Цельный препарат на основе метанола для исследования ганглиозных клеток сетчатки

Резюме

Метанол можно использовать в качестве вспомогательной фиксированной среды для препаратов сетчатки и длительного хранения, что полезно для исследования ганглиозных клеток сетчатки.

Аннотация

Ганглиозные клетки сетчатки (RGCs), которые являются проекционными нейронами сетчатки, распространяют внешнюю визуальную информацию в мозг. Патологические изменения в RGC имеют тесную связь с многочисленными дегенеративными заболеваниями сетчатки. Цельное иммуноокрашивание сетчатки часто используется в экспериментальных исследованиях RGC для оценки развития и патологических состояний сетчатки. При некоторых обстоятельствах некоторые ценные образцы сетчатки, например, от трансгенных мышей, может потребоваться хранить в течение длительного периода времени, не влияя на морфологию или количество RGC. Для получения достоверных и воспроизводимых экспериментальных результатов необходимо использовать эффективную консервирующую среду. Здесь мы описываем действие метанола как вспомогательной фиксированной среды для препаратов сетчатки и длительного хранения. Короче говоря, в процессе изоляции холодный метанол (-20 ° C) пипеткой наносится на поверхность сетчатки, чтобы помочь зафиксировать ткани и облегчить их проницаемость, а затем сетчатку можно хранить в холодном метаноле (-20 ° C) перед иммуноокрашиванием. Этот протокол описывает рабочий процесс выделения сетчатки и протокол хранения образцов тканей, что полезно и практично для исследования RGC.

Введение

Ганглиозные клетки сетчатки (RGCs) являются единственными проекционными нейронами в сетчатке, и они интегрируют и передают внешнюю визуальную информацию в мозг¹. Многие нейродегенеративные заболевания, такие как глаукома и травматическая нейропатия зрительного нерва, характеризуются необратимым повреждением и потерей RGCs ^2,3. Анализ морфологических и количественных изменений RGC является важным шагом в определении того, как развиваются и прогрессируют нейродегенеративные заболевания ^4,5.

Непрямой имм....

протокол

Все действия выполняются при комнатной температуре, если не указано иное. Все использованные мыши C57BL / 6J были получены из Центра лабораторных животных Уханьского университета, и все связанные с этим эксперименты были одобрены Комитетом по этике экспериментов на животных Уханьского университета. Были приложены все усилия, чтобы свести к минимуму страдания мышей.

1. Энуклеация и фиксация глаз

1. Усыпьте мышей удушьем углекислым газом и осторожно энуклеируйте глазное яблоко с помощью беззубого пинцета.
2. Промойте глазное яблоко один раз в фосфатно-буферном физиологическом растворе (PBS).
3. Проколите ....

Результаты

После рассечения сетчатка должна быть похожа на плоский четырехлистный клевер. В этом исследовании, используя протокол, описанный выше, сетчатка побелела после добавления метанола (рис. 1). Между тем, сетчатка изменилась с мягкой на податливую и плоскую. Затем RGC были пом?.......

Обсуждение

Фиксация является важным шагом для сохранения сетчатки, что может повлиять на любые последующие исследования RGC, основанные на морфологии. Успешная фиксация быстро фиксирует структуру и состояние сетчатки в момент воздействия на нее фиксирующей среды, что имеет решающее значение для ?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
24-well cell culture cluster	Costar		Eyeball fixation
24-well hemagglutination plate	Labedit Company		Incubation antibody
Adhesion microscope slides	Citotest		Or similar
Anti-fluorescent quenching mountant	Servicebio	G1401	Slow down fluorescence quenching
BSA (bovine serum albumin)	Servicebio	GC305010	Blocking reagent
Confocal microscope	OLYMPUS		Apply 40x objective lens
Curved scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Dissecting microscope	RWD Life science Co.,LTD	77001S	Dissecting tools
Forceps	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools
Methanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20210624	GC≥99.5%
Nail polish	SecheVite		Sealing agent
Needles	Shanghai Kindly Enterprises Development Group Co., Ltd.		Accelerate the fixation
Paraformaldehyde solution	Servicebio	G1101	Eyeball fixation
PBS (phosphate buffered saline pH 7.4)	Servicebio	G0002	Rinse the eyeball
Primary antibody: guinea pig anti-RNA-binding protein with multiple splicing (RBPMS)	PhosphoSolutions	Cat. #1832-RBPMS	For immunofluorescence. Used at 1:400
Secondary antibody: Cy3 affiniPure donkey anti-guinea pig IgG (H+L)	Jackson ImmunoResearch	706-165-148	For immunofluorescence. Used at 1:400
Straight scissors	Jiangsu Kanghua Medical Equipment Co., Ltd.		Dissecting tools