Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Митохондриальные контактные сайты представляют собой белковые комплексы, которые взаимодействуют с митохондриальными внутренними и внешними мембранными белками. Эти участки необходимы для связи между митохондриальными мембранами и, таким образом, между цитозолем и митохондриальным матриксом. В этой статье мы опишем метод выявления кандидатов, подходящих для этого конкретного класса белков.

Аннотация

Митохондрии присутствуют практически во всех эукариотических клетках и выполняют важнейшие функции, выходящие далеко за рамки производства энергии, например, синтез железо-серных кластеров, липидов или белков, буферизациюCa2+ и индукцию апоптоза. Кроме того, митохондриальная дисфункция приводит к тяжелым заболеваниям человека, таким как рак, диабет и нейродегенерация. Для того, чтобы выполнять эти функции, митохондрии должны взаимодействовать с остальной частью клетки через свою оболочку, состоящую из двух мембран. Поэтому эти две мембраны должны постоянно взаимодействовать. Белковые контактные участки между внутренней и внешней мембранами митохондрий имеют важное значение в этом отношении. На данный момент выявлено несколько мест контакта. В описанном здесь методе митохондрии Saccharomyces cerevisiae используются для выделения контактных сайтов и, таким образом, идентификации кандидатов, которые квалифицируются для белков контактных сайтов. Мы использовали этот метод для идентификации митохондриального контактного сайта и комплекса организующей системы cristae (MICOS), одного из основных контактных сайтов-образующих комплексов во внутренней мембране митохондрий, который сохраняется от дрожжей до человека. Недавно мы усовершенствовали этот метод, чтобы идентифицировать новый контактный сайт, состоящий из Cqd1 и комплекса Por1-Om14.

Введение

Митохондрии выполняют множество различных функций у эукариот, наиболее известной из которых является производство АТФ путем окислительного фосфорилирования. Другие функции включают производство железо-серных кластеров, синтез липидов, а у высших эукариот — передачу сигналов Ca2+ и индукцию апоптоза 1,2,3,4. Эти функции неразрывно связаны с их сложной ультраструктурой.

Митохондриальная ультраструктура была впервые описана с помощью электронной микроскопии5. Показано, что митохондр....

протокол

1. Буферы и складские растворы

  1. Раствор 1 М 3-морфолинопропан-1-сульфоновой кислоты (MOPS) в деионизированной воде, рН 7,4. Хранить при температуре 4 °C.
  2. Приготовьте 500 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) в деионизированной воде, рН 8,0. Хранить при комнатной температуре.
  3. Приготовьте 2,4 М сорбита в деионизированной воде. После автоклавирования хранить при комнатной температуре.
  4. Приготовьте 2,5 М сахарозы в деионизированной воде. После автоклавирования хранить при комнатной температуре.
  5. Приготовьте 200 мМ фенилметилсульфонилфторида (ФМСФ) в изопропаноле. Хранить при температуре −20 °C.
    ВНИМА....

Результаты

Относительно легко разделить внутреннюю и внешнюю мембраны митохондрий. Однако генерация и разделение пузырьков, содержащих контактный сайт, значительно сложнее. На наш взгляд, важными и важными являются два этапа: условия ультразвуковой обработки и используемый градиент.

Обсуждение

Митохондриальное субфракционирование представляет собой сложный эксперимент с несколькими очень сложными этапами. Поэтому мы стремились к дальнейшему совершенствованию и, в определенной степени, к упрощению нашего устоявшегося метода32. Здесь сложность заключалась в то.......

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Благодарности

M.E.H. выражает благодарность Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG), проект номер 413985647, за финансовую поддержку. Авторы благодарят д-ра Михаэля Киблера, Университет Людвига-Максимилиана, Мюнхен, за его щедрую и всестороннюю поддержку. Мы благодарны Вальтеру Нойперту за его научный вклад, полезные дискуссии и постоянное вдохновение. Й.Ф. благодарит Высшую школу наук о жизни в Мюнхене (LSM) за поддержку.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
13.2 mL, Open-Top Thinwall Ultra-Clear Tube, 14 x 89mmBeckman Instruments, Germany344059
50 mL, Open-Top Thickwall Polycarbonate Open-Top Tube, 29 x 104mmBeckman Instruments, Germany363647
A-25.50 Fixed-Angle Rotor- Aluminum, 8 x 50 mL, 25,000 rpm, 75,600 x gBeckman Instruments, Germany363055
Abbe refractometerZeiss, Germanydiscontinued,
any pipet controller will suffice
accu-jet pro Pipet ControllerBrandtech, USABR26320discontinued,
any pipet controller will suffice
Beaker 1000 mLDWK Life Science, GermanyC118.1
Branson  Digital Sonifier W-250 DBranson Ultrasonics, USAFIS15-338-125
Branson Ultrasonic 3mm TAPERED MICROTIPBranson Ultrasonics, USA101-148-062
Branson Ultrasonics 200- and 400-Watt Sonifiers: Rosette Cooling CellBranson Ultrasonics, USA15-338-70
Centrifuge Avanti JXN-26Beckman Instruments, GermanyB37912
Centrifuge Optima XPN-100 ultraBeckman Instruments, Germany8043-30-0031
cOmplete Proteaseinhibtor-CocktailRoche, Switzerland11697498001
D-SorbitRoth, Germany6213
EDTA (Ethylendiamin-tetraacetic acid disodium salt dihydrate)Roth, Germany8043
Erlenmeyer flask, 100 mLRoth, GermanyX747.1
graduated pipette, Kl. B, 25:0, 0.1Hirschmann, Germany1180170
graduated pipette, Kl. B, 5:0, 0.05Hirschmann, Germany1180153
ice bathneoLab, Germany S12651
Magnetic stirrer RCT basicIKA-Werke GmbH, GermanyZ645060GB-1EA
MOPS (3-(N-Morpholino)propanesulphonic acid)Gerbu, Germany1081
MyPipetman Select P1000Gilson, USAFP10006S
MyPipetman Select P20Gilson, USAFP10003S
MyPipetman Select P200Gilson, USAFP10005S
Omnifix 1 mLBraun, Germany4022495251879
Phenylmethylsulfonyl fluoride (PMSF)Serva, Germany32395.03
STERICAN cannula 21 Gx4 4/5 0.8x120 mmBraun, Germany4022495052414
stirring bar, 15 mmVWR, USA442-0366
SucroseMerck, GermanyS8501
SW 41 Ti Swinging-Bucket RotorBeckman Instruments, Germany331362
Test tubesEppendorf, Germany3810X
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL glass vesselVWR, USA432-0200
Tissue grinders, Potter-Elvehjem type, 2 mL plunger with serrated tipVWR, USA432-0212
Trichloroacetic acid (TCA)Sigma Aldrich, Germany33731discontinued,
any TCA will suffice (CAS: 73-03-9)
TRISRoth, Germany4855

Ссылки

  1. Braymer, J. J., Freibert, S. A., Rakwalska-bange, M., Lill, R. BBA - Molecular Cell Research Mechanistic concepts of iron-sulfur protein biogenesis in Biology * General concepts of FeS protein biogenesis. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research. 1868 (1), 118863 (2021).
  2. Osman, C., Merkwirth, C., Langer, T.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

Ca2Saccharomyces cerevisiaeCristae MICOSCqd1 1 14

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены