Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол представляет собой комплексный и эффективный метод получения почечных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием условий суспензионного культивирования. Основной акцент в этом исследовании делается на определении начальной плотности клеток и концентрации агонистов WNT, что приносит пользу исследователям, заинтересованным в исследовании органоидов почек.

Аннотация

Органоиды почек могут быть получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью различных подходов. Эти органоиды имеют большие перспективы для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и потенциального терапевтического применения. В данной статье представлена пошаговая процедура создания почечных органоидов из ИПСК, начиная от задней примитивной полосы (ПС) до промежуточной мезодермы (ИМ). Этот подход основан на среде APEL 2, которая представляет собой определенную среду, не содержащую компонентов животного происхождения. Он дополняется высокой концентрацией агониста WNT (CHIR99021) в течение 4 дней, затем фактором роста фибробластов 9 (FGF9)/гепарином и низкой концентрацией CHIR99021 в течение дополнительных 3 дней. Во время этого процесса особое внимание уделяется выбору оптимальной плотности клеток и концентрации CHIR99021 в начале ИПСК, поскольку эти факторы имеют решающее значение для успешной генерации органоидов почек. Важным аспектом этого протокола является суспензионная культура в низкоадгезивной пластине, позволяющая ИМ постепенно развиваться в нефроновые структуры, охватывающие клубочковые, проксимальные канальцевые и дистальные канальцевые структуры, представленные в визуально понятном формате. В целом, этот подробный протокол предлагает эффективную и специфическую технику получения почечных органоидов из различных ИПСК, обеспечивая успешные и стабильные результаты.

Введение

Почка играет важнейшую роль в поддержании физиологического гомеостаза в зависимости от ее функциональной единицы. Нефроны, которые выводят продукты жизнедеятельности, могут регулировать состав жидкостей организма. Хроническая болезнь почек (ХБП), вызванная наследственными мутациями или другими факторами высокого риска, в конечном итоге прогрессирует до терминальной стадии заболевания почек (ЭСКД)1,2. ЕСКД, по-видимому, обусловлен ограниченной способностью нефронов к регенерации. Таким образом, требуется заместительная почечная терапия. Направленная дифференцировка ИПСК человека позволяет генерировать in vi....

протокол

ИПСК, использованные в настоящем исследовании, были получены из коммерческого источника. Клетки поддерживали средой mTeSR на коммерчески доступных пластинах с матричным покрытием базальной мембраны (см. таблицу материалов). В таблице 1 приведены все составы сред, использованные в исследовании.

1. Покрытие ИПСК для дифференцировки и индуцирования задней примитивной полосы (ПС)

  1. Промыть ИПСК на 6-луночном планшете с мембранным матричным покрытием 2 мл DPBS. Аспирируйте DPBS с помощью пипетки.
  2. Добавьте 1 мл коммерчески доступного раствора для отделения клеток (см. та....

Результаты

Выработка IM достигается активацией канонической сигнализации WNT с помощью ингибитора GSK3 CHIR99021 с последующим FGF9/гепарином. С 0-го по 4-й день ИПСК быстро расширяются и приобретают ромбовидную или треугольную форму. Слияние достигает 90%-100% и накапливается равномерно до 7-го дня. При суспенз?.......

Обсуждение

Был описан подробный протокол получения почечных органоидов из ИПСК, включающий незначительные модификации базальной среды, исходной плотности клеток и концентрации CHIR99021. В различных экспериментах было установлено, что критическими факторами для успешной генерации почечных органо?.......

Раскрытие информации

Авторы сообщили об отсутствии потенциального конфликта интересов.

Благодарности

Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Благодарим Национальный клинический исследовательский центр детского здоровья за большую поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху) и Фонд естественных наук провинции Цзянсу (гранты No 1). BK20210150 Ган Вану).

....

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
96 Well Cell Culture Plate, Flat-BottomNESTCat #701003
AccutaseSTEMCELL TechnologiesCat #o7920
Antibodies
Benzyl alcoholSigma-AldrichCat #100-51-6
Benzyl benzoateSigma-AldrichCat #120-51-4
Biological Safety CabinetHaierCat #HR40 figure-materials-705 A2
Biotin anti-human LTL (1:300)Vector LaboratoriesCat #B-1325
Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female)N/AN/A
Carbon dioxide level shakerHAMANYCat #C0-06UC6
Chemicals, peptides, and recombinant proteins
CHIR99021 (Wnt pathway activator)STEMCELL TechnologiesCat #72054
Costar Multiple 6 Well Cell Culture PlateCorningCat #3516
Costar Ultra-Low Attachment 6 Well PlateCorningCat #3471
CryoStor CS10STEMCELL TechnologiesCat #07930
DAPI stain SolutionCoolaberCat #SL7102
Dextran, Alexa Fluor 647Thermo SCIENTIFICCat #D22914
DMEM/F-12 HEPES-freeServicebioCat #G4610
Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647)AbcamCat #ab150179
Donkey serum stosteMeilunbioCat #MB4516-1
D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red)Solarbio Life ScienceCat #D1040
Dry Bath IncubatorShanghai JingxinCat #JX-10
Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)EarthoxCat #E032210
Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032220
Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400)EarthoxCat #E032310
Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032320
Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400)EarthoxCat #E032620
Experimental models: Cell Lines
Forma Steri-Cycle CO2 IncubatorThermo SCIENTIFICCat #370
Geltre LDEV-FreeGibcoCat #A1413202
Glass Bottom Culture DishesNESTCat #801002
Goat anti-human CUBN (1:300)Santa Cruz BiotechnologyCat #sc-20607
Heparin Solution (Cell culture supplement)STEMCELL TechnologiesCat #07980
Human Recombinant FGF-9STEMCELL TechnologiesCat #78161
Inverted MicroscopeOLYMPUSCat #CKX53
Laser Scanning Confocal MicroscopeOLYMPUSCat #FV3000
Methyl celluloseSigma-AldrichCat #M7027
Micro CentrifugeHENGNUOCat #2-4B
Mouse anti-human CD31 (1:300)BD BiosciencesCat #555444
Mouse anti-human ECAD (1:300)BD BiosciencesCat #610182
Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300)AbcamCat #ab30394
Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300)Thermo SCIENTIFICCat #39795
Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88)Sigma-AldrichCat #81381
mTeSR1 5X SupplementSTEMCELL TechnologiesCat #85852
mTeSR1 Basal MediumSTEMCELL TechnologiesCat #85851
Nunc CryoTube VialsThermo SCIENTIFICCat #377267
Others
Rabbit anti-human GATA3 (1:300)Cell Signaling TechnologyCat #5852S
Rabbit anti-human LRP2 (1:300)Sapphire BioscienceCat #NBP2-39033
Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300)AbcamCat #ab224491
Rabbit anti-human WT1 (1:300)AbcamCat #ab89901
Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300)AbcamCat #ab32570
Recombinant Human Serum Albumin (rHSA)YEASENCat #20901ES03
Sheep anti-human NPHS1 (1:300)R&D SystemsCat #AF4269
STEMdiff APEL 2 MediumSTEMCELL TechnologiesCat #05275
Streptavidin Cy3 (1:400)Gene TexCat #GTX85902
Versene (1X)GibcoCat #15040066
Y-27632 (Dihydrochloride)STEMCELL TechnologiesCat #72304

Ссылки

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

IPSCAPEL 2WNTCHIR990219FGF9

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Исследования

Образование

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены