Скрининг ионных каналов в раковых клетках

Резюме

Фармакологическое таргетирование ионных каналов является перспективным подходом к лечению солидных опухолей. Предоставлены подробные протоколы для характеристики функции ионных каналов в раковых клетках и анализа влияния модуляторов ионных каналов на жизнеспособность рака.

Аннотация

Ионные каналы имеют решающее значение для развития клеток и поддержания клеточного гомеостаза. Нарушение функции ионных каналов способствует развитию широкого спектра расстройств или каналопатий. Раковые клетки используют ионные каналы, чтобы стимулировать свое собственное развитие, а также совершенствоваться как опухоль и ассимилироваться в микросреде, которая включает в себя различные нераковые клетки. Кроме того, повышение уровня факторов роста и гормонов в микроокружении опухоли может привести к усилению экспрессии ионных каналов, что способствует пролиферации и выживанию раковых клеток. Таким образом, фармакологическое воздействие на ионные каналы является потенциально перспективным подходом к лечению солидных злокачественных новообразований, включая первичный и метастатический рак головного мозга. Описаны протоколы характеристики функции ионных каналов в раковых клетках и подходы к анализу модуляторов ионных каналов для определения их влияния на жизнеспособность рака. К ним относятся окрашивание клетки (клеток) на ионный канал (каналы), тестирование поляризованного состояния митохондрий, установление функции ионных каналов с помощью электрофизиологии и проведение анализа жизнеспособности для оценки эффективности препарата.

Введение

Мембранные транспортные белки имеют решающее значение для коммуникации между клетками, а также для поддержания клеточного гомеостаза. Среди мембранных транспортных белков ионные каналы служат для стимулирования роста и развития клеток, а также для поддержания состояния клеток в сложных и изменяющихся условиях. Кроме того, сообщалось, что ионные каналы стимулируют и поддерживают развитие солидных опухолей как системно, так и в центральной нервной системе (ЦНС)^1,2. Например, каналы KCa3.1 отвечают за регулирование мембранного потенциала и контроль объема клеток, что важно для регуляции клеточного цикла. Сообщало....

протокол

1. Иммуномечение ионных каналов в культивируемых клетках

1. Подготовка клеток и экспериментальная установка
   1. Поддерживают клетки как активно растущую культуру в культуральных колбах по 75^см2 . Проходите клетки один раз, пока они не станут сливающимися на 50%-90%, в зависимости от времени удвоения используемой клеточной линии.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании использовались клетки D283, клеточная линия медуллобластомы 3-й группы.
   2. Соберите клетки из колбы для культивирования в центрифужную пробирку (15 мл или 50 мл) и добавьте 2 мл 0,25% трипсина-ЭДТА, чтобы отделить адгезивные клетки. Выдерживать 5 мин при комнатной температуре....

Результаты

Выше приведены некоторые процедуры, которые могут быть использованы для характеристики ионных каналов в раковых клетках. В первом протоколе особое внимание уделяется окрашиванию ионного канала. Как уже говорилось, при окрашивании ионного канала или, если уж на то пошло, любого белка, п.......

Обсуждение

Изменения в функционировании ионных каналов изменяют внутриклеточные сигнальные каскады, которые могут влиять на общее функционирование клетки. За последнее десятилетие стало все более очевидным, что ионные каналы играют важную роль в росте и метастазировании раковых клеток. Важно о.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABS SpectraMax Plate Reader	Molecular Devices	ABS
Accutase	Invitrogen	00-4555-56
Alexa Flor 488	Invitrogen	A32723	Goat Anti-Rabbit
Antibiotic-Antimycotic	Gibco	15240-062	100x
B27 Supplement	Gibco	12587-010	Lacks vitamin A
Biosafety Cabinet	LABCONCO	302381101	Class II, Type A2
Bovine Serum Albumin	Fisher Scientific	BP1606-100
CO2 Incubator	Fisher Scientific	13-998-211	Heracell VIOS 160i
Calcium Chloride	Fisher Scientific	C7902	Dihydrate
Cell Culture Dishes, 150 mm	Fisher Scientific	12-600-004	Cell culture treated
Cell Culture Flasks, 75 cm2	Fisher Scientific	430641U	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 6 well	Fisher Scientific	353046	Cell culture treated
Cell Culture Plates, 96 well	Fisher Scientific	353072	Cell culture treated
Centrifuge	Eppendorf	EP-5804R	Refrigerated
Corning CoolCell	Fisher Scientific	07-210-0006
Coverslips, 22 x 22 mm	Fisher Scientific	12-553-450	Corning brand
D283 Med	ATCC	HTB-185
DABCO Mounting Media	EMS	17989-97
D-Glucose	Sigma Life Sciences	D9434
Dimethyl Sulfoxide	Sigma Aldrich	D2650	Cell culture grade
DMEM/F12, base media	Fisher Scientific	11330-032	With phenol red
DMEM/F12, phenol red free	Fisher Scientific	21041-025
EGTA	Sigma Aldrich	E4378
Epidermal Growth Factor	STEMCELL	78006.1
FCCP	Abcam	AB120081
Fetal Bovine Serum, Qualified	Gibco	10437-028
Fibroblast Growth Factor, Basic	Millipore	GF003
GARBA5 Antibody	Aviva	ARP30687_P050	Rabbit Polyclonal
Glutamax	Gibco	35050-061
Glycerol Mounting Medium	EMS	17989-60	With DAPI+DABCO
Hemocytometer	Millipore Sigma
Heparin	STEMCELL	7980
HEPES	HyClone	SH3023701	Solution
HEPES	Fisher Scientific	BP310-500	Solid
ImageJ	Open platform		With Fiji plugins
Immuno Mount DAPI	EMS	17989-97
KRM-II-08			experimental compounds not available from a commercial source
Leica Application Suite X	Leica Microsystems
Leukemia Inhibitory Factor	Novus	N276314100U
L-Glutamine	Gibco	25030-081
Magnesium Chloride	Sigma Aldrich	M9272	Hexahydrate
Microscope, Confocal	Leica	SP8
Microscope, Light	VWR	76382-982	DMiL Inverted
MTS - Promega One Step	Promega	G3581
Multi-channel pipette, 0.5-10 µL	Eppendorf	Z683914
Multi-channel pipette, 10-100 µL	Eppendorf	Z683930
Multi-channel pipette, 30-300 µL	Eppendorf	Z683957
Nest-O-Patch	Heka
Neurobasal-A Medium	Gibco	10888022	Without vitamin A
Neurobasal-A Medium	Gibco	12348-017	Phenol red free
Non-Essential Amino Acids	Gibco	11140-050
NOR-QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Parafilm	Fisher Scientific	50-998-944	4 inch width
Paraformaldehyde	EMS	RT-15710
PATHCHMASTER	Heka
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140-122
Perfusion System	Nanion	4000120
PFA	EMS	RT-15710
Phosphate Bufered Saline	Fisher Scientific	AAJ75889K2	Reagent grade
Poly-D-Lysine	Fisher Scientific	A3890401
Poly-L-Lysine	Sigma Life Sciences	P4707
Port-a-Patch	Nanion	21000072
Potassium Chloride	Sigma Life Sciences	P5405
Primary Antibody	Invitrogen	MA5-34653	Rabbit Monoclonal
Prism	GraphPad
Propofol	Fisher Scientific	NC0758676	1 mL ampule
QH-II-66			experimental compounds not available from a commercial source
Reagent Reservoirs	VWR	89094-664	Sterile
Slides, 75 x 25 mm	Fisher Scientific	12-544-7	Frosted one side
Sodium Bicarbonate	Corning	25-035-Cl
Sodium Chloride	Fisher Scientific	S271-3
Sodium Pyruvate	Gibco	11360-070
Synth-a-Freeze Medium	Gibco	R00550	Cryopreservation
TMRE	Fisher Scientific	50-196-4741	Reagent
TMRE Kit	Abcam	AB113852	Kit
Triton X-100	Sigma Aldrich	NC0704309
Trypan Blue	Gibco	15-250-061	Solution, 0.4%
Trypsin/EDTA	Gibco	25200-072	Solution, 0.25%
Vortex Mixer	VWR	97043-562
Whatman Filter Paper	Fisher Scientific	09-927-841