Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь представлено несколько широко используемых методов для изучения событий мембранного транспорта рецепторной киназы плазматической мембраны. В этой рукописи подробно описаны протоколы, включающие подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации.

Аннотация

В эукариотических клетках мембранные компоненты, включая белки и липиды, пространственно-временные транспортируются к месту назначения в пределах эндомембранной системы. Это включает в себя секреторный транспорт вновь синтезированных белков на поверхность клетки или снаружи клетки, эндоцитарный транспорт внеклеточных грузов или компонентов плазматической мембраны в клетку, а также рециркуляцию или перемещение грузов между субклеточными органеллами и т. д. Мембранный транспорт имеет решающее значение для развития, роста и адаптации к окружающей среде всех эукариотических клеток и, таким образом, находится под строгим регулированием. Рецепторные киназы клеточной поверхности, воспринимающие сигналы лигандов из внеклеточного пространства, подвергаются как секреторному, так и эндоцитарному транспорту. Здесь описаны широко используемые подходы к изучению событий мембранного транспорта с использованием рецепторной киназы ERL1, локализованной на плазматической мембране. Подходы включают подготовку растительного материала, фармакологическую обработку и настройку конфокальной визуализации. Для мониторинга пространственно-временной регуляции ERL1 в данном исследовании описывается анализ колокализации между ERL1 и мультивезикулярным белком-маркером тельца, RFP-Ara7, анализ временных рядов этих двух белков и анализ z-стека ERL1-YFP, обработанного ингибиторами мембранного транспорта брефельдином А и вортманнином.

Введение

Мембранный трафик представляет собой консервативный клеточный процесс, при котором компоненты мембраны (также известные как грузы), включая белки, липиды и другие биологические продукты, распределяются между различными органеллами внутри эукариотической клетки или через плазматическую мембрану во внеклеточноепространство и из него. Этому процессу способствует совокупность мембран и органелл, называемая эндомембранной системой, которая состоит из ядерной мембраны, эндоплазматического ретикулума, аппарата Гольджи, вакуоли/лизосом, плазматической мембраны и множественных эндосом1. Эндомембранная система позволяет модифициро....

протокол

1. Приготовление растворов

  1. Приготовьте раствор для стерилизации семян, смешав 15 мл отбеливателя с 35 мл дистиллированной воды и 50 мкл Triton X-100.
  2. Приготовьте раствор брефельдина А (БФА), растворив порошок БЖК в этаноле до конечной концентрации 10 мМ (исходное сырье). Приготовьте раствор вортманнина (Wm), растворив порошок Wm в DMSO до конечной концентрации 10 мМ (запас).

2. Посев семян

  1. Аликвотируют 10-50 семян от каждого из необходимых трансгенных растений в пробирки микроцентрифуги объемом 1,5 мл. Добавьте 1 мл раствора для стерилизации семян в каждую пробирку и тщат....

Результаты

Предыдущее исследование показало, что ERL1 является активной рецепторной киназой, которая претерпевает динамические события мембранного транспорта20. ERL1 представляет собой трансмембранную LRR-рецепторную киназу на плазматической мембране. Вновь синтезированный ERL1 в эндопл.......

Обсуждение

Эндомембранная система разделяет цитоплазму эукариотической клетки на различные компартменты, что обеспечивает специализированную биологическую функцию этих органелл. Чтобы доставить белки и макромолекулы груза в конечный пункт назначения в нужное время, многочисленные везикулы п.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Эта работа была поддержана Национальным научным фондом (IOS-2217757) (X.Q.) и Университетом медицинских наук Арканзаса (UAMS) Bronson Foundation Award (H.Z.).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 mL syringesVWRBD309695Vacuum samples
Brefeldin A (BFA)SigmaB7651membrane trafficking drug
Confocal MicroscopeLeicaLecia SP8 TCS with LAS-X software packageImaging
Dissecting ForcepsVWR82027-402Genetic cross
FijiNIHhttps://imagej.net/FijiImage processing
Leica LAS AF softwareLeicahttp://www.leica-microsystems.comImage processing
transgenic seeds of ERL1-YFPQi, X. et al. The manifold actions of signaling peptides on subcellular dynamics of a receptor specify stomatal cell fate. Elife. 9, doi:10.7554/eLife.58097, (2020).
transgenic seeds of RFP-Ara7Ebine, K. et al. A membrane trafficking pathway regulated by the plant-specific RAB GTPase ARA6. Nat Cell Biol. 13 (7), 853-859, doi:10.1038/ncb2270, (2011).
Wortmannin (Wm)SigmaW1628membrane trafficking drug

Ссылки

  1. Aniento, F., Sanchez de Medina Hernandez, V., Dagdas, Y., Rojas-Pierce, M., Russinova, E. Molecular mechanisms of endomembrane trafficking in plants. Plant Cell. 34 (1), 146-173 (2022).
  2. Sigismund, S., et al. Endocytosis a....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

195

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены