Генерация центромер-ассоциированных белков-E CENP-E-/- нокаутных клеточных линий с использованием системы CRISPR/Cas9

Резюме

В данной статье сообщается о построении центромер-ассоциированных протеин-Е (CENP-E) нокаутных клеток с использованием системы CRISPR/Cas9 и трех стратегий скрининга на основе фенотипа. Мы использовали линию нокаутных клеток CENP-E для разработки нового подхода к валидации специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E, что полезно для разработки лекарств и биологических исследований.

Аннотация

Система CRISPR (clustered regular interspaced short palindromic repeats)/Cas9 стала мощным инструментом для точного и эффективного редактирования генов у различных организмов. Центромер-ассоциированный белок-Е (CENP-E) представляет собой положительно-концевой кинезин, необходимый для захвата кинетохорных микротрубочек, выравнивания хромосом и контрольной точки сборки веретена. Несмотря на то, что клеточные функции белков CENP-E были хорошо изучены, было трудно изучить прямые функции белков CENP-E с использованием традиционных протоколов, поскольку абляция CENP-E обычно приводит к активации контрольной точки сборки веретена, остановке клеточного цикла и гибели клеток. В этом исследовании мы полностью нокаутировали ген CENP-E в клетках HeLa человека и успешно сгенерировали клетки CENP-E^-/- HeLa с помощью системы CRISPR/Cas9.

Были разработаны три оптимизированные стратегии скрининга на основе фенотипа, включая скрининг клеточных колоний, фенотипы выравнивания хромосом и интенсивность флуоресценции белков CENP-E, которые эффективно повышают эффективность скрининга и успешность экспериментов нокаутных клеток CENP-E . Важно отметить, что делеция CENP-E приводит к рассогласованию хромосом, аномальному расположению белков серин/треонинкиназы B (BubR1) митотической контрольной точки BUB1 и митотическим дефектам. Кроме того, мы использовали модель нокаута клеток HeLa CENP-E для разработки метода идентификации специфических ингибиторов CENP-E.

В этом исследовании был разработан полезный подход к валидации специфичности и токсичности ингибиторов CENP-E. Кроме того, в данной работе представлены протоколы редактирования генов CENP-E с использованием системы CRISPR/Cas9, которые могут стать мощным инструментом для исследования механизмов деления клеток CENP-E. Кроме того, линия нокаутных клеток CENP-E будет способствовать открытию и валидации ингибиторов CENP-E, которые имеют важное значение для разработки противоопухолевых препаратов, изучения механизмов клеточного деления в клеточной биологии и клинического применения.

Введение

Инженерное редактирование генома опосредует целенаправленные модификации генов в различных клетках и организмах. У эукариот сайт-специфический мутагенез может быть введен путем применения последовательно-специфических нуклеаз, которые стимулируют гомологичную рекомбинацию^{ДНК-мишени 1}. В последние годы было разработано несколько технологий редактирования генома, в том числе нуклеазы цинковых пальцев (ZFNs)^2,3, эффекторные нуклеазы активатора транскрипции (TALENs^)4,5 и самонаводящиеся мегануклеазы ^6,7<....

протокол

1. Построение векторов нокаута гена CRISPR/Cas9

1. Выберите целевую последовательность геномной ДНК на гене CENP-E человека (GenBank Accession No. NM_001286734.2) и спроектировать sgRNA с помощью онлайн-инструмента проектирования CRISPR (http://crispor.tefor.net/).
2. Введите одну геномную последовательность, выберите геном "Homo sapiens-human-UCSC Dec 2013 (hg38 analysis set) + single nucleotide polymorphisms (SNPs): dbSNP148" и выберите протоспейсер рядом с мотивом "20 bp-NGG-spCas9". Выберите две направляющие последовательности, включая sgRNA-1, 5'-CGGCCGCACTCGCACGCAGA-3' и sgRNA-2 5'-TTCTTTAGAGACGCGGGCTC-3', в соотв....

Результаты

Клетки CENP-E^-/- HeLa были успешно получены с помощью системы CRISPR/Cas9 (рис. 1). Временная шкала и критические экспериментальные этапы этого метода показаны на рисунке 1. Сначала мы спроектировали и синтезировали CENP-E-специфичные sgRNA, отожгли и лигир.......

Обсуждение

Кинезин-7 CENP-E является ключевым регулятором выравнивания хромосом и контрольной точки сборки веретена во время деления клеток 17,19,20. Генетическая делеция CENP-E обычно приводит к активации контрольной точки сборки веретена, остановке кл?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.5 mL centrifuge tube	Axygen	MCT-150-C
24-well plate	Corning	3524
4S Gelred, 10,000x in water	Sangon Biotech (Shanghai)	A616697
50 mL centrifuge tube	Corning	430828
6 cm Petri dish	Corning	430166
95% ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	10009164
96-well plate	Corning	3599
Acetic acid	Sinopharm Chemical Reagent	10000218	Dissolve in H2O to prepare a 10% working solution.
Agarose	Sangon Biotech (Shanghai)	A620014
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0428	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 488-labeled Goat Anti-Rabbit IgG(H+L)	Beyotime	A0423	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Alexa Fluor 555-labeled Donkey Anti-Mouse IgG(H+L)	Beyotime	A0460	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:500 dilution.
Anhydrous ethanol	Sinopharm Chemical Reagent	100092690
Anti-BubR1 rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab254326	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution
Anti-CENP-B mouse monoclonal antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-376392	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:50 dilution.
Anti-CENP-E rabbit monoclonal antibody	Abcam	ab133583	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Anti-fade mounting medium	Beyotime	P0131	Slowing down the quenching of fluorescent signals.
Anti-α-tubulin mouse monoclonal antibody	Abcam	ab7291	For immunofluorescence. Dissolve in 1% BSA/PBST. 1:100 dilution.
Biotek Epoch Microplate Spectrophotometer	Biotek Instruments	Biotek Epoch
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sinopharm Chemical Reagent	69003435
BpiI (BbsI)	Thermo Fisher Scientific	ER1011
CellTiter 96 aqueous one solution cell proliferation assay	Promega	G3580
Centrifuge	Eppendorf	5424BK745380
Colchicine	Sinopharm Chemical Reagent	61001563
Confocal scanning microscope	Leica	Leica TCS SP8
Coverslip	CITOTEST	80344-1220
DAPI	Beyotime	C1006
DH5α competent cells	Sangon Biotech (Shanghai)	B528413
DL2000 DNA marker	TaKaRa	3427A
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	C11995500BT
Endo-free plasmid mini kit	Omega	D6950
Ezup Column Animal Genomic DNA Purification Kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518251
Fetal bovine serum	Zhejiang Tianhang Biotechnology	11011-8611
Gentian violet	Sinopharm Chemical Reagent	71019944	Dissolve in PBS to prepare 0.1% gentian violet/PBS.
Giemsa staining solution	Sinopharm Chemical Reagent	71020260
GraphPad Prism version 8.0 software	GraphPad	www.graphpad.com	Statistical analysis.
GSK923295	MedChemExpress	HY-10299
HeLa cell line	ATCC	CCL-2
Humidified incubator	Heal Force	HF90/HF240
Image J software	National Institutes of Health	https://imagej.nih.gov/ij/	Image processing and analysis.
Inverted microscope	Nanjing Jiangnan Novel Optics	XD-202
LB agar powder	Sangon Biotech (Shanghai)	A507003
Lipo6000 transfection reagent	Beyotime	C0526
Nikon Ti-S2 microscope	Nikon	Ti-S2
Opti-MEM reduced serum medium	Gibco	31985070
Paraformaldehyde	Sinopharm Chemical Reagent	80096618	Dissolve in PBS to prepare 4% paraformaldehyde/PBS.
Penicillin-streptomycin solution	HyClone	SV30010
SanPrep column DNA gel extraction kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518131
SanPrep column plasmid mini-preps kit	Sangon Biotech (Shanghai)	B518191
T4 DNA ligase	TaKaRa	2011A
T4 polynucleotide kinase	TaKaRa	2021A
TaKaRa Ex Taq	TaKaRa	RR001A
Triton X-100	Sinopharm Chemical Reagent	30188928	Dissolve in PBS to prepare 0.25% Triton X-100/PBS.
Tween 20	Sinopharm Chemical Reagent	30189328	Dissolve in PBS to prepare 0.1% Tween 20/PBS.