Основанные на изображениях методы изучения событий мембранного транспорта в клетках устьичной линии

Резюме

Здесь представлено несколько широко используемых методов для изучения событий мембранного транспорта рецепторной киназы плазматической мембраны. В этой рукописи подробно описаны протоколы, включающие подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации.

Аннотация

В эукариотических клетках мембранные компоненты, включая белки и липиды, пространственно-временные транспортируются к месту назначения в пределах эндомембранной системы. Это включает в себя секреторный транспорт вновь синтезированных белков на поверхность клетки или снаружи клетки, эндоцитарный транспорт внеклеточных грузов или компонентов плазматической мембраны в клетку, а также рециркуляцию или перемещение грузов между субклеточными органеллами и т. д. Мембранный транспорт имеет решающее значение для развития, роста и адаптации к окружающей среде всех эукариотических клеток и, таким образом, находится под строгим регулированием. Рецепторные киназы клеточной поверхности, воспринимающие сигналы лигандов из внеклеточного пространства, подвергаются как секреторному, так и эндоцитарному транспорту. Здесь описаны широко используемые подходы к изучению событий мембранного транспорта с использованием рецепторной киназы ERL1, локализованной на плазматической мембране. Подходы включают подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации. Для мониторинга пространственно-временной регуляции ERL1 в данном исследовании описывается анализ колокализации между ERL1 и мультивезикулярным белком-маркером тельца, RFP-Ara7, анализ временных рядов этих двух белков и анализ z-стека ERL1-YFP, обработанного ингибиторами мембранного транспорта брефельдином А и вортманнином.

Введение

Мембранный трафик представляет собой консервативный клеточный процесс, при котором компоненты мембраны (также известные как грузы), включая белки, липиды и другие биологические продукты, распределяются между различными органеллами внутри эукариотической клетки или через плазматическую мембрану во внеклеточное^{пространство и} из него. Этому процессу способствует совокупность мембран и органелл, называемая эндомембранной системой, которая состоит из ядерной мембраны, эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, вакуоли/лизосом, плазматической мембраны и множественных эндосом¹. Эндомембранная система позволяет модифициро....

протокол

1. Приготовление растворов

1. Приготовьте раствор для стерилизации семян, смешав 15 мл отбеливателя с 35 мл дистиллированной воды и 50 мкл Triton X-100.
2. Приготовьте раствор брефельдина А (БФА), растворив порошок БЖК в этаноле до конечной концентрации 10 мМ (исходное сырье). Приготовьте раствор вортманнина (Wm), растворив порошок Wm в DMSO до конечной концентрации 10 мМ (запас).

2. Посев семян

1. Аликвотируют 10-50 семян от каждого из необходимых трансгенных растений в пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мл раствора для стерилизации семян в каждую пробирку и тщат....

Результаты

Предыдущее исследование показало, что ERL1 является активной рецепторной киназой, которая претерпевает динамические события мембранного транспорта²⁰. ERL1 представляет собой трансмембранную LRR-рецепторную киназу на плазматической мембране. Вновь синтезированный ERL1 в эндопл.......

Обсуждение

Эндомембранная система разделяет цитоплазму эукариотической клетки на различные компартменты, что обеспечивает специализированную биологическую функцию этих органелл. Чтобы доставить белки и макромолекулы груза в конечный пункт назначения в нужное время, многочисленные везикулы п.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 mL syringes	VWR	BD309695	Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)	Sigma	B7651	membrane trafficking drug
Confocal Microscope	Leica	Lecia SP8 TCS with LAS-X software package	Imaging
Dissecting Forceps	VWR	82027-402	Genetic cross
Fiji	NIH	https://imagej.net/Fiji	Image processing
Leica LAS AF software	Leica	http://www.leica-microsystems.com	Image processing
transgenic seeds of ERL1-YFP			Qi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7			Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)	Sigma	W1628	membrane trafficking drug