Псевдоостровковая система человека для синхронной оценки динамики флуоресцентных биосенсоров и секреторных профилей гормонов

Резюме

В этом протоколе описан метод синхронного сбора и совместной регистрации внутриклеточных сигнальных событий и секреции инсулина и глюкагона первичными псевдоостровками человека с использованием аденовирусной доставки циклического биосенсора аденозинмонофосфата (цАМФ), детектора разности цАМФ in situ (cADDis) и микроперифузионной системы.

Аннотация

Островки поджелудочной железы Лангерганса, представляющие собой небольшие 3D-скопления специализированных эндокринных и поддерживающих клеток, разбросанных по всей поджелудочной железе, играют центральную роль в контроле гомеостаза глюкозы через секрецию инсулина бета-клетками, что снижает уровень глюкозы в крови, и глюкагона альфа-клетками, что повышает уровень глюкозы в крови. Внутриклеточные сигнальные пути, в том числе опосредованные цАМФ, являются ключевыми для регулируемой секреции альфа- и бета-клеточных гормонов. Трехмерная структура островков, хотя и имеет важное значение для скоординированной функции островков, представляет собой экспериментальную проблему для механистических исследований внутриклеточных сигнальных путей в первичных островковых клетках человека. Для преодоления этих проблем и ограничений в данном протоколе описывается интегрированная визуализация живых клеток и микрофлюидная платформа с использованием первичных псевдоостровков человека, полученных от доноров без диабета, которые по своей морфологии, составу и функциям напоминают нативные островки. Размер этих псевдоостровков контролируется с помощью процесса диспергирования и реагрегации первичных островковых клеток человека. В дисперсном состоянии можно манипулировать экспрессией генов островковых клеток; Например, могут быть введены такие биосенсоры, как генетически кодируемый биосенсор цАМФ, cADDis. После образования псевдоостровки, экспрессирующие генетически кодируемый биосенсор, в сочетании с конфокальной микроскопией и микроперифузионной платформой позволяют синхронно оценивать динамику флуоресцентных биосенсоров и секреторные профили альфа- и бета-клеточных гормонов, чтобы обеспечить более глубокое понимание клеточных процессов и функций.

Введение

Островки Лангерганса – это мини-органы, разбросанные по всей поджелудочной железе, функция которых имеет решающее значение для поддержания гомеостаза глюкозы. Инсулин секретируется из бета-клеток вслед за метаболизмом глюкозы, увеличением соотношения АТФ/АДФ, закрытием АТФ-чувствительных калиевых каналов, деполяризацией плазматической мембраны и притоком внеклеточного кальция¹. Секреция глюкагона альфа-клетками менее изучена, но было постулировано, что внутриклеточные и паракринные пути способствуют экзоцитозу глюкагоновых гранул ^2,3,4. Диабет 1 и 2 ти....

протокол

Островки человека (N = 4 препарата) были получены благодаря партнерству с Комплексной программой распределения островков, Программой анализа поджелудочной железы человека, Prodo Laboratories, Inc. и Imagine Pharma. Институциональный наблюдательный совет Университета Вандербильта не рассматривает обезличенные образцы поджелудочной железы человека в качестве исследования на людях. Эта работа была бы невозможна без доноров органов, их семей и организаций, занимающихся закупкой органов. Демографическая информация о донорах приведена в таблице 1 . Островки человека от доноров поджелудочной железы без диабета были выделены менее чем за 15 ч времени холодной....

Результаты

Псевдоостровки человека, экспрессирующие биосенсоры, были созданы путем аденовирусной доставки конструкций, кодирующих биосенсор цАМФ cADDis (рис. 1А). На рисунке 1B показана реагрегация трансдуцированных островковых клеток человека с течением времен.......

Обсуждение

Интеграция микроперифузионной системы, псевдоостровков, экспрессирующих биосенсоры, и лазерно-сканирующей конфокальной микроскопии позволяет синхронно оценивать внутриклеточные сигнальные события и динамические секреторные профили гормонов. Динамическая микроперифузионная сист.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ad-CMV-cADDis	Welgen	Not applicable
0.01” FEP tubing	IDEX	1527L
1 M HEPES	Gibco	15630-080	Enriched-CMRL Media Component
1.5 mL and conical tubes	Any	Any
10 μm PTFE filter	Cole-Parmer	SK-21940-41	Change every 8-10 runs
100 mM Sodium Pyruvate	Thermo Scientific	11360070	Enriched-CMRL Media Component
190 proof Ethanol	Decon labs	2816	Acid Ethanol Component
200 mM GlutaMAX-I Supplement	Gibco	35050061	Enriched-CMRL Media Component
Ascorbate	Sigma	A5960	DMEM Perifusion Buffer Component
Bovine Serum Albumin	Sigma	A7888	DMEM Perifusion Buffer Component
Bubble trap	Omnifit	006BT
CellCarrier ULA 96-well Microplates	Perkin Elmer	6055330
cellSens analysis software	Olympus	v3.1	Software used for data analysis
CMRL 1066	MediaTech	15-110-CV	Enriched-CMRL Media Component
Conical adapter (IDEX, P-794)	IDEX	P-794
D-(+)-Glucose	Sigma	G7528	Glucose Buffer Component
DMEM	Sigma	D5030	DMEM Perifusion Buffer Component
Environmental chamber	okolab	IX83
Epinepherine (Epi)	Sigma	E4250	Stimulation Buffer Component
Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Sigma	12306C	Enriched-CMRL Media Component
Glucagon ELISA	Mercodia	10-1281-01
Glucagon Kit HTRF	Cisbio	62CGLPEH
HCl (12N)	Any	Any	Acid Ethanol Component
HEPES	Sigma	H7523	DMEM Perifusion Buffer Component
iCell Endothelial Cells Medium Supplement	Cell Dynamics	M1019	iEC Media Component
Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24	Cole-Parmer	EW-00414-LW
Insulin ELISA	Mercodia	10-1113-01
Isobutylmethylonine (IBMX)	Sigma	I5879	Stimulation Buffer Component
Laser scanning confocal microscope	Olympus	FV3000
L-Glutamine	Sigma	G8540	DMEM Perifusion Buffer Component
Microchip (University of Miami, FP-3W)	University of Miami	FP-3W
Microchip holder	Micronit Microfluidics	FC_PRO_CH4525
Model 2110 Fraction Collector	Biorad	7318122
P10, P200, and P1000 pipets and tips	Any	Any
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140-122	Enriched-CMRL Media Component
Peristaltic pump	Instech	P720
Phosphate Buffered Saline	Gibco	14190-144	Wash Islets
Sarstedt dishes	Sarstedt	depends on dish diameter
Sodium Bicarbonate	Sigma	S6014	DMEM Perifusion Buffer Component
Sodium Pyruvate	Sigma	P2256	DMEM Perifusion Buffer Component
Stereoscope	Olympus	SZX12
Steriflip Filter (0.22 μm)	Millipore	SCGP00525	Filter all buffers twice
VascuLife VEGF Medium Complete Kit	LifeLine Cell Technology	LL-0003	iEC Media Component