615-500
EpCAM Recombinant Polyclonal Rabbit Antibody (22 HCLC)Thermo Fisher Scientific710524Dilution: 1/500
Ethylenediamine tetraacetic acid (EDTA)Carl RothCN06.3
Falcon Tube 15 mL conical bottomGreiner BIO-ONE188271-N
Falcon Tube 50 mL conical bottomGreiner BIO-ONE227261
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, Brazil (FBS)Thermo Fisher Scientific10500064
FlowJo V10.8.2FlowJo 663441
Gelatin from porcine skinSigma-AldrichG1890-1KG
Geltrex™ LDEV-Free, hESC-Qualified, Reduced Growth Factor Basement Membrane MatrixThermo Fisher ScientificA1413301
GlutaMAX™ SupplementThermo Fisher Scientific35050038
Heracell™ 240i CO2 incubatorFisher Scientific16416639
Heraeus HeraSafe safety cabinetKendro51017905
Human EGF, premium gradeMiltenyi Biotec130-097-749
ImageJ FijiVersion 2.9.0
MEM Non-Essential Amino Acids Solution (100X)Thermo Fisher Scientific11140035
Microcentrifugation tube PP, 1.5 mLNerbe Plus04-212-1000
Microscope Nikon eclipse TE2000-SNikonTE2000-S
Mouse anti-alpha-Fetoprotein antibodyR&D SystemsMAB1368Dilution: 1/100
Mouse anti-alpha-Smooth Muscle Actin antibodyR&D SystemsMAB1420Dilution: 1/100
Mouse anti-beta-III Tubulin antibodyR&D SystemsMAB1195Dilution: 1/100
mTeSR™ 1STEMCELL Technolgies85850
Nanog (D73G4) XP Rabbit mAb Cell Signaling Technology4903SDilution: 1/400
Normocure™ (Antimicrobial Reagent)Invivogenant-noc
Oct-4 Rabbit Antibody Cell Signaling Technology2750SDilution: 1/400
Paraformaldehyde (PFA)Sigma-Aldrich441244-1KG
Penicillin-Streptomycin (10.000 U/ml) (PS)Thermo Fisher Scientific15140122Penicillin-Streptomycin mix contains 100 U/mL Penicillin and 100 µg/mL Streptomycin.
Recombinant Human FGF-basicPeproTech100-18B
Recombinant Human PDGF-ABPeproTech100-00AB
Refrigerated benchtop centrifugeSIGMA 4-16KS
Renal Epithelial Cell Basal MediumATCCPCS-400-030
Renal Epithelial Cell Growth KitATCCPCS-400-040
Sox2 (L1D6A2) Mouse mAb #4900Cell Signaling Technology4900SDilution: 1/400
SSEA4 (MC813) Mouse mAbNEB4755SDilution: 1/500
StemFit® Basic02Nippon Genetics3821.00The production of this medium was discontinued, use StemFit Basic04CT for human cell lines or StemFit Basic03 for non-human primates instead.
Triton X-100 Sigma-AldrichT8787-50ML
TrypLE™ Select Enzyme (1x), no phenol red (Dissociation enzyme)Thermo Fisher Scientific12563011
Waterbath Precision GP 05Thermo Fisher ScientificTSGP05
Y-27632, Dihydrochloride Salt (Rock Inhibitor)BiozolBYT-ORB153635
Antibody dilution bufferFor composition see the supplementary table S1
Blocking bufferFor composition see the supplementary table S1
REMC mediumFor composition see the supplementary table S1
Primary urine mediumFor composition see the supplementary table S1
PSC culture mediumFor composition see the supplementary table S1
PSC generation mediumFor composition see the supplementary table S1
Urine wash bufferFor composition see the supplementary table S1

Ссылки

  1. Pääbo, S. The human condition-a molecular approach. Cell. 157 (1), 216-226 (2014).
  2. Zoonomia Consortium, . A comparative genomics multitool for scientific discovery and conservation. Nature. 587 (7833), 240-245 (2020).
  3. Kircher, M., et al. A general framework for estimating the relative pathogenicity of human genetic variants. Nature Genetics. 46 (3), 310-315 (2014).
  4. Enard, W. Functional primate genomics-leveraging the medical potential. Journal of Molecular Medicine. 90 (5), 471-480 (2012).
  5. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  6. Wunderlich, S., et al. Primate iPS cells as tools for evolutionary analyses. Stem Cell Research. 12 (3), 622-629 (2014).
  7. Denli, A. M., et al. Primate-specific ORF0 contributes to retrotransposon-mediated diversity. Cell. 163 (3), 583-593 (2015).
  8. Ramsay, L., et al. Conserved expression of transposon-derived non-coding transcripts in primate stem cells. BMC Genomics. 18 (1), 214 (2017).
  9. Marchetto, M. C. N., et al. Differential L1 regulation in pluripotent stem cells of humans and apes. Nature. 503 (7477), 525-529 (2013).
  10. Gallego Romero, ., I, , et al. A panel of induced pluripotent stem cells from chimpanzees: a resource for comparative functional genomics. eLife. 4, 07103 (2015).
  11. Pavlovic, B. J., Blake, L. E., Roux, J., Chavarria, C., Gilad, Y. A comparative assessment of human and chimpanzee iPSC-derived cardiomyocytes with primary heart tissues. Scientific Reports. 8 (1), 15312 (2018).
  12. Rhodes, K., et al. Human embryoid bodies as a novel system for genomic studies of functionally diverse cell types. eLife. 11, 71361 (2022).
  13. Kanton, S., et al. Organoid single-cell genomic atlas uncovers human-specific features of brain development. Nature. 574 (7778), 418-422 (2019).
  14. Dannemann, M., Gallego Romero, ., I, Harnessing pluripotent stem cells as models to decipher human evolution. The FEBS Journal. 289 (11), 2992-3010 (2022).
  15. Geuder, J., et al. A non-invasive method to generate induced pluripotent stem cells from primate urine. Scientific Reports. 11 (1), 3516 (2021).
  16. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  17. Ludwig, T. E., et al. Feeder-independent culture of human embryonic stem cells. Nature Methods. 3 (8), 637-646 (2006).
  18. Chen, G., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nature Methods. 8 (5), 424-429 (2011).
  19. Aoi, T., et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science. 321 (5889), 699-702 (2008).
  20. Kim, J. B., et al. Pluripotent stem cells induced from adult neural stem cells by reprogramming with two factors. Nature. 454 (7204), 646-650 (2008).
  21. Ruiz, S., et al. High-efficient generation of induced pluripotent stem cells from human astrocytes. PloS One. 5 (12), (2010).
  22. Aasen, T., et al. Efficient and rapid generation of induced pluripotent stem cells from human keratinocytes. Nature Biotechnology. 26 (11), 1276-1284 (2008).
  23. Park, I. -. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134 (5), 877-886 (2008).
  24. Loh, Y. -. H., et al. Reprogramming of T cells from human peripheral blood. Cell Stem Cell. 7 (1), 15-19 (2010).
  25. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Human Molecular Genetics. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  26. Sun, N., et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (37), 15720-15725 (2009).
  27. Giorgetti, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood using. OCT4 and SOX2. Cell Stem Cell. 5 (4), 353-357 (2009).
  28. Eminli, S., et al. Differentiation stage determines potential of hematopoietic cells for reprogramming into induced pluripotent stem cells. Nature Genetics. 41 (9), 968-976 (2009).
  29. Haase, A., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human cord blood. Cell Stem Cell. 5 (4), 434-441 (2009).
  30. Staerk, J., et al. Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).
  31. Zhou, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from urine. Journal of the American Society of Nephrology. 22 (7), 1221-1228 (2011).
  32. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  33. Zhou, T., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from urine samples. Nature Protocols. 7 (12), 2080-2089 (2012).
  34. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  35. Wernig, M., et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature. 448 (7151), 318-324 (2007).
  36. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  37. Kaji, K., et al. Virus-free induction of pluripotency and subsequent excision of reprogramming factors. Nature. 458 (7239), 771-775 (2009).
  38. Yu, J., et al. Human induced pluripotent stem cells free of vector and transgene sequences. Science. 324 (5928), 797-801 (2009).
  39. Okita, K., et al. A more efficient method to generate integration-free human iPS cells. Nature Methods. 8 (5), 409-412 (2011).
  40. Seki, T., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human terminally differentiated circulating T cells. Cell Stem Cell. 7 (1), 11-14 (2010).
  41. Zhou, W., Freed, C. R. Adenoviral gene delivery can reprogram human fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27 (11), 2667-2674 (2009).
  42. Warren, L., et al. Highly efficient reprogramming to pluripotency and directed differentiation of human cells with synthetic modified mRNA. Cell Stem Cell. 7 (5), 618-630 (2010).
  43. Zhou, H., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 4 (5), 381-384 (2009).
  44. Kim, D., et al. Generation of human induced pluripotent stem cells by direct delivery of reprogramming proteins. Cell Stem Cell. 4 (6), 472-476 (2009).
  45. Guan, J., et al. Chemical reprogramming of human somatic cells to pluripotent stem cells. Nature. 605 (7909), 325-331 (2022).
  46. Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nature Biotechnology. 25 (6), 681-686 (2007).
  47. Ohgushi, M., et al. Molecular pathway and cell state responsible for dissociation-induced apoptosis in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 7 (2), 225-239 (2010).
  48. Ohnuki, M., et al. Dynamic regulation of human endogenous retroviruses mediates factor-induced reprogramming and differentiation potential. Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (34), 12426-12431 (2014).
  49. Rouhani, F., et al. Genetic background drives transcriptional variation in human induced pluripotent stem cells. PLoS Genetics. 10 (6), 1004432 (2014).
  50. Kim, K., et al. Epigenetic memory in induced pluripotent stem cells. Nature. 467 (7313), 285-290 (2010).
  51. Polo, J. M., et al. Cell type of origin influences the molecular and functional properties of mouse induced pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 28 (8), 848-855 (2010).
  52. Koyanagi-Aoi, M., et al. Differentiation-defective phenotypes revealed by large-scale analyses of human pluripotent stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (51), 20569-20574 (2013).
  53. Nishizawa, M., et al. Epigenetic variation between human induced pluripotent stem cell lines is an indicator of differentiation capacity. Cell Stem Cell. 19 (3), 341-354 (2016).
  54. Yokobayashi, S., et al. Inherent genomic properties underlie the epigenomic heterogeneity of human induced pluripotent stem cells. Cell Reports. 37 (5), 109909 (2021).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

197

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены