Поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия для определения структуры амилоида без меток

Резюме

В данной работе описывается, как поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия может быть применена для характеристики локальной организации в безметочных амилоидных суперструктурах-сферулитах. В нем также описывается, как подготовить и измерить образец, собрать необходимую установку и проанализировать данные для получения информации о локальной организации амилоидных фибрилл.

Аннотация

По сравнению со своим однофотонным аналогом, двухфотонное возбуждение выгодно для экспериментов по биовизуализации из-за его меньшей фототоксичности, более глубокого проникновения в ткани, эффективной работы в плотно упакованных системах и уменьшенной угловой фотоселекции флуорофоров. Таким образом, внедрение поляризационного анализа в двухфотонную флуоресцентную микроскопию (2ПФМ) обеспечивает более точное определение молекулярной организации в образце по сравнению со стандартными методами визуализации, основанными на линейно-оптических процессах. В данной работе мы сосредоточимся на поляризационно-чувствительном 2PFM (ps-2PFM) и его применении при определении молекулярного упорядочения в сложных биоструктурах-амилоидных сферулитах. Нейродегенеративные заболевания, такие как болезнь Альцгеймера или Паркинсона, часто диагностируются путем обнаружения амилоидно-белковых агрегатов, образующихся из-за нарушенного процесса неправильного сворачивания белка. Изучение их структуры приводит к лучшему пониманию пути их создания и, следовательно, к разработке более чувствительных методов диагностики. В данной работе представлен ps-2PFM, адаптированный для определения локального порядка фибрилл внутри сферолитов инсулина крупного рогатого скота и сферических амилоидогенных белковых агрегатов. Более того, мы доказываем, что предложенная методика может разрешить трехмерную организацию фибрилл внутри сферулита.

Введение

За последние десятилетия, несмотря на значительное развитие многочисленных методов флуоресцентной микроскопии для биовизуализации белков и их агрегатов¹, лишь немногие из них были использованы для разрешения их локального упорядочения в образце ^2,3. Методом флуоресцентной пожизненной визуализационной микроскопии⁴ изучена внутренняя структурная гетерогенность амилоидных суперструктур-сферолитов. Кроме того, количественное определение локального упорядочения внутри сложных и плотно упакованных биоструктур, таких как сферолиты, может быть решено с помощью поляризаци....

протокол

1. Подготовка предметных стекол микроскопа с полностью выращенными сферулитами

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации обо всех материалах, реагентах и оборудовании, используемых в этом протоколе. Все растворы готовили на деионизированной воде (18,2 МОм·см при 25 °С), полученной из системы очистки воды.

1. Инкубируют амилоидные сферолиты на основе протокола, описанного Krebs et al¹⁶. с некоторыми модификациями, как описано ниже.
   1. Взвесьте 10 мг инсулинового порошка в пробирке объемом 1,5 мл.
   2. Растворяют порошок 1 мл аликво....

Результаты

Представленный протокол содержит пошаговое руководство по подготовке амилоидных суперструктур для испытаний с помощью ps-2PFM, построению микроскопической системы и измерениям соответствующего образца. Тем не менее, перед окончательным набором измерений необходимо правильно выровнят.......

Обсуждение

Поляризационно-чувствительная двухфотонная микроскопия является ценным инструментом для изучения локального упорядочения фибрилл внутри амилоидных суперструктур, требуя лишь небольших модификаций стандартной многофотонной установки. Поскольку он работает с нелинейно-оптическим?.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Sample preparation
Coverslips, 24 x 24 mm	Chemland	04-298.202.04
DPX mountant for histology	Sigma-Aldrich	6522	Slide mountant
Eppendorf Safe-Lock tubes, 1.5 mL, polypropylene	Chemland	02-63102
Eppendorf ThermoMixer C	Eppendorf		Used for spherulite incubation
HLP 5UV Water purification system	Hydrolab		Source of dionized water used in sample preparation
Hydrochloric acid (≥37%, APHA ≤10),	Sigma-Aldrich	30721-M
Insulin powder from the bovine pancreas (≥25 units/mg (HPLC))	Sigma-Aldrich	I5500
Methanol (HPLC grade)	Sigma-Aldrich	270474
Microscope slides with a concave, 76 x 26 x 1 mm	Chemland	04-296.202.09
Olympus BX60	Olympus		Polarized Optical Microscope used in Figure 2
PTFE thread seal tape, 12 mm x 12 mm x 0.1 mm, 60 gm2	Chemland	VIT131097
Microscope ps-2PFM setup
Chameleon Ultra II	Coherent
FELH0800 - Ø25.0 mm Longpass Filter	Thorlabs
FESH0700 - Ø25.0 mm Shortpass Filter	Thorlabs
IDQ100 photon-counting avalanche photodiodes	ID Quantique
Multiphoton short-pass emission filter 720 nm	Semrock
Mounted Achromatic Half-Wave Plate, 690-1200 nm	Thorlabs
Nikon Plan Apo Oil Immersion 100x/1.4 NA	Nikon
piezo 3D stage	Piezosystem Jena
Polarizing Beamsplitter	Thorlabs
S130C - Slim Photodiode Power Sensor, Si, 400 - 1100 nm, 500 mW	Thorlabs
Software
LabView 2018	National Instruments		Version 18.0.1f2
Matplotlib library			Version 3.3.2
NumPy library			Version 1.19.2
SciPy library			Version 1.5.2
Spyder Python 3 IDE			Version 4.1.5