Здесь описан простой рабочий процесс для дифференциации эндотелиальных клеток от плюрипотентных стволовых клеток человека, за которым следует подробный протокол их механической стимуляции. Это позволяет изучать механобиологию развития эндотелиальных клеток. Этот подход совместим с последующими анализами живых клеток, собранных с культурального чипа после механической стимуляции.
Сердце является первым органом, который функционирует во время развития, тем самым инициируя кровообращение на ранних сроках беременности. Помимо транспортировки кислорода и питательных веществ для обеспечения роста плода, кровообращение плода контролирует многие важные события развития, происходящие в эндотелиальном слое с помощью механических сигналов. Биомеханические сигналы индуцируют структурные изменения кровеносных сосудов, устанавливают артериовенозную спецификацию и контролируют развитие гемопоэтических стволовых клеток. Труднодоступность развивающихся тканей ограничивает понимание роли кровообращения в раннем развитии человека; Таким образом, модели in vitro являются ключевыми инструментами для изучения механобиологии сосудов. В данной работе описывается протокол дифференциации эндотелиальных клеток от индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека и их последующего посева в жидкостное устройство для изучения их реакции на механические сигналы. Этот подход позволяет проводить длительное культивирование эндотелиальных клеток при механической стимуляции с последующим извлечением эндотелиальных клеток для фенотипической и функциональной характеристики. Созданная здесь модель in vitro будет полезна для выяснения внутриклеточных молекулярных механизмов, которые трансдуцируют сигналы, опосредованные механическими сигналами, которые в конечном итоге управляют развитием сосудов во время внутриутробной жизни человека.
Во время эмбрионального развития сердце является первым органом, который устанавливает функциональность1, с обнаруживаемыми сокращениями с самой ранней стадии формирования эндокардиальной трубки2. Кровообращение, наряду с механическими сигналами, опосредованными потоком крови в сосуде, контролирует многие важнейшие аспекты раннего развития. До установления циркуляции крови плода сосудистая сеть организуется в первичное капиллярное сплетение; При функционировании сердца это сплетение реорганизуется в венозную и артериальную сосудистую сеть3. Роль механических сигналов в артериовенозной спецификации отражается в панэндотелиальной экспрессии артериальных и венозных маркеров до начала кровотока4.
Гемодинамические силы не только контролируют развитие самой сосудистой сети, но и играют фундаментальную роль в контроле образования клеток крови. Гемопоэтические стволовые и прогениторные клетки (ГСПК) возникают из специализированных эндотелиальных клеток, называемых гемогенным эндотелием 5,6,7,8, присутствующих в различных анатомических областях эмбрионов исключительно на ранней стадии развития. Модели с сердечной недостаточностью вместе с моделями in vitro продемонстрировали, что механические сигналы инструктируют и увеличивают продукцию HSPC из гемогенного эндотелия 9,10,11,12,13,14.
Было показано, что различные типы динамики потока дифференцированно контролируют клеточный цикл15, который, как известно, важен как для гемогенного эндотелия 16,17, так и для спецификации артериальных клеток18. В целом, механические сигналы являются важнейшими детерминантами идентичности и функционирования клеток во время развития. Новые жидкостные устройства in vitro позволяют нам преодолеть ограничения, связанные с изучением механобиологии развития во время развития крови человека in vivo.
Общая цель протокола в данной рукописи состоит в том, чтобы описать, шаг за шагом, экспериментальный процесс изучения влияния сдвигового стресса на эндотелиальные клетки человека, полученные in vitro из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК). Данный протокол содержит подробные инструкции по дифференцировке ИПСК в эндотелиальные клетки и их последующему посеву в флюидные чипы для протокола стимуляции. Используя это, различные эндотелиальные клетки, полученные in vitro, могут быть протестированы на их способность ощущать напряжение сдвига, анализируя их ориентацию в ответ на поток. Это позволит другим лабораториям ответить на вопросы о реакции на сдвиговое напряжение и его функциональных последствиях для различных идентичностей эндотелиальных клеток.
ПРИМЕЧАНИЕ: Все методы культивирования клеток должны выполняться в стерильных условиях в ламинарном колпаке, а клетки должны инкубироваться при 37 °C в гумифицированной атмосфере с 5%CO2. Инструкции по всем препаратам цитокинов как для поддерживающей терапии (rhbFGF), так и для протокола дифференцировки (rhBMP4, rhVEGF, rhbFGF, rhIL6, rhFLT3L, rhIGF1, rhIL11, rhSCF, rhEPO, rhTPO, rhIL3) приведены в Дополнительной таблице S1.
1. Культивирование ИПСК - размораживание, поддержание и замораживание клеток
2. Дифференцировка ИПСК в эндотелиальные клетки
3. Выделение CD34+ клеток и посев в чип
ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки CD34+ выделяют методом положительной изоляции с помощью набора микрогранул CD34 (см. таблицу материалов), который содержит микрогранулы CD34, конъюгированные с моноклональными мышиными антителами, антитела CD34 и реагент, блокирующий FcR (Human IgG). Важно проверить эффективность изоляции колонки путем окрашивания клеток до и после выделения для анализа методом проточной цитометрии, Ниже указано, когда необходимо взять клетки для этого анализа.
4. Применение непрерывного потока к эндотелиальным клеткам - Аорта-на-чипе
Мы описываем протокол дифференцировки и механостимуляции эндотелиальных клеток, полученных из ИПСК, который позволяет изучать их реакцию на механические сигналы (рис. 1). Этот протокол приводит к выработке функционально механочувствительных эндотелиальных клеток. Мы приводим репрезентативные результаты и описываем ожидаемый фенотип, чтобы оценить, как клетки реагируют на стимуляцию цитокинов во время дифференцировки.
Рисунок 1: Схема протокола дифференцировки и механической стимуляции. Схема протокола дифференцировки, показывающая время различных смесей цитокинов, выделение CD34+ клеток, флюидный посев чипов и окончательный анализ механически стимулированных клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Культура ИПСК
Важно начинать протокол с ИПСК, которые правильно растут в условиях самообновления. Хорошим показателем качества культуры является скорость их роста. После оттаивания клеткам может потребоваться 2-3 недели, чтобы достичь правильной фазы роста, которая обеспечит хорошую дифференцировку. Когда клетки можно пассировать два раза в неделю в соотношении 1:6, достигая почти полного слияния, это время, когда они готовы к дифференцировке в тот же день, когда они должны быть пассированы.
Дифференцировка ИПСК в эндотелиальные клетки
Первый этап дифференцировки, заключающийся в образовании эмбриоидных тел (ЭБ), зависит от клеточной линии и может нуждаться в некоторой оптимизации для конкретной используемой клеточной линии. Диссоциацию, описанную на этапах протокола 1.3.2.2-1.3.2.4, можно модифицировать путем сокращения или продления инкубации с реагентом для диссоциации и последующей диссоциации с помощью пипетки Пастера. Кроме того, для этого этапа могут быть использованы другие реагенты для диссоциации в дополнение к физической диссоциации колоний с помощью режущего инструмента или наконечника пипетки P100. БЭ хорошего качества показывают четкий край ко 2-му дню дифференциации и выглядят четкими и яркими при наблюдении с помощью микроскопа; более темные участки могут указывать на гибель клеток в БЭ (рис. 2).
Рисунок 2: Морфология эмбриоидных тел. (A) На 2-й день эмбриоидные тела с четко очерченными внешними краями и постоянным размером. (Б) На 2-й день эмбриоидные тела плохого качества, демонстрирующие обширную гибель клеток, приводящую к дезагрегации структуры. Масштабная линейка = 500 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
На 2-й день добавление CHIR99021 к БЭ ингибирует белок GSK-3, что приводит к активации пути Wnt. Различные клеточные линии имеют различную реакцию на лечение CHIR, и это должно быть проверено путем количественного определения количества CD34+ клеток, полученных на 8-й день с использованием различных концентраций (рис. 3).
Рисунок 3: Дифференцировка эндотелиальных клеток при различных методах лечения CHIR. Приверженность эндотелиальных клеток количественно определяли методом проточной цитометрии на 8-й день дифференцировки по экспрессии мембраны CD34 после лечения CHIR на 2-е сутки при (A) 3 мкМ, (B) 5 мкМ и (C) 7 мкМ. Данные проточной цитометрии были получены с помощью пятилазерных цитометров и специального программного обеспечения (см. таблицу материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Выделение CD34+ клеток
Важно подтвердить, что обогащение CD34+ с помощью магнитных шариков обеспечивает не менее 80% CD34+ после элюирования колонки. Для обеспечения достаточной чистоты аликвота клеток, полученных в результате магнитной изоляции, может быть проанализирована с помощью проточной цитометрии, при этом используется клон антитела, отличный от того, который используется для магнитного обогащения. Здесь был использован клон 4H11 и достигнута чистота ~85% после обогащения (рис. 4).
Рисунок 4: Мембранная экспрессия CD34 до и после обогащения методом магнитной сортировки. Диссоциированные эмбриоидные тельца на 8-й день (серые) и клетки после магнитного обогащения (зеленые) окрашивали на экспрессию CD34 и анализировали методом проточной цитометрии, показав успешную сортировку после обогащения. Данные проточной цитометрии были получены с помощью пятилазерных цитометров и специального программного обеспечения (см. таблицу материалов). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Посев клеток в флюидный канал
При посеве клеток в флюидный канал крайне важно отслеживать адгезию и пролиферацию эндотелиальных клеток. После посева клеткам требуется ~5 ч, чтобы полностью прилипнуть к каналу (рис. 5А). На этом этапе также может быть опробовано альтернативное решение для покрытия для улучшения адгезии. Чтобы подтвердить, что тестируемые клетки механочувствительны и, следовательно, способны реагировать на механическую стимуляцию, ориентация клеток может быть проверена в течение долгого времени. Клетки перед стимуляцией имеют случайную ориентацию (рис. 5А и Рис. 5С) и переориентируются параллельно направлению потока (рис. 5В, С). Описанный здесь протокол позволяет отбирать клетки из канала для выполнения последующего анализа, например, проточной цитометрии, для изучения их мембранного иммунофенотипа, обеспечивая эндотелиальную идентичность стимулированных клеток (рис. 5D, E).
Рисунок 5: Механочувствительность эндотелиальных клеток, полученных из ИПСК . (A) Конфлюентный слой изолированных CD34+ клеток через 48 ч после посева. (Б) Переориентированный слой эндотелиальных клеток 3 дня в динамической культуре. (C) Ориентационный анализ эндотелиальных клеток после 5 дней динамического культивирования. (D) Профиль экспрессии CD34 клеток, культивируемых под потоком в течение 5 дней. (E) Процент CD34+ клеток клеточной популяции, извлеченных из флюидного канала. Изображения были сделаны с помощью перевернутого инкубаторного микроскопа; Данные проточной цитометрии были получены с помощью пятилазерных цитометров и специального программного обеспечения (см. таблицу материалов). Масштабные линейки = 100 мкм (A,B). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Реагентов | Концентрация запасов | Добавленный объем | Конечная концентрация |
Модифицированный медиум Дульбекко (IMDM) | - | 333 мл | - |
Питательная смесь для ветчины F-12 (F-12) | - | 167 мл | - |
Добавка N-2 (100x) | 100 х | 5 мл | В 1 раз |
Добавка B-27 (50 шт.) | 50 х | 10 мл | В 1 раз |
Аскорбиновая кислота | 10 мг/мл | 1,25 мл | 25 мкг/мл |
α-монотиоглицерин (MTG) | 11,5 М | 19,5 мкл | 448,5 мкМ |
Сывороточный альбумин человека | 100 мг/мл | 2,5 мл | 0,5 мг/мл |
Голо-Трансферрин | 100 мг/мл | 0,75 мл | 150 мкг/мл |
Таблица 1: Состав и рецептура на 500 мл среды для безсывороточной дифференцировки (SFD).
Дни дифференциации | Цитокиновая смесь | Цитокин | Конечная концентрация |
День 0 - 2 | Микс 1 | БМП4 | 20 нг/мл |
День 2 | Микс 2 | CHIR99021 | 7 мкМ |
Начиная с 3-го дня | Смешайте 3 и 4 | ВЭГФ | 15 нг/мл |
bFGF | 5 нг/мл | ||
Начиная с 6-го дня | Микс 4 | ИЛ6 | 10 нг/мл |
FLT3L | 10 нг/мл | ||
ИФР1 | 25 нг/мл | ||
ИЛ11 | 5 нг/мл | ||
СКФ | 50 нг/мл | ||
ЭПО | 3 ЕД/мл | ||
ТПО | 30 нг/мл | ||
ИЛ3 | 30 нг/мл |
Таблица 2: Смеси цитокинов, используемых для дифференцировки эндотелиальных клеток, дни, в которые они добавляются в среду SFD, и конечная концентрация.
Напряжение сдвига (дин/см2) | Время (ч) |
0.5 | 1 |
1 | 1 |
1.5 | 1 |
2 | 1 |
2.5 | 1 |
3 | 1 |
3.5 | 1 |
4 | 1 |
4.5 | 1 |
5 | До конца эксперимента |
Таблица 3: Значения касательных напряжений для динамических культур и продолжительность их применения.
Дополнительный рисунок S1: Геометрия и размеры микросхемы и трубки, используемых для этого протокола. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок S2: Пошаговое руководство по программному обеспечению для управления воздушным насосом с описанием каждого шага. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительный рисунок S3: Руководство по анализу ориентации с использованием FIJI, показывающее чертеж формы ячейки, эллиптической аппроксимации и окончательного измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Дополнительная таблица S1: Размер единицы, объем ресуспензии и концентрация запасов цитокинов, используемых в протоколе дифференцировки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать этот файл.
Протокол, который мы здесь описываем, позволяет генерировать механочувствительные эндотелиальные клетки из плюрипотентных стволовых клеток человека и изучать их реакцию на механическую стимуляцию, опосредованную контролируемым напряжением сдвига. Этот протокол полностью основан на цитокинах и полностью совместим с реагентами GMP для потенциальной трансляции в производство клеток для клеточной терапии.
Получение ИПСК предоставляет ученым инструментальную модель для ранних стадий эмбрионального развития, которая позволяет изучать процессы, которые иначе трудно изучать in vivo24. На самом деле, человеческие эмбриональные ткани, доступные для исследования, собираются из эмбрионов, лишенных кровообращения, и это может оказать значительное влияние на молекулярную сигнатуру, контролируемую механическими сигналами. Описанный здесь подход позволяет визуализировать в реальном времени и изучать реакцию клеток на напряжение сдвига. Комбинация ИПСК с флюидикой обеспечивает модель исследования, которая преодолевает ограниченную доступность и недоступность развивающихся тканей плода, когда инициация кровообращения ремоделирует и контролирует создание сердечно-сосудистой системы и системы крови 3,9,10,25.
Ограничением протокола является то, что эндотелиальные клетки, полученные из этого протокола, могут не отражать различные идентичности различных эндотелиальных клеток, присутствующих в развивающихся тканях. Для преодоления этого ограничения может потребоваться специфическая комбинация цитокинов в процессе дифференцировки, предшествующем флюидной стимуляции, для получения желаемой идентичности или тканеспецифического фенотипа26. Выделение эндотелиальных субпопуляций может быть получено с использованием более уточненного иммунофенотипа на этапе выделения. Этот протокол изолирует эндотелиальные клетки только на основе экспрессии CD34, что позволяет выделять колонки вместо флуоресцентно-активированной сортировки клеток (FACS); Это снижает гибель клеток и риск загрязнения. Кроме того, этот протокол специально разработан для изучения роли напряжения сдвига, опосредованного ламинарным потоком. Альтернативные флюидные подходы должны быть использованы для изучения влияния других механических сигналов, таких как растяжение или сжатие, или других типов потока, таких как возмущенный или возмущенный поток.
Ранее мы показали, что эндотелиальные клетки, полученные из ИПСК, имитируют гетерогенные артериовенозные клеточные идентичности27, аналогичные тем, которые наблюдаются в дорсальной аорте плода28,29,30. Это имеет особое значение в контексте развития сосудов и клеточной спецификации, которые, как известно, контролируются кровообращением. Исследования на различных моделях показали, что недостаточное кровообращение приводит к изменению артериовенозной спецификации11,14,31. Механизмы, связывающие механические сигналы со спецификацией клетки, до сих пор неизвестны, и описанный здесь конвейер позволяет проводить уточненные функциональные исследования, которые не могут быть проверены in vivo.
Этот конвейер описывает производство и стимуляцию эндотелиальных клеток, полученных из ИПСК, с использованием коммерчески доступных флюидных каналов, что позволяет избежать необходимости отливки устройств, как в случае с широко используемыми устройствами из полидиметилсилоксана (ПДМС)12. Кроме того, использование чипов PDMS делает сбор стимулированных клеток особенно сложным, в то время как с помощью этого протокола клетки могут быть легко извлечены из канала. Это значительно повышает аналитическую мощность, позволяя проводить последующие анализы, такие как протеомный и транскриптомный анализы, проточная цитометрия и функциональные анализы, которые могут потребовать дальнейшего культивирования или анализа in vivo .
У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.
Эта работа была поддержана грантом Research Advanced Grant 2021 от Европейской ассоциации гематологов, Global Research Award 2021 от Американского общества гематологов и Фондом поддержки внутренней стратегии ISSF3, финансируемым Welcome Trust и Эдинбургским университетом. Мы благодарим Фиону Росси (Fiona Rossi) из Центра проточной цитометрии за поддержку в анализе проточной цитометрии. В целях открытого доступа автор применил лицензию Creative Commons Attribution (CC BY) к любой версии рукописи, принятой автором, возникшей в результате этой публикации.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.6 Luer uncoated slide | ibidi | IB-80186 | |
25% BSA | Life Technologies | A10008-01 | |
6-well plates | Greiner Bio-one | 657160 | |
Accutase | Life Technologies | A1110501 | Cited as Dissociation reagent |
Ascorbic acid | Merck | A4544-100G | |
Aspiration pipette | Sardtedt | 86.1252.011 | |
B27 supplement | Life Technologies | 17504044 | Cited as Neuronal cell culture supplement (50x) |
BD FACS DIVA | BD Biosciences | Version 8.0.1 | Cited as flow cytometry software |
BD LSR Fortessa 5 Laser | BD Biosciences | ||
bFGF | Life Technologies | PHG0021 | |
CD34 Microbead kit | Miltenyil Biotec | 30-046-702 | |
CD34 PE clone 4H11 | Invitrogen | 12-0349-42 | |
CD34 PerCP-eFluor 710 clone 4H11 | Invitrogen | 44-0349-42 | |
Cellstar cell-repellent surface 6-well plates | Greiner Bio-one | 657970 | Cited as cell-repellent plate |
CHIR99021 | Cayman Chemicals | 13122-1mg-CAY | |
Cryostor CS10 cell cryopreservation | Merck | C2874-100ML | Cited as Cryopreservation solution |
Dimethyl Sulfoxide | VWR | 200-664-3 | Cited as DMSO |
DMEM/F-12 | Life Technologies | 10565-018 | |
DPB Ca2+ Mg2+ | Life Technologies | 14080055 | |
DPBS | Life Technologies | 14200075 | |
EASY Strainer 40 μm | Greiner Bio-one | 542040 | |
EDTA | Life technologies | 15575020 | |
FcR Blocking Reagent | Miltenyil Biotec | 130-059-901 | |
Fiji | Version 1.53c | ||
Flow Jo | Version 10.7.1 | Cited as flow cytometry sanalysis oftware | |
FLT3L | Peprotech | 300-19-10uG | |
Fluidic unit | ibidi | 10903 | |
GlutaMax | Life Technologies | 35050038 | Cited as L-glutamine supplement |
Ham F-12 | Life Technologies | 11765054 | |
Holo-transferrin | Merk | T0665-500MG | |
Human Serum Albumin | Fujifilm UK LTD | 9988 | |
Ibidi Pump system | ibidi | 10902 | Cited as Pump system |
IMDM | Life Technologies | 12440053 | |
Inverted microscope | ioLight/Thisle Scientific | IOL-IO-INVERT | Cited as inverted in-incubator microscope |
Lyophilised BSA | Merck | A2153-100G | |
MiniMACS Separator | Miltenyil Biotec | 130-042-102 | Cited as Magnetic separator |
MS Columns | Miltenyil Biotec | 130-042-201 | Cited as Magnetic column |
MTG | Merck | M6145-25ML | |
N2 supplement | Life Technologies | 17502048 | |
Notebook for pump system | ibidi | 10908 | |
Paraformaldehyde 37-41% | Fisher Chemicals | F/1501/PB15 | |
Pastette | Greiner Bio-one | 612398 | |
Pen/Strep | Gibco | 15070063 | |
Perfusion Set YELLOW/GREEN: 50 cm, ID 1.6 mm, 10 mL reservoirs | Ibidi | IB-10964 | Cited as Perfusion set |
Polystyrene Round Bottom Tubes | Falcon | 352008 | Cited as Flow cytometry tubes |
Prism 9 | Verison 9.4.0 | ||
Pump control software | ibidi | version 1.6.1 | Cited as Pump software |
ReLeSR | Stem cell tecchonologies | 5872 | Cited as Detaching solution |
rhBMP4 | R&D | 314-BP-010 | |
rhEPO | R&D | 287-TC-500 | |
rhIGF1 | Peprotech | 100-11-100uG | |
rhIL11 | Peprotech | 200-11-10uG | |
rhIL3 | Peprotech | 200-03-10uG | |
rhIL6 | R&D | 206-IL-010 | |
rhLaminin-521 | Life technologies | A29248 | Cited as Laminin |
rhSCF | Life Technologies | PHC2111 | |
rhTPO | R&D | 288-TPN-025 | |
rhVEGF | R&D | 293-VE-010 | |
RLT Lysis Buffer | Qiagen | 79216 | |
Serial Connector for µ-Slides: Sterile, Sterile | ibidi | IB-10830 | |
StemPro-CD34 SFM media | Life Technologies | 10639011 | Cited as Serum-Free media for CD34+ cells (SFM-34) |
StemPro-CD34 Nutrient Supplement | Life Technologies | 10641-025 | Cited as 34 nutrient supplement |
StemPro hESC SFM | Life Technologies | A1000701 | Cited as Culture media |
StemPro supplement | Life Technologies | A10006-01 | |
Vitronectin (VTN-N) recombinant human protein, truncated | Invitrogen | A31804 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | Cited as iRock |
β-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены