Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает, как реконструировать митохондриальные кристы для получения 3D-визуализации с высокой точностью, высоким разрешением и высокой пропускной способностью.

Аннотация

Понимание динамических особенностей ультраструктуры клеточных органелл, которая не только богата неизвестной информацией, но и сложна с трехмерной (3D) точки зрения, имеет решающее значение для механистических исследований. Электронная микроскопия (ЭМ) обеспечивает хорошую глубину изображения и позволяет реконструировать стеки изображений с высоким разрешением для исследования ультраструктурной морфологии клеточных органелл даже в нанометровом масштабе; Поэтому 3D-реконструкция приобретает все большее значение благодаря своим несравненным преимуществам. Сканирующая электронная микроскопия (СЭМ) представляет собой высокопроизводительную технологию получения изображений, которая позволяет реконструировать большие структуры в 3D из одной и той же интересующей области на последовательных срезах. Поэтому применение СЭМ в крупномасштабной 3D-реконструкции для восстановления истинной 3D-ультраструктуры органелл становится все более распространенным. В этом протоколе мы предлагаем комбинацию серийных ультратонких срезов и методов 3D-реконструкции для изучения митохондриальных крист в клетках рака поджелудочной железы. Подробная информация о том, как выполняются эти методы, описана в этом протоколе пошагово, включая метод осмий-тиокарбогидразид-осмий (OTO), последовательную визуализацию ультратонких срезов и дисплей визуализации.

Введение

Митохондрии являются одними из самых важных органелл в клетке. Они служат центральным узлом клеточной биоэнергетики и метаболизма 1,2 и играют важнейшую роль в развитии рака3. Рак поджелудочной железы (РПЖ) является одним из самых трудно поддающихся лечению онкологических заболеванийиз-за его быстрого распространения и высокого уровня смертности. Митохондриальная дисфункция, которая в основном вызвана изменениями в морфологии митохондрий 3,5,6,7, связана с ме....

протокол

1. Подготовка материала

  1. Культивируют 2 x 106 клеток Panc02 в 12 мл среды DMEM (10% фетальной бычьей сыворотки и 100 ЕД/мл пенициллина-стрептомицина) и выдерживают при 37 °C и влажности 95% в атмосфере 5% углекислого газа и 95% воздуха в течение 48 ч.
  2. Соберите клетки Panc02, центрифугируйте при 28 x g в течение 2 мин, а затем выбросьте надосадочную жидкость. Убедитесь, что образец имеет соответствующий размер (1 x 107 клеток), так как в противном случае следующие этапы фиксации и обезвоживания не будут работать.
  3. Добавьте 1 мл 2,5% глутарового альдегида в качестве фиксатора для фиксации свежих....

Результаты

При культивировании клеток (рис. 1А) мы сначала разделили клетки рака поджелудочной железы на контрольную группу, культивируемую с использованием полной питательной среды, группу (1S,3R)-RSL348 (RSL3, активатор ферроптоза, 100 нМ) и группу RSL3 (100 нМ) плюс ферростатин-1

Обсуждение

Представленный здесь метод представляет собой полезное пошаговое руководство по применению техники 3D-реконструкции, которая включает в себя применение технологии электронной микроскопии и обработки изображений для укладки и сегментации 2D-томографических изображений, полученных из.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

Исследование выполнено при поддержке грантов Фонда естественных наук провинции Чжэцзян (Z23H290001, LY19H280001); гранты Национального фонда естественных наук Китая (82274364, 81673607 и 81774011); а также Исследовательский проект общественного благосостояния Научно-технического гранта Хучжоу (2021GY49, 2018GZ24). Мы ценим большую помощь, техническую поддержку и экспериментальную поддержку со стороны Общественной платформы Медицинского исследовательского центра Академии китайских медицинских наук, Чжэцзянского китайского медицинского университета.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
(1S,3R)-RSL3MCEHY-100218A
AcetoneSIGMA179124
AmiraVisage Imaging
Aspartic acidMCEHY-42068
Dulbecco's modified Eagle’s mediumGibco11995115
EthanolMerck100983
Ferrostatin-1MCEHY-100579
Fetal bovine serumGibco10437010
Field emission scanning electron microscopeHITACHISU8010
GlutaraldehydeAlfa AesarA10500.22
Lead nitrateSANTA CRUZsc-211724
Osmium TetroxideSANTA CRUZsc-206008B
Panc02European Collection of Authenticated Cell Cultures 98102213
Penicillin-streptomycinBiosharpBL505A
Phosphate Buffered SalineBiosharpBL302A
Pon 812 Epoxy resinSPI CHEMGS02660
Potassium ferrocyanideMacklinP816416
ThiocarbohydrazideMerck223220
UltramicrotomeLEICAEMUC7
Uranyl AcetateRHAWNR0329292020.2

Ссылки

  1. Gonidi, M., et al. Mitochondrial UCP4 and bcl-2 expression in imprints of breast carcinomas: Relationship with DNA ploidy and classical prognostic factors. Pathology, Research and Practice. 207 (6), 377-382 (2011).
  2. Youle, R. J., vander Bliek, A. M.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Cancer Research1963DSEMOTO

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены