JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье представлен протокол направленной дифференцировки и функционального анализа β-клеточных клеток. Описаны оптимальные условия культивирования и пассажи плюрипотентных стволовых клеток человека перед получением инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Шестиступенчатая дифференцировка прогрессирует от окончательного формирования энтодермы до функциональных β-клеточных клеток, секретирующих инсулин в ответ на глюкозу.

Аннотация

Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут дифференцироваться в любой тип клеток, что делает их отличным альтернативным источником β-клеток поджелудочной железы человека. ПСК могут быть либо эмбриональными стволовыми клетками (ЭСК), полученными из бластоцисты, либо индуцированными плюрипотентными клетками (ИПСК), полученными непосредственно из соматических клеток с помощью процесса перепрограммирования. Здесь представлен видеопротокол, описывающий оптимальные условия культивирования и пассажа ПСК до их дифференцировки и последующей генерации инсулин-продуцирующих клеток поджелудочной железы. Эта методология следует шестиступенчатому процессу направленной дифференцировки β клеток, в ходе которого ПСК дифференцируются в дефинитивную энтодерму (ДЭ), примитивную кишечную трубку, заднюю часть передней кишки, предшественников поджелудочной железы, эндокринных предшественников поджелудочной железы и, в конечном счете, β-клетки поджелудочной железы. Примечательно, что данная методика дифференцировки занимает 27 дней для генерации β-клеток поджелудочной железы человека. Потенциал секреции инсулина оценивали с помощью двух экспериментов, которые включали иммуноокрашивание и стимулированную глюкозой секрецию инсулина.

Введение

Плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) обладают уникальной способностью дифференцироваться в различные типы клеток, что делает их жизнеспособной альтернативой β-клеткам поджелудочной железычеловека1. Эти чПСК подразделяются на два типа: эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), полученные из бластоцисты2, и индуцированные плюрипотентные клетки (ИПСК), полученные путем прямого перепрограммирования соматических клеток3. Разработка методов дифференцировки ЧПСК в β-клетки имеет важное значение как для фундаментальных исследований, так и для клинической практики 1,4. Сахарный диабет является хроническим заболеванием, поражающим >400 миллионов человек во всем мире и возникающим в результате неспособности организма регулировать гликемию из-за сбоя или потериβ-клеток поджелудочной железы. Ограниченная доступность островковых клеток поджелудочной железы для трансплантации препятствует разработке клеточной заместительной терапии диабета 2,4,6,7. Способность генерировать глюкозочувствительные инсулинсекретирующие клетки с помощью чПСК служит полезной клеточной моделью для изучения развития и функционирования островков человека. Он также может быть использован для тестирования потенциальных терапевтических кандидатов для лечения диабета в контролируемой среде. Кроме того, чПСК обладают потенциалом для продуцирования островковых клеток поджелудочной железы, генетически идентичных пациенту, снижая риск иммунного отторжения после трансплантации 2,4,7.

В последние годы были достигнуты значительные успехи в совершенствовании протоколов культивирования и дифференцировки ПСК, что привело к повышению эффективности и воспроизводимости процесса дифференцировки в направлении получения β-клеток поджелудочной железы 8,9.

В следующем протоколе описаны основные этапы направленной дифференцировки β-клеток поджелудочной железы. Он включает в себя регуляцию специфических клеточных сигнальных путей в определенные моменты времени. Он основан на протоколе, разработанном Sui L. et al.10 (2018) для генерации hPSCs в β-клетки поджелудочной железы. Протокол был скорректирован с учетом недавних обновлений Sui L. et al.11 (2021), поскольку последние исследования подчеркивают важность использования лечения афидиколином (APH) для усиления дифференцировки β-клеток. Текущий протокол включает добавление APH в среду на более поздних стадиях процесса. Кроме того, были внесены изменения в состав среды на ранних стадиях дифференцировки по сравнению с первоначальным протоколом. Заметным изменением является добавление фактора роста кератиноцитов (KGF) на 6-й день и продолжающееся до 8-го дня. Фактор роста кератиноцитов (КГФ) вводят с 6-го по 8-й день, что незначительно отличается от исходного протокола10, где КГФ не включался в среду 4-й стадии.

Первым и важным этапом в образовании β-клеточных клеток является направленная дифференцировка ПСК в дефинитивную энтодерму (ДЭ), примитивный зародышевой слой, который дает начало эпителиальной выстилке различных органов, включая поджелудочную железу. После образования ДЭ клетки подвергаются дифференцировке в примитивную кишечную трубку, после чего следует уточнение судьбы задней части передней кишки. Затем задняя часть передней кишки развивается в клетки-предшественники поджелудочной железы, которые обладают потенциалом дифференцироваться во все типы клеток поджелудочной железы, включая эндокринные и экзокринные клетки. Последующая стадия процесса включает эндокринных предшественников поджелудочной железы, дающих начало клеткам, секретирующим гормоны, обнаруженным в островках Лангерганса. В конце концов, процесс дифференцировки достигает своей конечной стадии, образуя полностью функциональные β-клеточные клетки поджелудочной железы 9,10. Важно отметить, что этот процесс является сложным и часто требует оптимизации условий культивирования, таких как специфические факторы роста и компоненты внеклеточного матрикса, для повышения эффективности и специфичности дифференцировки 9,10. Кроме того, получение функциональных β-клеточных клеток из ПСК in vitro по-прежнему остается серьезной проблемой. Текущие исследования сосредоточены на совершенствовании протоколов дифференцировки и усилении созревания и функции полученных β-клеток9.

В этом протоколе использование щадящей диссоциации клеток во время культивирования и пассажа чПСК имеет важное значение для поддержания жизнеспособности и плюрипотентности клеток, значительно повышая эффективность дифференцировки в β-клетки поджелудочной железы. Кроме того, каждая среда, специфичная для конкретной стадии, была тщательно оптимизирована в соответствии с протоколом, разработанным Sui L. et al.10 для обеспечения высокого выхода инсулинсекретирующих клеток в кластерах, которые очень напоминают человеческий островок.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

Перед началом дифференцировки рекомендуется определить необходимое количество островковых органоидов для экспериментальных целей. В 6-луночном планшете одна лунка с более чем 80% слиянием обычно состоит из 2-2,3 миллиона ПСК. Несмотря на то, что точный прогноз является сложной задачей из-за различий в линиях hPSC и эффективности дифференциации, приблизительная оценка в 1,5 раза превышает количество начальных скважин. Эффективно направленная дифференцировка обычно дает от 1,6 до 2 миллионов клеток на лунку в шестилуночных планшетах, охватывая все клетки в кластерах, а не исключительно инсулин-продуцирующие клетки. Для кластера размером 50 мкм он может содержать около 10 000 клеток. В таблице 1 приведена сводная информация о составе среды, используемой для каждого дня/стадии направленной дифференцировки на матриксе стволовых клеток и среде, а также на стимулированном глюкозой буфере секреции инсулина.

1. Пассажирование плюрипотентных стволовых клеток человека перед дифференцировкой в 6-луночных планшетах

Примечание: Надлежащий пассаж стволовых клеток человека перед их дифференцировкой в β-клеточные клетки является решающим шагом в установлении экспериментального процесса. Неправильное разведение пассажа или количество клеток присоединения может поставить под угрозу эффективность и точность дифференцировки.

  1. Приготовьте питательную среду для стволовых клеток, покрытие и растворы для диссоциации (как указано в таблице 1).
  2. За 1-2 ч до пассажа шестилуночную пластину покрыть раствором для холодного покрытия (1 мл на лунку) и инкубировать при 37 °C, 5% CO2.
  3. Нагреть аликвоту питательной среды стволовых клеток при комнатной температуре (15 -25 °C) в течение 20 мин.
  4. Аспирируйте среду стволовых клеток и добавьте 1 мл D-PBS, не содержащего кальция/магния.
  5. Повторите шаг 1.4. дважды.
    ПРИМЕЧАНИЕ: D-PBS добавляется для промывки ячеек и удаления предыдущей среды и соединений. Важно отметить, что для этапов промывки не требуется никаких конкретных временных рамок, так как воздействие D-PBS не повреждает hPSCs, предотвращая разрыв или усадку клеток, вызванных осмосом.
  6. Аспирируйте D-PBS, добавьте 500 мкл раствора диссоциации для каждой лунки и оставьте на 2-5 минут при комнатной температуре (15 - 25 °C).
  7. Пока клетки диссоциируют, аспирируйте раствор для покрытия новой 6-луночной планшета и добавьте 1-2 мл D-PBS, не содержащего кальция/магния, в каждую лунку.
  8. Регулярно проверяйте процесс диссоциации под инвертированным микроскопом.
  9. Отсасывайте раствор диссоциации, когда 80-90% клеток округлились, но все еще прилипают.
  10. Добавьте 1 мл среды стволовых клеток, содержащей 10 мкМ ингибитора ROCK.
  11. Соберите диссоциированные клетки в коническую пробирку объемом 15 мл, используя 1 000 мкл стерильных фильтрованных наконечников для пипеток и пипетку P1000.
  12. Медленно растирайте клеточную суспензию вверх и вниз в пипетке стерильным наконечником пипетки с фильтром на 1000 мкл, чтобы разбить колонии, но не более 10 раз.
  13. Добавьте 1 мл среды стволовых клеток, содержащей ингибитор ROCK, чтобы помочь отделить оставшиеся ПСК, и перенести клеточную суспензию в ту же коническую пробирку объемом 15 мл (1.10).
  14. Аспирируйте D-PBS из только что покрытой пластины и сразу же добавьте клеточную суспензию из конической пробирки объемом 15 мл. Чтобы обеспечить оптимальный рост клеток, высевайте в диапазоне 2 x 105- 1 x 106 жизнеспособных клеток на лунку при использовании 6-луночной пластины (от 1 из 10 до 1 из 50 расщепов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для расчета объема каждая лунка 6-луночного планшета должна содержать 2 мл среды стволовых клеток с ингибитором ROCK.
  15. Быстро перемещайте тарелку вперед и назад, а также из стороны в сторону 5-10 раз.
  16. Поместите планшет в инкубатор с 5%СО2 при температуре 37 °C на 24 ч.
  17. На следующий день заменяют свежей средой стволовых клеток без ингибитора РОК, а затем каждые 2 дня до тех пор, пока слияние ПСК не достигнет 80 - 95%.

2. Направленная дифференцировка β-клеток стволовых клеток человека

ПРИМЕЧАНИЕ: ПСК могут быть использованы для прямого процесса дифференцировки в β-клетки поджелудочной железы при достижении 80-95% конфлюенции.

  1. День -1: Пассаж клеток День -1 дифференцировки:
    1. За 1-2 ч до прохода 6-луночную пластину покрыть раствором для холодного покрытия в инкубаторе с температурой 37 °C, 5% CO2 в течение 1 ч.
    2. Выполните шаги с 1.1 по 1.10 и перейдите к подсчету ячеек.
    3. Загрузите 10 мкл клеточной смеси, добавьте равный объем трипанового синего и аккуратно перемешайте.
    4. Рассчитайте концентрацию клеток. Используйте 0,8 × 106 клеток/мл - 1,0 x 106 клеток/мл среды стволовых клеток, содержащей ингибитор ROCK 10 мкМ, для покрытия покрытой 6-луночной пластины 2 мл среды на лунку.
    5. Быстро перемещайте пластину вперед и назад, из стороны в сторону три раза.
    6. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, 5%CO2 . Быстро перемещайте пластину вперед и назад, а затем снова из стороны в сторону 10 раз. Затем выдерживают планшет в течение 4 ч.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что максимальное прикрепление и равномерное распределение клеток не нарушают клетки, перемещая пластину после помещения в инкубатор. Открывайте и закрывайте инкубатор очень аккуратно.
    7. Поместите бутылку с базальной средой на дни 0-4 при температуре 4 °C, чтобы она оттаяла на ночь.
  2. День 0
    ПРИМЕЧАНИЕ: ПСК должны быть на 80 - 95% сливающимися, не запускайте процесс дифференцировки в окончательную энтодерму под этим слиянием.
    1. На льду размораживают как базальную среду в дни 0-4, так и добавки (см. Таблицу материалов).
    2. Приготовьте в двух конических пробирках только необходимый объем для использования в 1-й день (2 мл на лунку 6-луночного планшета), а в отдельной пробирке удвойте объем на 2,5-й день 4 (2 x 2 мл на лунку 6-луночного планшета). Храните среду со 2,5 по 4 день при температуре 4 °C.
    3. Прогрейте аликвоту необходимого объема среды Day 1 и средства для стирки 1 на водяной бане с температурой 37 °C в течение 5 мин.
    4. Аспирируйте среду стволовых клеток и добавьте 2 мл промывочного средства 1.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Промывочная среда, используемая в протоколе, состоит из базальной среды, специфичной для каждого дня/этапа, дополненной 1% антибиотиками. Этапы промывки, предусмотренные протоколом прямой дифференциации, включают в себя только добавление назначенной промывочной среды (называемой «промывочная среда 1 или 2», Таблица материалов) и последующую аспирацию в соответствии с описанной процедурой 2.2.4. Важно отметить, что для этих этапов стирки не указаны конкретные временные рамки.
    5. Отсасывайте промывочное средство 1 и сразу же добавьте 2 мл средства 1-го дня к стенке лунки.
    6. Инкубируют клетки при 37 °C и 5% CO2 в течение 24 ч.
  3. День 1
    1. Предварительно прогрейте аликвоту необходимого объема среды 2,5-4 дня на водяной бане с температурой 37 °С в течение 5 мин.
    2. Аспирируйте среду 1-го дня и сразу же добавьте 2 мл среды 2,5-4 дня к стенке лунки. Не мойте клетки.
    3. Поместите пластину обратно при температуре 37 °C и 5%CO2 на 36 часов.
  4. Дни с 2,5 по 4
    1. Предварительно подогрейте аликвоту оставшегося объема 2,5-4 суток на водяной бане с температурой 37 °С в течение 5 мин.
    2. Аспирируйте среду и сразу же добавьте 2 мл свежеприготовленной среды 2,5-4 дня к краю лунки.
    3. Поместите пластину обратно при температуре 37 °C и 5%CO2 на 36 часов.
  5. День 4
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии экспрессия окончательных маркеров энтодермы максимальна, и клетки могут инициировать примитивную дифференцировку кишечных трубок.
    1. Приготовьте аликвоту необходимого объема среды 4-го дня примитивной кишки (2 мл на лунку шестилуночной пластины) и прогрейте ее при комнатной температуре (15 °С -25 °С) в течение 20 мин.
    2. Аспират со 2,5 по 4 день и добавьте 2 мл промывочного средства 1.
    3. Аспирируйте промывочное средство 1 и сразу же добавьте 2 мл примитивной кишки на 4-й день в стенку лунки.
    4. Поместите пластину обратно при температуре 37 °C и 5%CO2 на 48 часов.
  6. Дни с 6 по 8
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этой стадии клетки инициируют дальнейшую дифференцировку в заднюю часть передней кишки.
    1. На 6-8 дни приготовьте необходимый объем среды для задней кишки (2 мл на лунку 6-луночной пластины) и прогрейте среду при комнатной температуре (15 °C -25 °C) в течение 20 минут.
    2. Аспирируйте среду на 4-й день и сразу же добавьте 2 мл среды для 6-8-го дня задней кишки сбоку от лунки.
    3. Поместите планшет в инкубатор с температурой 37 °C, содержащий 5%CO2 , на 48 ч.
  7. Дни с 8 по 12
    ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки готовы к дифференцировке предшественников поджелудочной железы.
    1. Приготовьте необходимый объем среды стадии панкреатических предшественников с 8 по 12 день (2 мл на лунку 6-луночного планшета) и прогрейте среду при комнатной температуре (15 °C -25 °C) в течение 20 мин.
    2. Аспират на 6-8 дни и сразу же добавьте 2 мл среды для 6-8 дней задней кишки к краю лунки.
    3. Поместите планшет в инкубатор при температуре 37 °C, содержащий 5%CO2 , на 48 ч.
  8. День 12: Выполнение шага кластеризации
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе клетки образуют плотный монослой и будут переведены в 3D-клеточную культуру для формирования кластеров. Этот этап имеет решающее значение для дифференцировки, чтобы усилить структурное сходство β подобных клеток с нативными человеческими островками, а также улучшить их функциональное сходство как на клеточном, так и на кластерном уровнях11 (рис. 1).
    1. Обработайте 6-луночную планшет, содержащую микролунки размером 400 мкм (как указано в таблице материалов: направленная дифференцировка β-клеток стволовых клеток человека, день 12) 2 мл раствора для промывки против адгезии при комнатной температуре (15 °C - 25 °C).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Микролунка предотвращает прикрепление клеток к дну скважины и облегчает механическое формирование 3D-кластеров.
    2. Центрифужная пластина при 1 300 x g в течение 5 мин.
    3. Проверьте наличие пузырьков под инвертированным микроскопом. Если пузырьков не наблюдается, отсасывайте антиадгезионный промывочный раствор и немедленно добавляйте 2 мл моющего средства 2 (Таблица материалов).
    4. Повторите шаг 1.8.3. два раза.
    5. Подготовьте необходимый объем кластерной среды и прогрейте ее при комнатной температуре (15 -25 °C) в течение 20 мин. Убедитесь, что две лунки 6-луночной планшета входят в одну лунку 6-луночной микролунки 6-луночной планшета с 4 мл кустовой среды.
    6. Аспират панкреатической среды-предшественника и добавление диссоциационного буфера (0,5 мл на лунку).
    7. Выдерживают при комнатной температуре (15 °C - 25 °C) в течение 2-5 мин. Регулярно проверяйте процесс диссоциации под инвертированным микроскопом и аспирируйте диссоциационный буфер, когда большинство клеток округлились, но все еще адгезивны.
    8. Аспирируйте диссоциационный буфер и сразу же добавляйте по 1 мл кластерной среды в каждую лунку.
    9. Диссоциируйте клетки, осторожно пипетируя вверх и вниз шесть раз с помощью пипетки P1000 и наконечников фильтра объемом 1 000 мкл.
    10. Переложите клетки и смесь кластерной среды в коническую пробирку объемом 50 мл.
    11. Добавьте 1 мл кластерной среды, чтобы собрать все оставшиеся клетки.
    12. Добавьте кластерную среду к общему необходимому объему, чтобы в каждой лунке планшета микролунок было 4 мл смеси кластерной среды/ячеек.
    13. Отсасывают промывное средство 2 из микролунок 6-луночной пластины и переносят суспензию ячейки. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 24 ч.
  9. День 13: Работа с клетками после кластеризации и смена их среды, начиная с 13-го дня.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеры очень чувствительны и требуют осторожного обращения, чтобы обеспечить их целостность и жизнеспособность в последующие дни. Поэтому крайне важно внимательно следить за кластерами в течение периода после кластеризации после 12-го дня. Регулярная оценка и корректировка необходимы для достижения успешных результатов в экспериментальном процессе.
    1. Готовят необходимый объем среды 13-го дня (2 мл на лунку 6-луночного планшета) и в отдельной конической пробирке по 50 мл на 15-20 сутки эндокринной среды-предшественника поджелудочной железы.
    2. Медленно собирайте кластеры из планшета с 6 лунками в коническую пробирку объемом 50 мл с помощью пипетки p1000 и фильтрованных наконечников объемом 1 000 мкл.
    3. Добавьте 1 мл среды на 13-й день, чтобы собрать оставшиеся кластеры и перенести кластеры в пробирку.
    4. Дайте клеткам естественным образом застыть под действием силы тяжести на дно конической трубки в течение 5 минут.
    5. Отсасывайте как можно больше надосадочной жидкости из пробирки, не нарушая клеточные кластеры. Наконечники пипеток не должны касаться и аспирировать кластеры, а только надосадочную жидкость.
    6. Добавьте необходимый объем среды на 13-й день следующим образом: 1 лунка микролунки 6-луночная пластина входит в три лунки низкоприкрепленной 6-луночной пластины (2 мл среды на лунку).
    7. Осторожно поднимайте и опускайте пипетку, избегая аспирационных кластеров.
    8. Переложите суспензию на 6-луночную пластину с очень низкой адгезией.
    9. Быстро перемещайте тарелку вперед и назад, из стороны в сторону шесть раз.
    10. Инкубируйте планшет при 37 °C в течение 48 ч.
    11. Выполняйте изменения среды на всех последующих шагах до конца дифференцирования, как описано в разделе 2.9.
  10. Дни с 15 по 20
    1. Каждые 48 ч до 21-го дня дифференцировки переходят на эндокринную среду эндокринной стадии поджелудочной железы, собирая клеточную суспензию в коническую пробирку объемом 50 мл и выполняя шаги 2.9.4–2.9.10 в течение 13-го дня.
  11. Дни с 21 по 27
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе кластеры дифференцируются в β-клетки поджелудочной железы.
    1. Подготавливают среду β-клеточной стадии поджелудочной железы.
    2. Меняйте носитель через день, как описано в течение 15-21 дней.
      ПРИМЕЧАНИЕ: После 25-го дня островковые органоиды могут быть подвергнуты анализу, чтобы подтвердить, что они полностью функциональны.

3. Окрашивание β-клеточных кластеров поджелудочной железы

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните этот шаг для изучения функциональной оценки кластеров после дифференцировки

  1. Соберите от пяти до десяти кластеров в пробирку микроцентрифуги объемом 1,5 мл в конце дифференцировки.
  2. Зафиксируйте клеточные кластеры 200 мкл 4% PFA в течение 15 мин при комнатной температуре.
  3. Добавьте 1 мл PBS к кластерам и удалите PBS наконечником пипетки объемом 1 000 мкл, не повредив кластеры.
  4. Добавьте 200 мкл 30% сахарозы к кластерам и инкубируйте в течение ночи при 4 °C.
  5. Переложите кластеры в криоформу, удалите лишнюю сахарозу, добавьте каплю среды O.C.T. и смешайте кластеры со средой O.C.T.
  6. Заморозьте криомолд на сухом льду и храните при температуре -80 °C.
  7. Вырежьте срезы размером 5 мкм из замороженного блока на предметных стеклах микроскопа с помощью микротома/или криостата.
  8. Храните предметные стекла при температуре -80 °C в морозильной камере до появления пятен.
  9. В день окрашивания достаньте предметные стекла из морозильной камеры с температурой -80 °C.
  10. Осторожно удалите лед вокруг секций криоформы.
  11. Обведите скопления клеток на предметных стеклах гидрофобной ручкой.
  12. Регидратируйте предметные стекла в банке для окрашивания предметных стекол, содержащей PBS, в течение 15 минут.
  13. Добавьте холодный метанол в банку для окрашивания предметных стекол и поместите банку с предметными стеклами при температуре -20 °C на 10 минут.
  14. Погрузите слайды в банку PBS.
  15. Повторите шаг 3.14 три раза.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте этот метод для всех последующих этапов стирки.
  16. Снимите ПБС с предметных стекол и немедленно накройте 100 мкл блокирующего раствора с 2-5% БСА в ПБС-Т.
  17. Добавьте блокирующий раствор на каждое предметное стекло и накройте парафиновой пленкой.
  18. Выдерживают 1 ч при комнатной температуре (15 -25 °С).
  19. Разведите первичные антитела в блокирующем растворе, используя соотношения, указанные в разделе «Реагенты и растворы».
  20. Снимите блокирующий раствор с направляющих.
  21. Сразу же добавьте разбавленные антитела и накройте предметные стекла парапленкой, чтобы предметное стекло не высохло.
  22. Инкубировать в течение ночи при температуре 4 °C.
  23. На следующий день промойте предметные стекла 3 - 5 раз ПБС-Т.
  24. Приготовьте разбавленные вторичные антитела и краситель ДНК.
  25. Удалите излишки PBS-T с предметных стекол.
  26. Добавьте разбавленные вторичные антитела и краситель ДНК. Выдерживать 45 мин при комнатной температуре (15 -25 °C).
  27. Вымойте предметные стекла 3 - 5 раз с помощью PBS-T.
  28. Удалите жидкость с предметных стекол.
  29. Добавьте по капле гистологической монтажной среды в каждый срез.
  30. Накройте предметное стекло крышкой.
  31. Сфотографируйте окрашенные предметные стекла с помощью флуоресцентного микроскопа.

4. GSIS (глюкозостимулированный анализ секреции инсулина)

  1. Приготовьте три разных раствора: раствор KREBS с низким содержанием глюкозы, раствор KREBS с высоким содержанием глюкозы и раствор KREBS с низким содержанием глюкозы и KCl.
  2. Подогрейте все растворы на водяной бане 37 °C.
  3. Осторожно отоберите около 10–15 кластеров одинакового размера с помощью наконечника для пипетки на 1000 мкл и переложите их в пробирку объемом 1,5 мл вместе с небольшим количеством дифференцированной среды, чтобы избежать высыхания кластеров.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Кластеры должны быть видны невооруженным глазом, но если нет, поместите планшет с дифференцированными кластерами под инвертированный микроскоп, чтобы выбрать кластеры и перенести их в пробирку объемом 1,5 мл.
  4. Поместите пробирку с гроздьями и средой на решетку для пробирок и подождите, пока грозди опустятся на дно пробирки.
  5. Медленно аспирируйте надосадочную жидкость с помощью пипетки объемом 200 мкл и добавьте 200 мкл раствора KREBS с низким содержанием глюкозы.
  6. Островки инкубируют в растворе с низким содержанием глюкозы в течение 1 ч при 37 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для обеспечения точной оценки числа кластеров и согласованности в экспериментах рекомендуется проверять наличие всех кластеров в растворе во время переноса, так как они имеют тенденцию прилипать к пробирке.
  7. Извлеките пробирку из инкубатора и медленно аспирируйте 200 мкл раствора KREBS, не аспирируя кластеры.
  8. Добавьте 200 мкл раствора KREBS с низким содержанием глюкозы и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
  9. Аспирируйте объем 200 мкл раствора KREBS с низким содержанием глюкозы в пробирку объемом 500 мкл и немедленно храните ее при температуре -80 °C для измерения инсулина. Повторите эти действия для отдельных процедур.
  10. Для промывки кластеров добавьте в пробирку, содержащую кластеры, 200 мкл раствора KREBS без глюкозы. Дайте кластерам осесть на дно пробирки и осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив кластеры.
  11. Добавьте 200 мкл раствора KREBS с высоким содержанием глюкозы и инкубируйте в течение 30 минут при 37 °C.
  12. Аспирируйте 200 мкл KREBS с высоким содержанием глюкозы в пробирку объемом 500 мкл и немедленно храните ее при температуре -80 °C для измерения уровня инсулина. Повторите эти действия для отдельных процедур.
  13. Для промывки кластеров добавьте в пробирку, содержащую кластеры, 200 мкл раствора KREBS без глюкозы. Дайте кластерам осесть на дно пробирки и осторожно удалите надосадочную жидкость, не потревожив кластеры.
  14. Добавьте 200 мкл раствора KCl KREBS и повторите для отдельных обработок.
  15. Выдерживать 30 мин при температуре 37 °C.
  16. Аспирируйте 200 мкл раствора KCl KREBS в пробирку объемом 500 мкл и немедленно храните ее при температуре -80 °C для измерения уровня инсулина. Повторите эти действия для других процедур.
  17. Добавьте 50 мкл сверхчистой воды и приступайте к измерению общего содержания инсулина.
  18. Добавьте 150 мкл кислого раствора этанола в пробирку с островками и сверхчистой водой.
  19. Хранить образцы при температуре 4 °C в течение ночи (12 - 15 ч).
  20. На следующий день перемешайте каждый образец.
  21. Выполняйте ультразвуковую терапию с помощью электрического ультразвукатора, установленного на мощность 20% в течение 1 с, чтобы обеспечить полный лизис островковой ткани.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Повторяйте шаг 4.21 до тех пор, пока не исчезнут оставшиеся кластеры.
  22. Центрифугируют все образцы при 10 000 × г в течение 10 мин и выдерживают надосадочную жидкость.
  23. Измерьте концентрацию ДНК с помощью нанокапельного спектрофотометра, который затем можно использовать для нормализации показателей инсулина.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Протокол, описанный в этой статье, предлагает высокоэффективный подход к дифференцировке β подобных клеток из ЧПСК10. В этом процессе используется легко масштабируемая система 2D-культивирования, что позволяет использовать ее в различных экспериментальных условиях, таких ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Успешная дифференцировка чПСК в β-клетки поджелудочной железы зависит от оптимизации всех аспектов рутинного культивирования и пассажа выбранных ПСК. Это включает в себя обеспечение того, чтобы клеточная линия имела нормальный кариотип, была отрицательной на микоплазменную инфекцию...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Благодарности

Инес Шеркауи была поддержана стипендией Diabetes UK (BDA 18/0005934) для GAR, которая также благодарит Wellcome Trust за награду исследователя (212625/Z/18/Z), UKRI MRC за грант программы (MR/R022259/1), грант Diabetes UK за проект (BDA16/0005485), CRCHUM за стартап-фонды, Innovation Canada за премию John R. Evans Leader Award (CFI 42649), NIH-NIDDK (R01DK135268) для проектного гранта и CIHR, JDRF для командного гранта (CIHR-IRSC:0682002550; JDRF 4-SRA-2023-1182-S-N). Камилла Дион и д-р Гарри Лейтч за помощь в создании и культивировании ИПСК человека, Имперский центр биомедицинских исследований NIHR, Лондон.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
1.5 mL TubeOne Microcentrifuge TubeStarlabsS1615-5500
6-well Cell culture plateThermoFisher Scientific165218
AggreWell 400 6-well plate STEMCELL Technologies34425
Anti-Glucagon Sigma-aldrichG2654-100UL
Anti-Insulin DakoA0564
Anti-NKX6.1Novus BiologicalsNBP1-49672SS
Anti-PDX1 Abcamab84987
AphidicolinSigma-AldrichA4487
B-27 Supplement (50X), serum free Thermo Fisher Scientific17504044
Bovine Serum Albumin, fatty acid freeSigma-AldrichA3803-100G
Calcium chloride dihydrateSigma-AldrichC3306
Calcium/Magnesium free D-PBSThermo Fisher Scientific14190144
Cyclopamine-KAADCalbiochem239804
D-(+)-Glucose,BioXtraSigma-AldrichG7528
Disodium hydrogen phosphate, anhydrousSigma-Aldrich94046-100ML-
DMEM plus GlutaMAXThermo Fisher Scientific10566016For Washing Medium 2: DMEM plus GlutaMAX 1% PS. 
DMEM/F-12 (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)Thermo Fisher Scientific10565-018
Epredi SuperFrost Plus Adhesion slidesThermo Fisher Scientific10149870
EthanolVWR20821.33
Fetal Bovine SerumThermo Fisher Scientific10270098
Gamma-Secretase Inhibitor XXThermo Fisher ScientificJ64904
Geltrex LDEV-Free Reduced Growth Factor BasementThermo Fisher ScientificA1413302Geltrex 1:1 into cold DMEM/F-12 medium to provide a final dilution of 1:100.
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 555Thermo Fisher ScientificA-21435
Goat Anti-Guinea pig, Alexa Fluor 647Abcamab150187
Goat anti-Mouse Secondary Antibody, Alexa Fluor 633Thermo Fisher ScientificA-21052
Goat anti-Rabbit IgG Secondary Antibody, Alexa Fluor 568Thermo Fisher ScientificA-11011
HeparinSigma-AldrichH3149
HEPES bufferSigma-AldrichH3375-500G
Hoechst 33342, TrihydrochlorideThermo Fisher ScientificH1399
Human FGF-7 (KGF) Recombinant ProteinThermo Fisher ScientificPHG0094
Hydrogen chlorideSigma-Aldrich295426
ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP PenAgar ScientificAGG4582
LDN193189Sigma-AldrichSML0559-5MG
Magnesium chloride hexahydrateSigma-AldrichM9272-500G
OCT Compound 118 mLAgar ScientificAGR1180
PBS Tablets, Phosphate Buffered Saline, Fisher BioReagentsThermo Fisher Scientific7647-14-5
Penicillin-Streptomycin (PS)Thermo Fisher Scientific,15070-063
Potassium chlorideSigma-Aldrich7447-40-7
Recombinant Human EGF ProteinR&D Systems236-EG-200
Rectangular cover glasses, 22×50 mmVWR631-0137
RepSox (Hydrochloride)STEMCELL Technologies72394
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement  Thermo Fisher Scientific61870036For Washing Medium 1: RPMI 1640 plus GlutaMAX 1% PS.
Shandon Immu-mountThermo Fisher Scientific9990402
Sodium bicarbonateSigma-AldrichS6014-500G
Sodium chlorideSigma-AldrichS3014
Sodium dihydrogen phosphate anhydrousSigma-Aldrich7558-80-7
STEMdiff Endoderm STEMCELL Technologies5110
StemFlex MediumThermo Fisher ScientificA3349401Thaw the StemFlex Supplement overnight at 4°C, transfer any residual liquid of the supplement bottle to StemFlex Basal Medium.
Stemolecule All-Trans Retinoic AcidReprocell04-0021 
Thyroid Tormone 3 (T3)Sigma-AldrichT6397
Trypan Blue Solution, 0.4%ThermoFisher Scientific15250061
TrypL Express Enzyme (1X)Thermo Fisher Scientific12604013
TWEEN 20Sigma-AldrichP2287-500ML
Ultra-Low Adherent Plate for Suspension CultureThermo Fisher Scientific38071
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled WaterThermo Fisher Scientific10977015
Y-27632 (Dihydrochloride) STEMCELL Technologies72302
Zinc SulfateSigma-Aldrich Z4750

Ссылки

  1. Kolios, G., Moodley, Y. Introduction to stem cells and regenerative medicine. Respiration. 85 (1), 3-10 (2013).
  2. Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
  3. Martin, G. R. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proceedings of the National Academy of Sciences. 78 (12), 7634-7638 (1981).
  4. Nair, G. G., Tzanakakis, E. S., Hebrok, M. Emerging routes to the generation of functional β-cells for diabetes mellitus cell therapy. Nature Reviews Endocrinology. 16 (9), 506-518 (2020).
  5. Diagnosis and classification of diabetes mellitus. American Diabetes Association. Diabetes Care. 32 (Supplement_1), S62-S67 (2009).
  6. Sui, L., et al. β-Cell Replacement in mice using human Type 1 diabetes nuclear transfer embryonic stem cells. Diabetes. 67 (1), 26-35 (2018).
  7. Rezania, A., et al. Reversal of diabetes with insulin-producing cells derived in vitro from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 32 (11), 1121-1133 (2014).
  8. Hogrebe, N. J., Maxwell, K. G., Augsornworawat, P., Millman, J. R. Generation of insulin-producing pancreatic β-cells from multiple human stem cell lines. Nature Protocols. 16 (9), 4109-4143 (2021).
  9. Jiang, J., et al. Generation of insulin-producing islet-like clusters from human embryonic stem cells. Stem Cells. 25 (8), 1940-1953 (2007).
  10. Sui, L., Leibel, R. L., Egli, D. Pancreatic β-cell differentiation from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Human Genetics. 99 (1), e68(2018).
  11. Sui, L., et al. Reduced replication fork speed promotes pancreatic endocrine differentiation and controls graft size. JCI Insight. 6 (5), 141553(2021).
  12. Veres, A., et al. Charting cellular identity during human in vitro β-cell differentiation. Nature. 569 (7756), 368-373 (2019).
  13. Rutter, G. A., Georgiadou, E., Martinez-Sanchez, A., Pullen, T. J. Metabolic and functional specialisations of the pancreatic β-cell: gene disallowance, mitochondrial metabolism and intercellular connectivity. Diabetologia. 63 (10), 1990-1998 (2020).
  14. Micallef, S. J., et al. INS(GFP/w) human embryonic stem cells facilitate isolation of in vitro derived insulin-producing cells. Diabetologia. 55 (3), 694-706 (2012).
  15. Finch, P. W., Rubin, J. S., Miki, T., Ron, D., Aaronson, S. A. Human KGF is FGF-related with properties of a paracrine effector of epithelial cell growth. Science. 245 (4919), 752-755 (1989).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены