JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Здесь мы представляем протоколы работы с DSM20016 Limosilactobacillus reuteri , подробно описывающие рост, трансформацию плазмиды, ПЦР колоний, измерение флуоресцентного репортерного белка и ограниченную мини-подготовку плазмиды, а также распространенные проблемы и устранение неполадок. Эти протоколы позволяют измерять репортерные белки в DSM20016 или подтверждать с помощью колонии ПЦР, если репортер не участвует.

Аннотация

Lactobacillus были невероятно большим, разнообразным родом бактерий, включающим 261 вид, некоторые из которых были комменсальными штаммами с потенциалом для использования в качестве шасси для синтетических биологических исследований в желудочно-кишечном тракте. Широкая фенотипическая и генотипическая изменчивость, наблюдаемая в пределах рода, привела к недавней реклассификации и введению 23 новых родов.

Из-за широты вариаций в старых родах протоколы, продемонстрированные в одном члене, могут не работать так, как рекламируется с другими членами. Отсутствие централизованной информации о том, как именно манипулировать конкретными штаммами, привело к появлению ряда специальных подходов, часто адаптированных из других семейств бактерий. Это может усложнить ситуацию для исследователей, начинающих работать в этой области, которые могут не знать, какая информация относится или не относится к выбранному ими штамму.

В этой статье мы стремимся централизовать набор протоколов с продемонстрированным успехом, в частности, в обозначении штамма Limosilactobacillus reuteri F275 (другие коллекционные номера: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), а также советы по устранению неполадок и общие проблемы, с которыми можно столкнуться. Эти протоколы должны позволить исследователю, практически не имеющему опыта работы с L. reuteri , DSM20016 трансформировать плазмиду, подтверждать трансформацию и измерять обратную связь системы в считывателе планшетов с помощью репортерного белка.

Введение

Род Lactobacillus исторически классифицировался как грамположительные, палочковидные, неспорообразующие, факультативные анаэробы или микроаэрофилы, которые расщепляют сахара с образованием молочной кислоты1. Эти свободные критерии привели к тому, что Lactobacillus фенотипически и генотипически является чрезвычайно разнообразным родом. Эта широкая категоризация привела к тому, что род был реклассифицирован, и в 2020 году было введено 23 новых рода2.

Старый, более широкий род включал основные комменсальные и пробиотические виды, которые обычно считаются безопасными (GRAS) для потребления3. Семейство Lactobacillaceae поддерживает общественное восприятие как «хороших бактерий» из-за многих сообщений о пользе для здоровья, получаемой за счет потребления различных штаммов4,5,6,7. Легкость, с которой они могут перемещаться по желудочно-кишечному тракту8, и их общественное признание в совокупности позиционируют штаммы Lactobacillaceae как сильных кандидатов в качестве организмов-шасси для приема внутрь в медицинских, терапевтических или диагностических целях.

Широкий спектр характеристик, присутствующих в семействе Lactobacillaceae , привел к ситуации, в которой де-факто нет штамма модельного организма; Исследовательские группы, как правило, отбирают виды со свойствами, наиболее соответствующими их конкретным целям. (Например, лаборатории молочной ферментации могут выбрать L. lactis; исследования ферментации овощей могут выбрать L. plantarum; исследования пробиотиков могут быть сосредоточены на L. acidophilus; и так далее.)

Этот же широкий диапазон характеристик у разных видов привел к накоплению протоколов и процедур, которые могут хорошо работать для одного подмножества семейства Lactobacillaceae , но требуют оптимизации для эффективной работы (или, возможно, для функционирования вообще) в других9. Эта потребность в оптимизации между членами семьи и даже внутри членов одного и того же вида может свести на нет усилия незнакомых исследователей. Протоколы, опубликованные в разделах статей, посвященных методам, могут также включать свои собственные модификации10, что приводит к фрагментированным, децентрализованным коллекциям протоколов.

L. reuteri считается широко распространенным комменсалом позвоночных, постоянно встречающимся в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) млекопитающих,11 птиц ирыб 12. Субштаммы L. reuteri часто генетически специализированы посредством адаптации белка адгезии слизи, чтобы более постоянно колонизировать конкретных местных хозяев 8,11,13. Виды Limosilactobacillus желудочно-кишечного тракта могут быть изолированы у хозяев за пределами их родного хозяина, но больше тяготеют к преходящему характеру8.

Из-за специализации человека и хозяина L. reuteri DSM20016 очень хорошо позиционирует себя в качестве шасси для диагностического или терапевтического применения в любой точке желудочно-кишечного тракта человека, и штамм DSM20016 может обеспечить более длительное окно эффекта для вмешательств по сравнению с более преходящими штаммами.

В этой статье мы описываем ряд протоколов с продемонстрированной эффективностью в отношении Limosilactobacillus reuteri (обозначение штамма: F275; другие коллекционные номера: DSM20016, ATCC23272, CIP109823), а также централизованную информацию о штамме из других источников, чтобы помочь в приложениях молекулярной и системной биологии. Процедуры, изложенные в настоящем документе, должны позволить исследователю, не имеющему предшествующего опыта, культивировать L. reuteri, создавать электрокомпетентные запасы, отбирать трансформированные колонии, подтверждать трансформацию с помощью колониальной полимеразной цепной реакции (ПЦР) и измерять сконструированный системный ответ с помощью флуоресцентных репортерных белков.

Мы отмечаем, что соответствующие протоколы охватывали рекомбинацию генома ssDNA с помощью CRISPR-Cas9 у L. reuteri (штамм: ATCC-PTA-6475)14 и редактирование генома с помощью никазы CRSIPR-Cas9 в нескольких не-L. reuteri, окрашивание семейства Lactobacillaceae 15,16; они, однако, не относятся к штамму L. reuteri DSM20016, на котором мы сосредоточены здесь.

протокол

1. Подготовка L. reuteri DSM20016 электрокомпетентных клеток

ПРИМЕЧАНИЕ: Это основано на протоколе Berthier et al.17 со скоростями центрифугирования, указанными Rattanachaikunsopon et al.18.

  1. В пробирке центрифуги объемом 50 мл инокулируют L. reuteri из запаса глицерина в 6 мл бульона deMan Rogosa Sharpe (MRS). Аэробная инкубация в течение ночи при 37 ° C в статическом инкубаторе.
  2. На следующее утро привите 4 мл ночной культуры в 200 мл бульона MRS (разведение 1:50).
  3. Разрешить аэробный рост в статическом инкубаторе с температурой 37 °C до тех пор, пока значение оптической плотности 600 нм (OD600) не достигнет 0,5-0,85; Это займет примерно 2-3 часа.
  4. Как только будет достигнуто адекватное значение OD600, сцедите среду в центрифужные пробирки объемом 50 мл и поместите на лед, балансируя пробирки.
  5. Центрифуга в течение 5 мин при 5 000 x g в предварительно охлажденной центрифуге с температурой 4 °C.
  6. Выбросьте надосадочную жидкость, ресуспендируйте каждую гранулу в 50 мл предварительно охлажденного (от 0 ° C до 4 ° C) ddH2O и снова центрифугу с теми же настройками, что и на предыдущем этапе. Держите клетки на льду как можно дольше.
  7. Повторите шаг 1.6.
  8. Ресуспендировать каждую гранулу в 25 мл ddH2O: 0,5 М сахарозы, 10% глицерина. Центрифуга при 5 000 x g при 4 °C в течение 10 мин. Выбросьте надосадочную жидкость и положите клетки обратно на лед.
  9. Ресуспендируют все гранулы в тех же 2 млddH2O: 0,5 М сахарозы, 10% глицерина.
  10. Аликвоту на порции от 50 мкл до 100 мкл в предварительно охлажденных микроцентрифужных пробирках; хранить при температуре -80 °C для последующего использования.

2. Электропорация L. reuteri

ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте пипетирования, насколько это возможно, на следующих шагах. Рекомендуется включить контрольную электропорацию без добавления плазмиды, чтобы обеспечить адекватный выбор антибиотиков.

  1. Возьмите целую электрокомпетентную аликвоту L. reuteri и разморозьте ее на льду.
  2. Аккуратно смешайте от 5 мкл до 10 мкл плазмиды (конечная концентрация плазмиды >6 нМ) с размороженной аликвотой, максимально избегая пипетирования.
  3. Переложите в охлажденную льдом электропорационную кювету с зазором 1 мм.
  4. Электропорат при напряжении 1,25 кВ, 400 Ω и 25 мкФ.
  5. Добавьте 1 мл бульона MRS комнатной температуры (RT) и перемешайте, перевернув кювету один или два раза.
  6. Поместите кюветы в статический инкубатор при температуре 37 °C на 2,5-3 часа, чтобы обеспечить восстановление.
  7. Нанесите все количество на несколько агаровых пластин MRS с соответствующим выбором.
  8. Поместите тарелки в полностью герметичный контейнер с небольшой зажженной свечой («чайным светом») и анаэробным пакетиком, создающим атмосферу.
  9. Выращивайте при 37 ° C в течение 2-3 дней или до появления видимых колоний.

3. Измерение кислотостойкого флуоресцентного репортерного белка mCherry2

  1. Выберите все колонии, необходимые для измерения, и инокулируйте в 96-луночную микропланшет для хранения 1,5 мл стерилизованного фильтром (неавтоклавированного) бульона MRS на лунку и соответствующего антибиотика.
  2. Аэробно инкубировать в течение 24 часов в течение ночи при 37 ° C без встряхивания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эта микропланшет для хранения должна храниться для использования в разделе 4 (колония ПЦР).
  3. L. reuteri выпадает в осадок из среды в стационарной фазе; Ресуспендировать ночную культуру с помощью пипетки.
  4. Перенесите 200 мкл в плоскую пластину с прозрачным дном и 96 лунками, перенесите пластину на считыватель пластин и измерьте OD и флуоресценцию mCherry2 (возбуждение [Ex]: 589 нм; излучение [Em]: 610 нм) или других соответствующих отчетов.

4. Подтверждение поглощения плазмид с помощью колониальной ПЦР

  1. Из 96-луночной накопительной микропланшетки из секции 3 перенесите 5 мкл в ПЦР-пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: По прошествии >5 минуты может потребоваться повторное суспендирование L. reuteri во второй раз.
  2. В портативной настольной микроцентрифуге вращайте до тех пор, пока гранула не станет видимой (примерно 2 минуты при 2,000 x g), выбросьте надосадочную жидкость и ресуспендируйте гранулу в 20 мкл 20 мМ NaOH.
  3. Кипятить при 95 °C в течение 5 минут, встряхивать, и повторить кипячение второй раз.
  4. Немедленно охладите образцы; постарайтесь как можно дольше держать образцы на льду на следующих этапах, чтобы снизить вероятность деградации шаблона и ингибирования ПЦР.
  5. Вращайте в переносной настольной микроцентрифуге при 2000 x g в течение 2 мин, пока клеточный мусор не будет гранулирован, затем возьмите 1 мкл надосадочной жидкости и разбавьте до 99 мкл ледяного DDH 2 O без ДНКазы и РНКазы (100-кратное разведение).
  6. Используйте 100-кратное разведение в качестве матричной ДНК в стандартной реакции ПЦР с использованием плазмид-специфических праймеров. Включите положительный контроль с плазмидой, полученной из мини-препарата E. coli.
  7. Верните образцы на лед и добавьте соответствующий загрузочный краситель в концентрации 1x.
  8. Запускайте в 1% агарозном геле в буфере TAE (трис-ацетат-этилендиаминтетрауксусная кислота [ЭДТА]) при 110 В в течение 30 мин. Изображение при необходимости.

5. Протокол мини-подготовки для L. reuteri с последующей ПЦР для подтверждения наличия плазмиды

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол предназначен для использования с набором для мини-подготовки, указанным в таблице материалов.

  1. Инокулируют L. reuteri в 10 мл бульона MRS, содержащего соответствующий антибиотик, и инкубируют в течение ночи аэробно при 37 ° C в статическом инкубаторе.
  2. Центрифуга при 5 000 x g в течение 10 мин в предварительно охлажденной центрифуге с температурой 4 °C.
  3. Промойте гранулы в 2 мл стандартного буфера P1 (входит в комплект), чтобы свести на нет кислотность, которая может помешать более поздним этапам, центрифугу с той же настройкой, что и описано ранее, и выбросьте надосадочную жидкость.
  4. Ресуспендируют гранулу в 250 мкл модифицированного буфера P1, содержащего 10 мг/мл лизоцима и 100 ЕД/мл мутанолизина, для лизиса бактериальных клеток. Выдерживать 1-2 ч при 37 °C.
  5. Добавьте 250 мкл буфера P2, перемешайте, перевернув четыре-шесть раз, и инкубируйте при RT не более 5 минут.
  6. Добавьте 350 мкл буфера N3 (входит в комплект) и сразу же аккуратно переверните четыре-шесть раз, чтобы перемешать.
  7. Центрифуга в дозе 10 000 x g в течение 10 мин.
  8. Перенесите как можно больше надосадочной жидкости в спиновую колонну и центрифугу при 10 000 x g в течение 60 с. Откажитесь от потока.
  9. Промыть отжимную колонну 500 мкл буферного PB (входит в комплект) и центрифугу при 10 000 x g в течение 60 с. Откажитесь от потока.
  10. Промыть отжимную колонну 750 мкл буферного полиэтилена (входит в комплект) и центрифугу при 10 000 x g в течение 60 с. Откажитесь от потока и центрифуги в течение 60 с, чтобы удалить остаточный буфер.
  11. Поместите спиновую колонку в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл. Нанесите 20-30 мклddH2Oбез ДНК и РНК на фильтр спиновой колонки и оставьте на 1-2 мин перед центрифугированием при 10 000 x g в течение 60 с.
  12. Проведите стандартную реакцию ПЦР с использованием плазмид-специфических праймеров (pTRKH3_pTUSeq_F: CACCCGTTCTCGGAGCA, pTRKH3_pTUSeq_R: CTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACA) с элюатом, обеспечивающим матричную ДНК. Включите положительный контроль с плазмидой, полученной из мини-препарата E. coli.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки ПЦР, используемые в этом исследовании: 98 °C в течение 5 мин (98 °C в течение 30 с, 55 °C в течение 30 с, 72 °C в течение 45 с) 30 циклов, 72 °C в течение 2 мин, 4 °C выдержка. Параметры сильно зависят от используемой полимеразы, длины фрагмента и точных праймеров, используемых любым человеком, использующим этот протокол.

Результаты

Эффективность трансформации
L. reuteri не требует dcm-/dam-неметилированной плазмиды, как это наблюдается для других Lactobacillaceae19,20 (см. рис. 1). Электропорация DSM20016 L. reuteri с 10 мкл плазмидного pTRKH3_mCherry2 размером 8,5 к?...

Обсуждение

Наиболее важным шагом для трансформации L. reuteri DSM20016 является создание анаэробных условий роста после нанесения покрытий на трансформацию; колонии, полученные в аэробных условиях, встречаются очень редко и, как правило, не растут при инокуляции в бульон MRS. Также следует практикова?...

Раскрытие информации

Конфликта интересов не существует.

Благодарности

Мы высоко ценим ценные советы, предоставленные профессором Й.. ван Пейкереном (Университет Висконсин-Мэдисон), чье руководство по работе с L. reuteri ATCC PTA 6475 послужило основой для описанных здесь методов.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1 kb Plus DNA LadderNEBN3200L
1mL Spectrophotometer cuvettesThomas Scientific1145J12
Agarose BioShopAGR001
Allegra X-15R (refrigerated centrifuge)Beckman Allegra N/ANo longer in production
AnaeroGen 2.5 L SachetThermo ScientificOXAN0025A
BTX, ECM 399 electroporation systemVWR58017-984
Centrifuge tubes (50 mL)FroggaBioTB50-500
DNA gel x6 loading dyeNEBB7024S
Electroporation cuvetteFisherbrandFB101
ErythromycinMillipore SigmaE5389-5G
Gel electroporation bath/dockVWR76314-748
Glycerol BioShopGLY001
Limosilactobacillus reuteriLeibniz Institute DSMZDSM20016Strain designation F275
LysozymeBioShopLYS702.5
Microcentrifuge tubes (1.7 mL)FroggaBioLMCT1.7B
Miniprep kit (Qiagen)Qiagen27106slpGFP replaced with constitutive, codon optimised, mCherry2 reporter protein 
MRS Broth (Dehydrated)Thermo ScientificCM0359B
MutanolysinMillipore SigmaM9901-5KU
NaOH Millipore Sigma1064691000
P100 PipetteEppendorf3123000047
P1000 PipetteEppendorf3123000063
P2.5 PipetteEppendorf3123000012
P20 PipetteEppendorf3123000039
P200 PipetteEppendorf3123000055
PCR tubesFroggaBioSTF-A120S
Personal benchtop microcentrifugeGenlantisE200100
Petri dishesVWR25384-088
PTC-150 Thermal CyclerMJ ResearchN/ANo longer in production
pTRKH3_slpGFP (modified)Addgene27168
SPECTRONIC 200 SpectrophotometerThermo Scientific840-281700
Storage microplateFisher Scientific14-222-225
SucroseBioShopSUC507
TAE Buffer 50xThermo ScientificB49
VortexVWR58816-121No longer in production
VWR 1500E incubatorVWRN/ANo longer in production

Ссылки

  1. Makarova, K., et al. Comparative genomics of the lactic acid bacteria. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15611-15616 (2006).
  2. Zheng, J., et al. A taxonomic note on the genus Lactobacillus: Description of 23 novel genera, emended description of the genus Lactobacillus beijerinck 1901, and union of Lactobacillaceae and Leuconostocaceae. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology. 70 (4), 2782-2858 (2020).
  3. Adams, M. R., Marteau, P. On the safety of lactic acid bacteria from food. International Journal of Food Microbiology. 27 (2-3), 263-264 (1995).
  4. Urbańska, M., Gieruszczak-Białek, D., Szajewska, H. Systematic review with meta-analysis: Lactobacillus reuteri DSM 17938 for diarrhoeal diseases in children. Alimentary Pharmacology and Therapeutics. 43 (10), 1025-1034 (2016).
  5. Jansson, P. A., et al. Probiotic treatment using a mix of three Lactobacillus strains for lumbar spine bone loss in postmenopausal women: a randomised, double-blind, placebo-controlled, multicentre trial. The Lancet Rheumatology. 1 (3), e154-e162 (2019).
  6. Yang, C., et al. Effects of non-viable Lactobacillus reuteri combining with 14-day standard triple therapy on Helicobacterpylori eradication: A randomized double-blind placebo-controlled trial. Helicobacter. 26 (6), 12856 (2021).
  7. Nikawa, H., et al. Lactobacillus reuteri in bovine milk fermented decreases the oral carriage of mutans streptococci. International Journal of Food Microbiology. 95 (2), 219-223 (2004).
  8. Reuter, G. The Lactobacillus and Bifidobacterium microflora of the human intestine: Composition and succession. Current Issues in Intestinal Microbiology. 2 (2), 43-53 (2001).
  9. Aukrust, T. W., Brurberg, M. B., Nes, I. F. Transformation of Lactobacillus by electroporation. Methods in Molecular Biology. 47, 201-208 (1995).
  10. Lubkowicz, D., et al. Reprogramming probiotic Lactobacillus reuteri as a biosensor for Staphylococcus aureus derived AIP-I detection. ACS Synthetic Biology. 7 (5), 1229-1237 (2018).
  11. Walter, J., Britton, R. A., Roos, S. Host-microbial symbiosis in the vertebrate gastrointestinal tract and the Lactobacillus reuteri paradigm. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108, 4645-4652 (2011).
  12. Ahmad, W., et al. Production of bimodal molecular weight levan by a Lactobacillus reuteri isolate from fish gut. Folia Microbiologica. 67 (1), 21-31 (2022).
  13. MacKenzie, D. A., et al. Strain-specific diversity of mucus-binding proteins in the adhesion and aggregation properties of Lactobacillus reuteri. Microbiology. 156 (11), 3368-3378 (2010).
  14. Oh, J. H., van Pijkeren, J. P. CRISPR-Cas9-assisted recombineering in Lactobacillus reuteri. Nucleic Acids Research. 42 (17), 131 (2014).
  15. Song, X., Huang, H., Xiong, Z., Ai, L., Yang, S. CRISPR-Cas9D10A nickase-assisted genome editing in Lactobacillus casei. Applied and Environmental Microbiology. 83 (22), e01259 (2017).
  16. Goh, Y. J., Barrangoua, R. Portable CRISPR-Cas9N system for flexible genome engineering in Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus gasseri, and Lactobacillus paracasei. Applied and Environmental Microbiology. 87 (6), e02669 (2021).
  17. Berthier, F., Zagorec, M., Champomier-Verg, M., Ehrlich, S. D., Morel-Devillel, F. Efficient transformation of Lactobacillus sake by electroporation. Microbiology. 142 (5), 1273-1279 (1996).
  18. Rattanachaikunsopon, P., Phumkhachorn, P. Glass bead transformation method for gram-positive bacteria. Brazilian Journal of Microbiology. 40 (4), 923 (2009).
  19. Pflügl, S., Marx, H., Mattanovich, D., Sauer, M. Genetic engineering of Lactobacillus diolivorans. FEMS Microbiology Letters. 344 (2), 152-158 (2013).
  20. Spath, K., Heinl, S., Grabherr, R. Direct cloning in Lactobacillus plantarum: Electroporation with non-methylated plasmid DNA enhances transformation efficiency and makes shuttle vectors obsolete. Microbial Cell Factories. 11, 141 (2012).
  21. Ortiz-Velez, L., et al. Genome alterations associated with improved transformation efficiency in Lactobacillus reuteri. Microbial Cell Factories. 17 (1), 138 (2018).
  22. O'Sullivan, D. J., Klaenhammer, T. R. Rapid mini-prep isolation of high-quality plasmid DNA from Lactococcus and Lactobacillus spp. Applied and Environmental Microbiology. 59 (8), 2730-2733 (1993).
  23. Lizier, M., Sarra, P. G., Cauda, R., Lucchini, F. Comparison of expression vectors in Lactobacillus reuteri strains. FEMS Microbiology Letters. 308 (1), 8-15 (2010).
  24. Roberts, R. J., Vincze, T., Posfai, J., Macelis, D. REBASE-a database for DNA restriction and modification: Enzymes, genes and genomes. Nucleic Acids Research. 43, D298-D299 (2015).
  25. Ahrne, S., Molin, G., Axelsson, L. Transformation of Lactobacillus reuteri with electroporation: Studies on the erythromycin resistance plasmid pLUL631. Current Microbiology. 24, 199-205 (1992).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

196

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены