Мануальная терапия при хронической неспецифической боли в пояснице у крысы

Резюме

В этом исследовании предлагается стандартизированная процедура мануальной терапии на крысах с хронической болью в пояснице, которая будет иметь справочное значение для будущих экспериментальных исследований в области мануальной терапии.

Аннотация

Хроническая боль в пояснице (ХЛБП) является широко распространенным заболеванием во всем мире и основной причиной инвалидности. У большинства пациентов с ХЛБП диагностируется хроническая неспецифическая боль в пояснице (ХНЛБП) из-за неизвестной патологической причины. Мануальная терапия (МТ) является неотъемлемым аспектом традиционной китайской медицины и признана в Китае как Туина. Он включает в себя такие техники, как вправление костей и манипуляции с расслаблением мышц. Несмотря на его клиническую эффективность в лечении ХНЛБ, основные механизмы МТ остаются неясными. В экспериментах на животных, направленных на изучение этих механизмов, одной из основных задач является достижение нормативного МТ на крысах модели CNLBP. Улучшение стабильности силы пальцев является ключевым вопросом при МТ. Чтобы устранить это техническое ограничение, в данном исследовании представлена стандартизированная процедура МТ на крысах модели CNLBP. Эта процедура значительно повышает стабильность МТ с руками и облегчает распространенные проблемы, связанные с иммобилизацией крыс во время МТ. Результаты данного исследования имеют справочную ценность для будущих экспериментальных исследований МТ.

Введение

Хроническая боль в пояснице (ХЛБП) характеризуется постоянной болью в пояснице, продолжающейся более 3 месяцев, обычно между грудной клеткой и поперечной линией бедра, с болью в нижних конечностях или без нее ^1,2. Это очень распространенное заболевание, с оценочной глобальной ежегодной распространенностью 38% и распространенностью в течение жизни 39%, что делает его общей проблемой общественного здравоохранения ^3,4. Большинству пациентов с ХЛБП, более 90-95%, не может быть поставлен окончательный патологический и анатомический диагноз (например, опухоль, перелом и инфекция), что приводит к классификации хронической неспецифической боли в пояснице (ХНЛБП)^5,6. Из-за неспецифического характера патологического механизма опиоидные анальгетики и нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) являются основными вариантами лечения в западной медицине, но связаны с проблемами безопасности ^7,8. Поэтому растет спрос на комплементарную и альтернативную медицину, которая является безопасной и эффективной.

Мануальная терапия (МТ), обычно называемая в Китае Туй На, является важным аспектом традиционной китайской медицины (ТКМ) и включает в себя такие методы, как вправление костей и манипуляции с расслаблением мышц. Его широкое использование в Китае объясняется его клинической эффективностью, высоким профилем безопасности и неинвазивностью⁹. При лечении CNLBP было обнаружено, что МТ является эффективным комплементарным и альтернативным средством медицины с доказанной эффективностью, продемонстрированной в предыдущих исследованиях 10,11,12. ТКМ считает, что застой Ци и застой крови являются основными причинами хронической боли, а Туй На облегчает боль, улучшая кровообращение и способствуя притоку Ци к мышцам и мягким тканям. Однако, несмотря на его эффективность, точный механизм, лежащий в основе его терапевтического эффекта, остается неясным.

В области экспериментальных исследований МТ существуют расхождения в реализации вмешательств на животных моделях. В настоящее время большинство исследователей выбирают машинную машинную машинную передачу, в то время как меньшинство выполняет машинную машинную передачу с использованием человеческих рук 13,14,15,16. В то время как машинный МП более стандартизирован, МП более клинически актуален и дает более репрезентативные данные. Тем не менее, МТ на экспериментальных животных затрудняется нестабильной силой пальцев, что приводит к серьезной проблеме в экспериментах на животных и затрудняет сопоставимость экспериментальных результатов. Для преодоления этой технической проблемы в данном исследовании предлагается подходящее решение, которое повышает стабильность силы пальцев во время МТ на крысах модели CNLBP. Осуществимость этого решения проверена, что дает ценные рекомендации для будущих экспериментальных исследований МТ.

протокол

Этот экспериментальный протокол был одобрен Комитетом по уходу за животными и их использованию Чжэцзянского университета традиционной китайской медицины, и все процедуры соответствовали Руководству Национальных институтов здравоохранения по уходу и использованию лабораторных животных. В исследовании использовались взрослые самцы крыс SD (см. Таблицу материалов) с массой тела от 330 г до 350 г. Все крысы содержались в стандартном помещении для животных с циклом «свет-темнота» 12 ч, температурой 24 ± 2 °C и влажностью 50 ± 5%. Крысы были обеспечены достаточным количеством пищи и воды. Следующий протокол содержит подробное описание создания модели CNLBP и процедуры мануальной терапии.

1. Установите модель боли в пояснице в соответствии со следующими шагами (Рисунок 1)

1. Кормите крыс до тех пор, пока они не весят 330-350 г, взвешивайте их, а затем вводите 3% пентобарбитал натрия (1 мл/кг) внутрибрюшинно для обезболивания (см. Таблицу материалов). Подождите 2 минуты, затем осторожно ущипните щипцами четыре пальца задних конечностей, а щипцами коснитесь роговиц крыс, чтобы проверить отсутствие реакции втягивания или моргания, свидетельствующей об успешном проведении анестезии.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Полностью автоклавировать все хирургические инструменты, используемые при моделировании крыс, заранее и стерилизовать спиртом другие неавтоклавируемые инструменты, такие как бритвы, устройства ELFS и термостатические столы. Оператор должен быть одет в чистый лабораторный халат, одноразовые стерильные перчатки, маску, хирургическую шапочку и лицевую маску.
2. Нанесите соответствующее количество ветеринарной мази на глаза крыс, чтобы предотвратить пересыхание из-за длительной невозможности закрыть глаза после анестезии.
3. Поместите крысу в лежачее положение на стол постоянной температуры, найдите ее сегмент L4-6, сбрейте шерсть сегмента и продезинфицируйте его Йодофором 3 раза, прежде чем расстелить одноразовую хирургическую простыню.
4. Хирургическими ножницами разрежьте кожу и фасцию сегмента L4-6, затем разделите скальпелем мышцы по обе стороны остистого отростка поясничных позвонков этого сегмента.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что мышца полностью отделена от остистого отростка и что никакие мышечные волокна не прикреплены к остистому отростку. Кроме того, глубина отделения должна распространяться на поперечный отросток поясничного отдела позвоночника.
5. Просверлите отверстие в середине остистого отростка L4-6 шприцевой иглой объемом 5 мл, затем загрузите систему фиксации внешней ссылки (ELFS) (см. Таблицу материалов) на остистый отросток L4-6.
6. Продезинфицируйте йодофором, затем наложите шов после внутримышечного введения 100 000 единиц пенициллина (см. Таблицу материалов) с каждой стороны раны.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перед наложением швов сдвиньте устройство ELFS вперед, чтобы уменьшить высоту устройства ELFS, затем наложите шов под кожу, чтобы предотвратить инфекцию.
7. Сделайте рентгеновский снимок до того, как крыса придет в себя, чтобы определить, успешно ли присоединено устройство ELFS к остистым отросткам L4-6 (рис. 2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите крысу в лежачее положение за грудиной на стол постоянной температуры (см. Таблицу материалов) после получения рентгенограмм, подождите, пока она придет в себя, затем верните ее в клетку и не оставляйте ее без присмотра, пока она не придет в себя.
8. Как сообщалось ранее¹⁷, кормите каждую модель крысы в одной клетке в течение 2 недель, и если устройство ELFS не отваливается по истечении 2 недель, моделирование CNLBP считается успешным.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В течение послеоперационного периода восстановления у некоторых крыс из-за инфекции развиваются абсцессы в поясничной области; В этом случае используйте шприц объемом 2,5 мл для аспирации гноя, затем промойте рану физиологическим раствором и, наконец, прижмите рану ватным тампоном в течение нескольких секунд.
9. Чтобы крысы не повредили устройства ELFS друг друга, продолжайте держать каждую модель крысы в одной клетке после 2-недельного периода восстановления.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы предотвратить психологическую депрессию у крыс, вызванную кормлением в одной клетке, поместите в клетку пластиковый шарик (см. Таблицу материалов).

2. Методика мануальной терапии на крысах модели CNLBP (рис. 3)

1. Перед МТ проводите упражнения на устойчивость силы пальцев на весовом столе (см. Таблицу материалов) в течение 2 недель. Во время упражнения поддерживайте контролируемое усилие разминания пальцев на уровне примерно 600 g с частотой два раза в секунду. Выполняйте упражнение один раз в день продолжительностью 10 минут каждый раз.
2. Перед МТ акклиматизируйте модельных крыс к крысиному мешку в течение 1 недели. Поместите верхнюю часть тела крысы в мешочек так, чтобы поясничная область и нижние конечности были открыты. Одновременно мягко поглаживайте поясничный отдел крыс, чтобы побудить их принять контакт между пальцами и поясничным отделом.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вырежьте форму куска ткани в форме веера с верхним углом 90° и радиусом 12 см. Затем сшейте две стороны фестончатой ткани вместе, чтобы получился мешочек для крысы (см. дополнительный рисунок S1).
3. Поместите крысу в мешочек для крыс. В это время верхняя половина тела крысы закрыта крысиным мешком, и обнажаются только талия и нижние конечности. Удерживайте верхнюю часть тела крысы в форме буквы «С» недоминирующей рукой, одновременно выполняя МТ в поясничной области крысы доминирующей рукой.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не держите туловище крысы слишком крепко, когда держите его недоминирующей рукой. Грудная клетка крысы будет сжата, и дыхание будет затруднено, если крысу держать слишком крепко. Это также заставит крысу стать очень устойчивой.
4. Найдите точное расположение акупунктурных точек Jiaji (EX-B2). Во-первых, определите расположение остистого отростка L4-6 у крысы. Акупунктурные точки Цзяцзи расположены по обе стороны от L4-6, в 0,5 см от позвоночного остистого отростка. Всего есть шесть акупунктурных точек Цзяцзи.
   Примечание: У крыс шипы L6 находятся на линии двух передних верхних подвздошных отростков, а положения L4 и L5 можно найти, подсчитав вдоль шипов L6.
5. Поместите большой палец на акупунктурную точку Цзяцзи сегмента L4-6 крысы и постепенно увеличивайте интенсивность разминания. Когда модельные крысы демонстрируют сопротивление, такое как извивание конечностей, громкий крик и сильная борьба в спокойном состоянии, сила разминания в это время является максимальным значением давления. Убедитесь, что наиболее подходящее давление немного меньше максимального значения давления, которое является максимальным значением давления, которое крысы могут выдержать, не проявляя сопротивления.
6. Начните с акупунктурной точки Цзяцзи с левой стороны L6. Найдя наиболее подходящий уровень давления для акупунктурной точки Цзяцзи крысы, удерживайте большой палец на этом уровне давления как можно дольше, выполняя разминание с частотой два раза в секунду в течение одной минуты. Повторите то же самое для оставшихся пяти акупунктурных точек Цзяцзи.
7. Если во время процедуры разминания у крыс наблюдается резистентное поведение, прекратите нажатие большим пальцем до тех пор, пока крыса не успокоится, а затем возобновите процедуру. Следите за тем, чтобы процесс замешивания длился 1 минуту для каждой акупунктурной точки, даже если во время процесса есть перерыв.

3. Порог отведения лапы (PWT)

1. Поместите крыс в прозрачную коробку из плексигласа на проволочной сетке за 30 минут до официального теста, чтобы акклиматизировать их к окружающей среде.
2. Используйте нити фон Фрея разных размеров (0,6, 1, 2, 4, 6, 8, 15, 26 г) (см. Таблицу материалов), после того как крысы перестанут исследовать и ухаживать, вертикально стимулируйте середину левой задней лапы, медленно увеличивайте давление до тех пор, пока нити слегка не согнутся, затем прекратите давление и поддерживайте значение давления в течение 5 с.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте более толстого участка кожи в середине задней лапы при стимуляции задних лап нитью.
3. Запишите положительное поведение как X , если крыса демонстрирует реакцию втягивания ног или облизывания ног, и дайте более низкий уровень нити стимула. Запишите отсутствие позитивного поведения в виде О и дайте более высокий уровень нити стимула.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал между двумя соседними раздражителями должен быть больше 30 с.
4. Обнаружите 4x подряд, когда будет получено X , а затем последовательность последовательных X O , а затем преобразуем последовательность в соответствующее значение PWT по методу Чаплана¹⁸.

4. Задержка отведения лапы (PWL)

1. Поместите крыс в аппарат Харгривза (см. Таблицу материалов) на 30 минут до формального испытания, чтобы они могли акклиматизироваться к окружающей среде.
2. Установите следующие параметры прибора: максимальное время воздействия света 20 с; интенсивность светового воздействия 50% (см. дополнительный рисунок S2).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное время воздействия света не должно превышать 20 с, чтобы не обжечь лапы крысы, которые могли бы повлиять на точность последующих тестовых значений.
3. Совместите знак + на тепловом стимуляторе с центром левой задней лапы крысы после того, как крыса перестанет исследовать и ухаживать за собой. Нажмите кнопку «Пуск», и когда крыса начнет поднимать ногу и прибор автоматически перестанет синхронизировать, запишите полученное значение времени. Проведите в общей сложности пять тестов для каждой крысы.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Интервал между каждым тестом для одной и той же крысы составляет не менее 5 минут, чтобы не обжечь кожу задней лапы крысы.
4. Удалите максимальное и минимальное значения из пяти значений, измеренных для каждой крысы, и возьмите среднее из оставшихся трех значений в качестве значения PWL крысы.

5. Окрашивание гематоксилином и эозином (H&E)

1. Обезболивайте крыс пентобарбиталом натрия в конце 2 недель МТ и усыпьте всех крыс путем перфузии сердца после того, как они будут полностью обезболины.
2. Удалите левую поясничную мышцу у крысы L5 и погрузите в 4% параформальдегид (см. Таблицу материалов) для фиксации на 48 часов.
3. Обрежьте ткань до нужного размера и поместите ее в коробку для заделки (см. Таблицу материалов), а затем используйте автоматический дегидратор (см. Таблицу материалов) для обезвоживания.
4. С помощью парафина заделайте ткань, а затем разрежьте ткань на участки толщиной 5 мкм.
5. Закрепите секции на горках и выпекайте 4 часа.
6. Поместите салфетки в автоматический морилку (см. Таблицу материалов) для последующей депарафинизации, окрашивания гематоксилином, дифференцировки, воронения, окрашивания эозина, обезвоживания и прозрачности¹⁹.
7. Загерметизируйте секции нейтральной смолой (см. Таблицу материалов) и оставьте в проветриваемом месте на 24 часа.
8. Отсканируйте слайды с помощью цифрового сканера слайдов (см. Таблицу материалов).

Результаты

В данном исследовании целью было изучение обезболивающего эффекта МТ на крысах модели CNLBP. Для этого 24 крысы были случайным образом распределены по четырем группам, а именно: пустой, фиктивной, модельной и MT-группе, каждая из которых содержала по шесть крыс. Бланковая г...

Обсуждение

В настоящее время отсутствует консенсус по животной модели, которая точно воспроизводит хроническую неспецифическую боль в пояснице (CNLBP). Существует множество животных моделей CNLBP, таких как дисковые, нейрогенные, костно-суставные и мышечные модели²³. Од?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Automatic Dehydrator	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Excelsior AS
Automatic Stainer	Thermo Fisher Scientific Co.,Ltd	Gemini AS
Constant temperature table	Harvard Bioscience (Shanghai) Co.,Ltd	50-1247	Heated small animal operating table usually operated at 37 °C–38 °C
Digital Slide Scanner	HAMAMATSU Co.,Ltd	C13210-01
External link fixation system	Shanghai Naturethink life science & Technology CO., Ltd	custom-made
Embedding box	Citotest Labware Manufacturing Co., Ltd	31050102W
Hargreaves Apparatus	UGO BASILE Co.,Ltd	37370
Neutral Resin	ZSGB-BIO Co.,Ltd	ZLI-9555
Paraformaldehyde	Macklin Co.,Ltd	P804536
Penicillin	Hangzhou Zhengbo Biotechnology Co.,Ltd	ZSQ-100-160A
Plastic ball toys	Shanghai Huake Industrial Co., Ltd.	HK11029-35503
SD rats	Shanghai SLAC Laboratory Animal Co.,Ltd	SCXK (HU) 2022-0004	male, 330-350 g
Sodium pentobarbital	Hangzhou Dacheng Biotechnology Co., Ltd.	P3761
Von Frey filaments	Stoeltingco Co., Ltd.	NC12775
Weighing table	Shanghai Lichen Bangxi Instrument Technology Co., Ltd.	YP20002B