Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Получение почечных органоидов в суспензии из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток
* Эти авторы внесли равный вклад
В этой статье
Резюме
Этот протокол представляет собой комплексный и эффективный метод получения почечных органоидов из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с использованием условий суспензионного культивирования. Основной акцент в этом исследовании делается на определении начальной плотности клеток и концентрации агонистов WNT, что приносит пользу исследователям, заинтересованным в исследовании органоидов почек.
Аннотация
Органоиды почек могут быть получены из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (ИПСК) с помощью различных подходов. Эти органоиды имеют большие перспективы для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и потенциального терапевтического применения. В данной статье представлена пошаговая процедура создания почечных органоидов из ИПСК, начиная от задней примитивной полосы (ПС) до промежуточной мезодермы (ИМ). Этот подход основан на среде APEL 2, которая представляет собой определенную среду, не содержащую компонентов животного происхождения. Он дополняется высокой концентрацией агониста WNT (CHIR99021) в течение 4 дней, затем фактором роста фибробластов 9 (FGF9)/гепарином и низкой концентрацией CHIR99021 в течение дополнительных 3 дней. Во время этого процесса особое внимание уделяется выбору оптимальной плотности клеток и концентрации CHIR99021 в начале ИПСК, поскольку эти факторы имеют решающее значение для успешной генерации органоидов почек. Важным аспектом этого протокола является суспензионная культура в низкоадгезивной пластине, позволяющая ИМ постепенно развиваться в нефроновые структуры, охватывающие клубочковые, проксимальные канальцевые и дистальные канальцевые структуры, представленные в визуально понятном формате. В целом, этот подробный протокол предлагает эффективную и специфическую технику получения почечных органоидов из различных ИПСК, обеспечивая успешные и стабильные результаты.
Введение
Почка играет важнейшую роль в поддержании физиологического гомеостаза в зависимости от ее функциональной единицы. Нефроны, которые выводят продукты жизнедеятельности, могут регулировать состав жидкостей организма. Хроническая болезнь почек (ХБП), вызванная наследственными мутациями или другими факторами высокого риска, в конечном итоге прогрессирует до терминальной стадии заболевания почек (ЭСКД)1,2. ЕСКД, по-видимому, обусловлен ограниченной способностью нефронов к регенерации. Таким образом, требуется заместительная почечная терапия. Направленная дифференцировка ИПСК человека позволяет генерировать in vi....
протокол
ИПСК, использованные в настоящем исследовании, были получены из коммерческого источника. Клетки поддерживали средой mTeSR на коммерчески доступных пластинах с матричным покрытием базальной мембраны (см. таблицу материалов). В таблице 1 приведены все составы сред, использованные в исследовании.
1. Покрытие ИПСК для дифференцировки и индуцирования задней примитивной полосы (ПС)
- Промыть ИПСК на 6-луночном планшете с мембранным матричным покрытием 2 мл DPBS. Аспирируйте DPBS с помощью пипетки.
- Добавьте 1 мл коммерчески доступного раствора для отделения клеток (см. та....
Результаты
Выработка IM достигается активацией канонической сигнализации WNT с помощью ингибитора GSK3 CHIR99021 с последующим FGF9/гепарином. С 0-го по 4-й день ИПСК быстро расширяются и приобретают ромбовидную или треугольную форму. Слияние достигает 90%-100% и накапливается равномерно до 7-го дня. При суспенз?.......
Обсуждение
Был описан подробный протокол получения почечных органоидов из ИПСК, включающий незначительные модификации базальной среды, исходной плотности клеток и концентрации CHIR99021. В различных экспериментах было установлено, что критическими факторами для успешной генерации почечных органо?.......
Раскрытие информации
Авторы сообщили об отсутствии потенциального конфликта интересов.
Благодарности
Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Благодарим Национальный клинический исследовательский центр детского здоровья за большую поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху) и Фонд естественных наук провинции Цзянсу (гранты No 1). BK20210150 Ган Вану).
....Материалы
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 Well Cell Culture Plate, Flat-Bottom | NEST | Cat #701003 | |
| Accutase | STEMCELL Technologies | Cat #o7920 | |
| Antibodies | |||
| Benzyl alcohol | Sigma-Aldrich | Cat #100-51-6 | |
| Benzyl benzoate | Sigma-Aldrich | Cat #120-51-4 | |
| Biological Safety Cabinet | Haier | Cat #HR40  A2 | |
| Biotin anti-human LTL (1:300) | Vector Laboratories | Cat #B-1325 | |
| Blood mononuclear cells hiPS-B1 (iPSc, female) | N/A | N/A | |
| Carbon dioxide level shaker | HAMANY | Cat #C0-06UC6 | |
| Chemicals, peptides, and recombinant proteins | |||
| CHIR99021 (Wnt pathway activator) | STEMCELL Technologies | Cat #72054 | |
| Costar Multiple 6 Well Cell Culture Plate | Corning | Cat #3516 | |
| Costar Ultra-Low Attachment 6 Well Plate | Corning | Cat #3471 | |
| CryoStor CS10 | STEMCELL Technologies | Cat #07930 | |
| DAPI stain Solution | Coolaber | Cat #SL7102 | |
| Dextran, Alexa Fluor 647 | Thermo SCIENTIFIC | Cat #D22914 | |
| DMEM/F-12 HEPES-free | Servicebio | Cat #G4610 | |
| Donkey Anti-Sheep IgG H&L (Alexa Fluor 647) | Abcam | Cat #ab150179 | |
| Donkey serum stoste | Meilunbio | Cat #MB4516-1 | |
| D-PBS (without calcium, magnesium, phenol red) | Solarbio Life Science | Cat #D1040 | |
| Dry Bath Incubator | Shanghai Jingxin | Cat #JX-10 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032210 | |
| Dylight 488-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032220 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Mouse IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032310 | |
| Dylight 549-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032320 | |
| Dylight 649-Goat Anti-Rabbit IgG (1:400) | Earthox | Cat #E032620 | |
| Experimental models: Cell Lines | |||
| Forma Steri-Cycle CO2 Incubator | Thermo SCIENTIFIC | Cat #370 | |
| Geltre LDEV-Free | Gibco | Cat #A1413202 | |
| Glass Bottom Culture Dishes | NEST | Cat #801002 | |
| Goat anti-human CUBN (1:300) | Santa Cruz Biotechnology | Cat #sc-20607 | |
| Heparin Solution (Cell culture supplement) | STEMCELL Technologies | Cat #07980 | |
| Human Recombinant FGF-9 | STEMCELL Technologies | Cat #78161 | |
| Inverted Microscope | OLYMPUS | Cat #CKX53 | |
| Laser Scanning Confocal Microscope | OLYMPUS | Cat #FV3000 | |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | Cat #M7027 | |
| Micro Centrifuge | HENGNUO | Cat #2-4B | |
| Mouse anti-human CD31 (1:300) | BD Biosciences | Cat #555444 | |
| Mouse anti-human ECAD (1:300) | BD Biosciences | Cat #610182 | |
| Mouse anti-human Integrin beta 1 (1:300) | Abcam | Cat #ab30394 | |
| Mouse anti-human MEIS 1/2/3 (1:300) | Thermo SCIENTIFIC | Cat #39795 | |
| Mowiol 4-88 (Polyvinylalcohol 4-88) | Sigma-Aldrich | Cat #81381 | |
| mTeSR1 5X Supplement | STEMCELL Technologies | Cat #85852 | |
| mTeSR1 Basal Medium | STEMCELL Technologies | Cat #85851 | |
| Nunc CryoTube Vials | Thermo SCIENTIFIC | Cat #377267 | |
| Others | |||
| Rabbit anti-human GATA3 (1:300) | Cell Signaling Technology | Cat #5852S | |
| Rabbit anti-human LRP2 (1:300) | Sapphire Bioscience | Cat #NBP2-39033 | |
| Rabbit anti-human Synaptopodin (1:300) | Abcam | Cat #ab224491 | |
| Rabbit anti-human WT1 (1:300) | Abcam | Cat #ab89901 | |
| Rabbit anti-mouse PDGFR (1:300) | Abcam | Cat #ab32570 | |
| Recombinant Human Serum Albumin (rHSA) | YEASEN | Cat #20901ES03 | |
| Sheep anti-human NPHS1 (1:300) | R&D Systems | Cat #AF4269 | |
| STEMdiff APEL 2 Medium | STEMCELL Technologies | Cat #05275 | |
| Streptavidin Cy3 (1:400) | Gene Tex | Cat #GTX85902 | |
| Versene (1X) | Gibco | Cat #15040066 | |
| Y-27632 (Dihydrochloride) | STEMCELL Technologies | Cat #72304 |
Ссылки
- Tekguc, M., et al. Kidney organoids: a pioneering model for kidney diseases. Translational Research. 250, 1-17 (2022).
- Hill, N. R., et al. Global prevalence of chronic kidney disease - a systematic review and met....
Перепечатки и разрешения
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеThis article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены