Диссекция Stria vascularis взрослой мыши для секвенирования одного ядра или иммуноокрашивания

Резюме

Сосудистая полость жизненно важна для генерации эндокохлеарного потенциала. Здесь мы представляем вскрытие сосудистой полосы взрослой мыши для секвенирования одного ядра или иммуноокрашивания.

Аннотация

Эндокохлеарный потенциал, который генерируется stria vascularis, необходим для поддержания среды, способствующей соответствующей механотрансдукции волосковых клеток и, в конечном итоге, слуху. Патологии сосудистой полосы могут привести к снижению слуха. Диссекция взрослой полости vascularis позволяет сфокусировать одноядерный захват и последующее одноядерное секвенирование и иммуноокрашивание. Эти методы используются для изучения патофизиологии васкулярной полоски на одноклеточном уровне.

Одноядерное секвенирование может быть использовано в условиях транскрипционного анализа stria vascularis. Между тем, иммуноокрашивание по-прежнему полезно для идентификации конкретных популяций клеток. Оба метода требуют надлежащего рассечения полоски сосудов в качестве предварительного условия, что может оказаться технически сложным.

Введение

Улитка состоит из трех заполненных жидкостью камер: преддверия чешуйчатой полосы, средней полости и тимпанской щели. Scala vestibuli и scala tympani содержат перилимфу, которая имеет высокую концентрацию натрия (138 мМ) и низкую концентрацию калия (6,8 мМ)¹. Средняя чешуя содержит эндолимфу, которая имеет высокую концентрацию калия (154 мМ) и низкую концентрацию натрия (0,91 мМ)^1,2,3. Эта разница в концентрации ионов может быть названа эндокохлеарным потенциалом (EP) и в основном генерируется движением ионов калия через различные ионные каналы и щелевы....

протокол

Все эксперименты и процедуры на животных проводились в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института неврологических заболеваний и инсульта и Национальным институтом глухоты и других коммуникативных расстройств Национальных институтов здравоохранения. Все экспериментальные протоколы были одобрены Комитетом по уходу за животными и их использованию Национального института неврологических заболеваний и инсульта и Национальным институтом глухоты и других коммуникативных расстройств Национального института здравоохранения. Все методы проводились в соответствии с соответствующими руководящими принципами ....

Результаты

Мы представляем метод выделения SV, который будет использоваться либо для sNuc-Seq, либо для иммуноокрашивания. Соответствующая анатомия (рис. 1) улитки по отношению к SV может помочь пользователям лучше понять организацию SV и этапы протокола вскрытия.

Каждый э?.......

Обсуждение

До появления секвенирования отдельных клеток многие исследователи использовали объемный анализ тканей, который позволял анализировать только транскриптомы, усредненные по клеткам. В частности, single-cell и sNuc-Seq позволили выделить транскриптом одной клетки или одиночного ядра соответст?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50010-01	Filter tissue during sNuc-Seq
18 x 18 mm cover glass	Fisher Scientific	12-541A	Cover slip to mount SV
30-µm filter (Polyethylenterephthalat)	PluriSelect	#43-50030-03	Filter tissue during sNuc-Seq
75 x 25 mm Superfrost Plus/Colorforst Plus Microslide	Daigger	EF15978Z	Microslide to mount SV on
C57BL/6J Mice	The Jackson Laboratory	RRID: IMSR_JAX:000664	General purpose mouse strain that has pigment more easily seen in the intermediate cells of the SV.
Cell Counter	Logos Biosystems	L20001	Used for cell counting
Chalizon curette 5'', size 3 2.5 mm	Biomedical Research Instruments	15-1020	Used to transfer SV
Chromium Next GEM single Cell 3' GEM Kit v3.1	Chromium	PN-1000141	Generates single cell 3' gene expression libraries
Clear nail polish	Fisher Scientific	NC1849418	Used for sealing SV mount
Corning Falcon Standard Tissue Culture Dishes, 24 well	Corning	08-772B	Culture dish used to hold specimen during dissection
DAPI	Invitrogen	D1306, RRID: AB_2629482	Stain used for nucleus labeling
Dounce homogenizer	Sigma-Aldrich	D8938	Used to homogenize tissue for sNuc-seq
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11252-30	General forceps for dissection
Dumont #55 Forceps	Fine Science Tools	11255-20	Forceps with fine tip that makes SV manipulation easier
Fetal Bovine Serum	ThermoFisher	16000044	Used for steps of sNuc-Seq
Glue stick	Fisher Scientific	NC0691392	Used for mounting SV
GS-IB4 Antibody	Molecular Probes	I21411, RRID: AB-2314662	Antibody used for capillary labeling
KCNJ10-ZsGreen Mice	n/a	n/a	Transgenic mouse that expresses KCNJ10-ZsGreen, partiularly in the intermediate cells of the SV.
MgCl2	ThermoFisher	AM9530G	Used for steps of sNuc-Seq
Mounting reagent	ThermoFisher	#S36940	Mounting reagent for SV
Multiwell 24 well plate	Corning	#353047	Plate used for immunostaining
NaCl	ThermoFisher	AAJ216183	Used for steps of sNuc-Seq
Nonidet P40	Sigma-Aldrich	9-16-45-9	Used for steps of sNuc-Seq
Nuclease free water	ThermoFisher	4387936	Used for steps of sNuc-Seq
Orbital shaker	Silent Shake	SYC-2102A	Used for steps of immunostaining
PBS	ThermoFisher	J61196.AP	Used for steps of immunostaining and dissection
RNA Later	Invitrogen	AM7021	Used for preservation of SV for sNuc-Seq
Scizzors	Fine Science Tools	14058-09	Used for splitting mouse skull
Tris-HCl	Sigma-Aldrich	15506017	Used for steps of sNuc-Seq
Trypan blue stain	Gibco	15250061	Used for cell counting
Tween20	ThermoFisher	AAJ20605AP	Used for steps of sNuc-Seq
Zeiss STEMI SV 11 Apo stereomicroscope	Zeiss	n/a	Microscope used for dissections