Определение прокоагулянтной активности внеклеточных везикул (ВВ) с помощью EV-активируемого временем свертывания крови (EV-ACT)

Резюме

В этом протоколе исследуется использование плазмы, обогащенной внеклеточными везикулами (ВВ), в качестве индикатора коагуляционной способности ВВ. Плазма, обогащенная EV, получают в процессе дифференциального центрифугирования и последующей рекальцификации.

Аннотация

Роль внеклеточных везикул (ВВ) при различных заболеваниях привлекает все большее внимание, в частности, в связи с их мощной прокоагулянтной активностью. Тем не менее, существует острая необходимость в проведении прикроватного теста для оценки прокоагулянтной активности ВВ в клинических условиях. В данном исследовании предлагается использовать время активации тромбина в плазме, обогащенной ВВ, в качестве меры прокоагулянтной активности ВВ. Стандартизированные процедуры применялись для получения цельной крови с цитратом натрия с последующим дифференциальным центрифугированием для получения плазмы, обогащенной ЭВ. В тестовый стаканчик добавляли обогащенную EV плазму и хлорид кальция, а изменения вязкоупругости отслеживали в режиме реального времени с помощью анализатора. Определено время естественной коагуляции плазмы, обогащенной ВВ, получившей название EV-ACT. Результаты показали значительное увеличение EV-ACT при удалении EV из плазмы, полученной от здоровых добровольцев, в то время как оно значительно снижалось при обогащении EV. Кроме того, EV-ACT был значительно укорочен в образцах человека с преэклампсией, переломом шейки бедра и раком легких, что указывает на повышенный уровень EV в плазме и способствует гиперкоагуляции крови. Благодаря своей простой и быстрой процедуре, EV-ACT является многообещающим в качестве прикроватного теста для оценки свертывающей функции у пациентов с высоким уровнем EV в плазме.

Введение

Тромбоз, вызванный гиперкоагуляцией, играет значительную роль при различных заболеваниях, в том числе при черепно-мозговых травмах¹, преэклампсии², опухолях³ и переломах^{у пациентов 4}. Механизм, лежащий в основе гиперкоагуляции, сложен, и в последнее время особое внимание уделяется роли внеклеточных везикул (ВВ) в нарушениях свертываемости крови. ВВ представляют собой везикулоподобные тела с двухслойной структурой, которые отделяются от клеточной мембраны, диаметром от 10 нм до 1000 нм. Они связаны с различными патологическими процессами, в частности с нарушениями свертываем....

протокол

Сбор образцов для людей был одобрен Комитетом по медицинской этике больницы общего профиля Тяньцзиньского медицинского университета. Сбор венозной крови человека проводился в строгом соответствии с рекомендациями Национальной комиссии здравоохранения Китая, а именно WS/T 661-2020 «Руководство по сбору образцов венозной крови». Вкратце, кровь была взята у здоровых лиц с информированного согласия из передней плечевой вены, и образцы были смешаны с использованием 3,2% цитрата натрия антикоагулянта в соотношении 1:9. Когда были собраны только образцы антикоагулянтов цитрата натрия, первый сосуд для сбора был выброшен. Процесс обработки был начат в течение 0,5 ч после отбо....

Результаты

Время активации тромбина в плазме, обогащенной ЭВ, измеряли с помощью анализатора вязкоупругого метода для измерения времени коагуляции плазмы. Машина состоит из четырех основных компонентов: электронного преобразователя сигналов, зонда, бака для обнаружения и нагревательного элеме?.......

Обсуждение

В данном исследовании было описано получение плазмы, обогащенной ЭВ, а рациональность метода была проверена с помощью проточной цитометрии. В дальнейшем рекальцинированные образцы плазмы анализировали на время АКТ с помощью сгусткового анализатора, основанного на принципах вязкоупр.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
AccuCount Ultra Rainbow Fluorescent Particles	3.8 microm; Spherotech, Lake Forest, IL, USA		For quantitative detection of MP
Calcium chloride	Werfen (china)	0020006800	20 mM
Century Clot analyzer	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd		The principle is to measure plasma viscosity by viscoelastic method
Disposable probe and test cup	Tianjin Century Yikang Medical Technology Development Co., Ltd
LSR Fortessa flow cytometer	BD, USA		Used to detect MP
Megamix polystyrene beads	Biocytex, Marseille, France	7801	The Megamix consists of a mixture of microbeads of selected diameters: 0.5 µm, 0.9 µm and 3 µm.