Базовая трехмерная (3D) система моделей кишечника с иммунным компонентом

Резюме

В данной статье мы опишем построение базовой трехмерной (3D) системы моделирования кишечной клеточной линии и протокола встраивания парафина для световой микроскопической оценки фиксированных кишечных эквивалентов. Окрашивание выбранных белков позволяет анализировать несколько визуальных параметров из одного эксперимента для потенциального использования в доклинических скрининговых исследованиях лекарственных средств.

Аннотация

Отмечается рост использования моделей кишечника in vivo и in vitro для изучения патофизиологии воспалительных заболеваний кишечника, для фармакологического скрининга потенциально полезных веществ и для исследований токсичности потенциально вредных пищевых компонентов. Актуально то, что в настоящее время существует потребность в разработке клеточных моделей in vitro для замены моделей на животных. Здесь представлен протокол для базовой, «здоровой» трехмерной (3D) эквивалентной модели кишечника с использованием клеточных линий, обладающий двойным преимуществом, обеспечивающим как экспериментальную простоту (стандартизированная и легко воспроизводимая система), так и физиологическую сложность (энтероциты Caco-2 с поддерживающим иммунным компонентом моноцитов U937 и фибробластов L929). Протокол также включает в себя введение парафина для световой микроскопической оценки фиксированных кишечных эквивалентов, тем самым обеспечивая преимущество анализа нескольких визуальных параметров в одном эксперименте. Окрашенные гематоксилином и эозином (H&E) срезы, показывающие столбчатые клетки Caco-2, образующие плотный и регулярный монослой в контрольных процедурах, используются для проверки эффективности модели в качестве экспериментальной системы. Используя глютен в качестве провоспалительного компонента пищи, параметры, анализируемые из срезов, включают уменьшение толщины монослоя, а также разрушение и отслоение от нижележащего матрикса (H&E), снижение экспрессии белка плотного соединения, как показано при окклюдиновом окрашивании (количественно поддающееся статистической оценке), и иммунную активацию мигрирующих клеток U937, о чем свидетельствует окрашивание кластера дифференцировки 14 (CD14) и дифференцировка, связанная с CD11b, в макрофаги. Как показано при использовании липополисахарида для моделирования воспаления кишечника, дополнительными параметрами, которые могут быть измерены, являются повышенное окрашивание слизи и экспрессия цитокинов (таких как мидкин), которые могут быть извлечены из среды до фиксации. Базовая трехмерная (3D) модель слизистой оболочки кишечника и фиксированные срезы могут быть рекомендованы для исследований воспалительного статуса и целостности барьера с возможностью анализа нескольких визуальных количественных параметров.

Введение

Эпителиальный барьер кишечника, внутренняя оболочка толщиной в одну клетку, содержащая различные типы эпителиальных клеток, представляет собой первый физический защитный барьер или интерфейс между внешней и внутренней средой тела ^1,2. Энтероциты столбчатого типа представляют собой наиболее распространенный тип эпителиальных клеток. Они отвечают за поддержание целостности эпителиального барьера за счет взаимодействия между несколькими компонентами барьера, включая плотные соединения (ТЖ), играя значительную роль в уплотнении барьера ^1,3. Структура TJ со....

протокол

1. Подготовка базовой 3D реконструированной модели слизистой оболочки кишечника

ПРИМЕЧАНИЕ: Вся процедура должна проводиться в стерильном ламинарном колпаке. Все этапы процедуры, связанные с использованием клеточного инкубатора, означают, что культуры инкубируются при 37 °C во влажной атмосфере, содержащей 5%_CO2 (если иное не указано в протоколе_).

1. Предварительная подготовка клеточных линий, используемых в кишечной модельной системе
   1. Высейте клетки фибробластов мыши L929 в концентрации 5 x 10,5 в 5 мл модифицированной орлиной среды (DMEM) Dulbecco, содержащей 2 мМ L-глютамина, 10% фетальной бы....

Результаты

Первым важным аспектом является определение приемлемости базового 3D слизистой оболочки кишечного эквивалента для экспериментальных целей. Это делается с помощью наиболее широко используемых красителей в гистологических и гистопатологических лабораториях, а именно гематоксилина (о.......

Обсуждение

Представленная здесь базовая реконструированная система моделирования слизистой оболочки кишечника (рис. 6) сочетает в себе физиологическую сложность (более физиологически релевантные 3D-клеточные культуры, содержащие монослой Caco-2 с богатой ECM опорой из собственной пл.......