Анализ микроколониеобразующих единиц для оценки эффективности вакцин против туберкулеза

Резюме

Определение колониеобразующих единиц (КОЕ) является золотым стандартом для количественного определения бактерий, включая Mycobacterium tuberculosis , для формирования видимых колоний которых могут потребоваться недели. В этой статье мы опишем микро-КОЕ для определения КОЕ с повышенной эффективностью по времени, уменьшенным пространством лаборатории и стоимостью реагентов, а также масштабируемостью для экспериментов со средней и высокой пропускной способностью.

Аннотация

В 2022 г. от туберкулеза (ТБ), основной причины смерти от инфекционного агента во всем мире, умерло 1,6 миллиона человек, уступив только COVID-19 во время пандемии 2019-2021 гг. Заболевание вызывается бактерией Mycobacterium tuberculosis (M.tb). Штамм Mycobacterium bovis Bacillus Calmette-Guérin (BCG), единственная противотуберкулезная вакцина, является старейшей лицензированной вакциной в мире, которая используется до сих пор. В настоящее время 12 вакцин проходят клинические испытания и десятки вакцин находятся на стадии доклинической разработки. Методом выбора для оценки эффективности противотуберкулезных вакцин в доклинических исследованиях является подсчет бактериальных колоний с помощью анализа колониеобразующих единиц (КОЕ). Этот трудоемкий анализ занимает от 4 до 6 недель, требует значительного пространства в лаборатории и инкубаторе, имеет высокую стоимость реагентов и подвержен загрязнению. В этой статье мы опишем оптимизированный метод переписи колоний, микро-КОЕ (мКОЕ), который предлагает простое и быстрое решение для анализа результатов анализа эффективности вакцины против туберкулеза . Анализ на мКОЕ требует в десять раз меньше реагентов, сокращает инкубационный период в три раза, занимая от 1 до 2 недель, сокращает лабораторные площади и стоимость реагентов, а также сводит к минимуму риски для здоровья и безопасности, связанные с работой с большим количеством M.tb. Кроме того, для оценки эффективности противотуберкулезной вакцины могут быть получены образцы из различных источников, включая ткани вакцинированных животных, инфицированных микобактериями. Описан оптимизированный метод получения одноклеточной, однородной и высококачественной культуры микобактерий для изучения инфекций. Наконец, мы предлагаем повсеместно использовать эти методы для доклинических исследований по определению эффективности вакцин, что в конечном итоге приведет к сокращению сроков разработки вакцин против туберкулеза.

Введение

Туберкулез (ТБ) является основной причиной смерти во всем мире от одного инфекционного агента, бактерии Mycobacterium tuberculosis (M.tb), убивающей больше людей, чем любой другой патоген. В 2021 г. туберкулез стал причиной 1,6 миллиона случаев смерти, а во^{время пандемии} 2019–2021 гг. его превзошел COVID-191. Более того, согласно глобальному докладу Всемирной организации здравоохранения о туберкулезе за 2022 год, пандемия COVID-19 привела к росту числа новых случаев заболевания туберкулезом. ВОЗ также сообщает о значительном снижении числа людей, у которых диагностирован туберкулез в течение этого периода, что может привести к....

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол, описанный здесь, предназначен для БЦЖ, но может быть применен к любым микобактериям. БЦЖ может быть использована в качестве суррогатной бактерии для экспериментов по борьбе с туберкулезом, когда средства BSL3 недоступны²². Следующие процедуры с использованием БЦЖ должны выполняться в лаборатории уровня биобезопасности 2 (BSL2) и в соответствии с соответствующими рекомендациями по биобезопасности и надлежащей лабораторной практикой для манипуляций с микроорганизмами 2-й группы опасности.

1. Приготовление питательных сред

1. Приготовьте бульон Middlebrook 7H9 с добавлением ....

Результаты

Описанный здесь анализ мКОЕ увеличивает объем информации, которую можно получить из одной чашки Петри, по крайней мере, в 96 раз. На рисунке 5 показано сравнение двух методов доставки лекарственного средства для перепрофилированного использования саквинавира (SQV)

Обсуждение

Туберкулез является серьезной проблемой общественного здравоохранения, приобретающей все большее значение, особенно в странах с низким и средним уровнем дохода. Перебои в работе медицинских учреждений по диагностике и лечению туберкулеза во время пандемии COVID-19 оказали негативное вл.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plates	VWR	734-2781
DSLR 15-55 mm lens	Nikon	AF-P DX NIKKOR 18-55mm f/3.5-5.6G VR
DSLR camera	Nikon	D3400
DSLR macro lens	Sigma	MACRO 105mm F2.8 EX DG OS HSM
Fetal calf serum	Gibco	10270106
Fiji Software		https://fiji.sc/	Fiji is an open-source software supported by several laboratories, institutions, and individuals. All the required plugins are included.
Igepal CA-630	Sigma-Aldrich	18896
L-glutamine	Gibco	25030-081
Middlebrook 7H10	BD	262710
Middlebrook 7H9	BD	271310
Multichannel pipette (0.5 - 10 µl)	Gilson	FA10013
Multichannel pipette (20 - 200 µl)	Gilson	FA10011
Mycobacterium bovis BCG	American Type Culture Collection	ATCC35734	strain TMC 1011 [BCG Pasteur]
OADC enrichment	BD	211886
Phosphate buffered saline (PBS)	NZYTech	MB25201
RPMI 1640 medium	Gibco	21875091
Sodium pyruvate	Gibco	11360-070
Spectrophotometer UV-6300PC	VWR	634-6041
Square Petri dish 120 x 120 mm	Corning	BP124-05
Tyloxapol	Sigma-Aldrich	T8761
Ultrasound bath Elma P 30 H	VWR	142-0051