Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье представлен протокол направленной дифференцировки и функционального анализа β-клеточных клеток. Описаны оптимальные условия культивирования и пассажи плюрипотентных стволовых клеток человека перед получением инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Шестиступенчатая дифференцировка прогрессирует от окончательного формирования энтодермы до функциональных β-клеточных клеток, секретирующих инсулин в ответ на глюкозу.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут дифференцироваться в любой тип клеток, что делает их отличным альтернативным источником β-клеток поджелудочной железы человека. ПСК могут быть либо эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), полученными из бластоцисты, либо индуцированными плюрипотентными клетками (ИПСК), полученными непосредственно из соматических клеток с помощью процесса перепрограммирования. Здесь представлен видеопротокол, описывающий оптимальные условия культивирования и пассажа ПСК до их дифференцировки и последующей генерации инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Эта методология следует шестиступенчатому процессу направленной дифференцировки β клеток, в ходе которого ПСК дифференцируются в дефинитивную энтодерму (ДЭ), примитивную кишечную трубку, заднюю часть передней кишки, предшественников поджелудочной железы, эндокринных предшественников поджелудочной железы и, в конечном счете, β-клетки поджелудочной железы. Примечательно, что данная методика дифференцировки занимает 27 дней для генерации β-клеток поджелудочной железы человека. Потенциал секреции инсулина оценивали с помощью двух экспериментов, которые включали иммуноокрашивание и стимулированную глюкозой секрецию инсулина.

Введение

Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) обладают уникальной способностью дифференцироваться в различные типы клеток, что делает их жизнеспособной альтернативой β-клеткам поджелудочной железычеловека1. Эти чПСК подразделяются на два типа: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), полученные из бластоцисты2, и индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), полученные путем прямого перепрограммирования соматических клеток3. Разработка методов дифференцировки ЧПСК в β-клетки имеет важное значение как для фундаментальных исследований, так и для клинической практики 1,4

протокол

Перед началом дифференцировки рекомендуется определить необходимое количество островковых органоидов для экспериментальных целей. В 6-луночном планшете одна лунка с более чем 80% слиянием обычно состоит из 2-2,3 миллиона ПСК. Несмотря на то, что точный прогноз является сложной задачей из-за различий в линиях hPSC и эффективности дифференциации, приблизительная оценка в 1,5 раза превышает количество начальных скважин. Эффективно направленная дифференцировка обычно дает от 1,6 до 2 миллионов клеток на лунку в шестилуночных планшетах, охватывая все клетки в кластерах, а не исключительно инсулин-продуцирующие клетки. Для кластера размером 50 мкм он может содержать около 1....

Результаты

Протокол, описанный в этой статье, предлагает высокоэффективный подход к дифференцировке β подобных клеток из ЧПСК10. В этом процессе используется легко масштабируемая система 2D-культивирования, что позволяет использовать ее в различных экспериментальных условиях, таких .......

Обсуждение

Успешная дифференцировка чПСК в β-клетки поджелудочной железы зависит от оптимизации всех аспектов рутинного культивирования и пассажа выбранных ПСК. Это включает в себя обеспечение того, чтобы клеточная линия имела нормальный кариотип, была отрицательной на микоплазменную инфекцию.......

Благодарности

Инес Шеркауи была поддержана стипендией Diabetes UK (BDA 18/0005934) для GAR, которая также благодарит Wellcome Trust за награду исследователя (212625/Z/18/Z), UKRI MRC за грант программы (MR/R022259/1), грант Diabetes UK за проект (BDA16/0005485), CRCHUM за стартап-фонды, Innovation Canada за премию John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) для проектного гранта и CIHR, JDRF для командного гранта (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Камилла Дион и д-р Гарри Лейтч за помощь в создании и культивировании ИПСК человека, Имперский центр биомедицинских исследований NIHR, Лондон.

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge TubeStarlabsS1615-5500
6-well Cell culture plateThermoFisher Scientific165218
AggreWell 400 6-well plate STEMCELL Technologies34425
Anti-Glucagon Sigma-aldrichG2654-100UL
Anti-Insulin DakoA0564
Anti-NKX6.1Novus BiologicalsNBP1-49672SS
Anti-PDX1 Abcamab84987
AphidicolinSigma-AldrichA4487
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid freeSigma-AldrichA3803-100G
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Calcium/Magnesium free D-PBSThermo Fisher Scientific14190144
Cyclopamine-KAADCalbiochem239804
D-(+)-Glucose,BioXtraSigma-AldrichG7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrousSigma-Aldrich94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566016For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)Thermo Fisher Scientific10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher Scientific10149870
EthanolVWR20821.33
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor BasementThermo Fisher ScientificA1413302Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647Abcamab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633Thermo Fisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
HeparinSigma-AldrichH3149
HEPES bufferSigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342, TrihydrochlorideThermo Fisher ScientificH1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant ProteinThermo Fisher ScientificPHG0094
Hydrogen chlorideSigma-Aldrich295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP PenAgar ScientificAGG4582
LDN193189Sigma-AldrichSML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272-500G
OCT Compound 118 mLAgar ScientificAGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)Thermo Fisher Scientific,15070-063
Potassium chlorideSigma-Aldrich7447-40-7
Recombinant Human EGF ProteinR&D Systems236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mmVWR631-0137
RepSox (Hydrochloride)STEMCELL Technologies72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific61870036For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-500G
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrousSigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff Endoderm STEMCELL Technologies5110
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic AcidReprocell04-0021 
Thyroid Tormone 3 (T3)Sigma-AldrichT6397
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
TrypL Express Enzyme (1X)Thermo Fisher Scientific12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension CultureThermo Fisher Scientific38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977015
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies72302
Zinc SulfateSigma-Aldrich Z4750

Ссылки

  1. Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. <....

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены