Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
В данной статье представлен протокол направленной дифференцировки и функционального анализа β-клеточных клеток. Описаны оптимальные условия культивирования и пассажи плюрипотентных стволовых клеток человека перед получением инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Шестиступенчатая дифференцировка прогрессирует от окончательного формирования энтодермы до функциональных β-клеточных клеток, секретирующих инсулин в ответ на глюкозу.
Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут дифференцироваться в любой тип клеток, что делает их отличным альтернативным источником β-клеток поджелудочной железы человека. ПСК могут быть либо эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), полученными из бластоцисты, либо индуцированными плюрипотентными клетками (ИПСК), полученными непосредственно из соматических клеток с помощью процесса перепрограммирования. Здесь представлен видеопротокол, описывающий оптимальные условия культивирования и пассажа ПСК до их дифференцировки и последующей генерации инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Эта методология следует шестиступенчатому процессу направленной дифференцировки β клеток, в ходе которого ПСК дифференцируются в дефинитивную энтодерму (ДЭ), примитивную кишечную трубку, заднюю часть передней кишки, предшественников поджелудочной железы, эндокринных предшественников поджелудочной железы и, в конечном счете, β-клетки поджелудочной железы. Примечательно, что данная методика дифференцировки занимает 27 дней для генерации β-клеток поджелудочной железы человека. Потенциал секреции инсулина оценивали с помощью двух экспериментов, которые включали иммуноокрашивание и стимулированную глюкозой секрецию инсулина.
Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) обладают уникальной способностью дифференцироваться в различные типы клеток, что делает их жизнеспособной альтернативой β-клеткам поджелудочной железычеловека1. Эти чПСК подразделяются на два типа: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), полученные из бластоцисты2, и индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), полученные путем прямого перепрограммирования соматических клеток3. Разработка методов дифференцировки ЧПСК в β-клетки имеет важное значение как для фундаментальных исследований, так и для клинической практики 1,4
Перед началом дифференцировки рекомендуется определить необходимое количество островковых органоидов для экспериментальных целей. В 6-луночном планшете одна лунка с более чем 80% слиянием обычно состоит из 2-2,3 миллиона ПСК. Несмотря на то, что точный прогноз является сложной задачей из-за различий в линиях hPSC и эффективности дифференциации, приблизительная оценка в 1,5 раза превышает количество начальных скважин. Эффективно направленная дифференцировка обычно дает от 1,6 до 2 миллионов клеток на лунку в шестилуночных планшетах, охватывая все клетки в кластерах, а не исключительно инсулин-продуцирующие клетки. Для кластера размером 50 мкм он может содержать около 1....
Протокол, описанный в этой статье, предлагает высокоэффективный подход к дифференцировке β подобных клеток из ЧПСК10. В этом процессе используется легко масштабируемая система 2D-культивирования, что позволяет использовать ее в различных экспериментальных условиях, таких .......
Успешная дифференцировка чПСК в β-клетки поджелудочной железы зависит от оптимизации всех аспектов рутинного культивирования и пассажа выбранных ПСК. Это включает в себя обеспечение того, чтобы клеточная линия имела нормальный кариотип, была отрицательной на микоплазменную инфекцию.......
Инес Шеркауи была поддержана стипендией Diabetes UK (BDA 18/0005934) для GAR, которая также благодарит Wellcome Trust за награду исследователя (212625/Z/18/Z), UKRI MRC за грант программы (MR/R022259/1), грант Diabetes UK за проект (BDA16/0005485), CRCHUM за стартап-фонды, Innovation Canada за премию John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) для проектного гранта и CIHR, JDRF для командного гранта (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Камилла Дион и д-р Гарри Лейтч за помощь в создании и культивировании ИПСК человека, Имперский центр биомедицинских исследований NIHR, Лондон.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge Tube | Starlabs | S1615-5500 | |
6-well Cell culture plate | ThermoFisher Scientific | 165218 | |
AggreWell 400 6-well plate | STEMCELL Technologies | 34425 | |
Anti-Glucagon | Sigma-aldrich | G2654-100UL | |
Anti-Insulin | Dako | A0564 | |
Anti-NKX6.1 | Novus Biologicals | NBP1-49672SS | |
Anti-PDX1 | Abcam | ab84987 | |
Aphidicolin | Sigma-Aldrich | A4487 | |
B-27 Supplement (50X), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
Bovine Serum Albumin, fatty acid free | Sigma-Aldrich | A3803-100G | |
Calcium chloride dihydrate | Sigma-Aldrich | C3306 | |
Calcium/Magnesium free D-PBS | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Cyclopamine-KAAD | Calbiochem | 239804 | |
D-(+)-Glucose,BioXtra | Sigma-Aldrich | G7528 | |
Disodium hydrogen phosphate, anhydrous | Sigma-Aldrich | 94046-100ML- | |
DMEM plus GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 10566016 | For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. |
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) | Thermo Fisher Scientific | 10565-018 | |
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | 10149870 | |
Ethanol | VWR | 20821.33 | |
Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 10270098 | |
Gamma-Secretase Inhibitor XX | Thermo Fisher Scientific | J64904 | |
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor Basement | Thermo Fisher Scientific | A1413302 | Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100. |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555 | Thermo Fisher Scientific | A-21435 | |
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647 | Abcam | ab150187 | |
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633 | Thermo Fisher Scientific | A-21052 | |
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568 | Thermo Fisher Scientific | A-11011 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
HEPES buffer | Sigma-Aldrich | H3375-500G | |
Hoechst 33342, Trihydrochloride | Thermo Fisher Scientific | H1399 | |
Human FGF-7 (KGF) Recombinant Protein | Thermo Fisher Scientific | PHG0094 | |
Hydrogen chloride | Sigma-Aldrich | 295426 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen | Agar Scientific | AGG4582 | |
LDN193189 | Sigma-Aldrich | SML0559-5MG | |
Magnesium chloride hexahydrate | Sigma-Aldrich | M9272-500G | |
OCT Compound 118 mL | Agar Scientific | AGR1180 | |
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagents | Thermo Fisher Scientific | 7647-14-5 | |
Penicillin-Streptomycin (PS) | Thermo Fisher Scientific, | 15070-063 | |
Potassium chloride | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | |
Recombinant Human EGF Protein | R&D Systems | 236-EG-200 | |
Rectangular cover glasses, 22×50 mm | VWR | 631-0137 | |
RepSox (Hydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72394 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 61870036 | For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS. |
Shandon Immu-mount | Thermo Fisher Scientific | 9990402 | |
Sodium bicarbonate | Sigma-Aldrich | S6014-500G | |
Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Sodium dihydrogen phosphate anhydrous | Sigma-Aldrich | 7558-80-7 | |
STEMdiff Endoderm | STEMCELL Technologies | 5110 | |
StemFlex Medium | Thermo Fisher Scientific | A3349401 | Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium. |
Stemolecule All-Trans Retinoic Acid | Reprocell | 04-0021 | |
Thyroid Tormone 3 (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
TrypL Express Enzyme (1X) | Thermo Fisher Scientific | 12604013 | |
TWEEN 20 | Sigma-Aldrich | P2287-500ML | |
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension Culture | Thermo Fisher Scientific | 38071 | |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher Scientific | 10977015 | |
Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | 72302 | |
Zinc Sulfate | Sigma-Aldrich | Z4750 |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены