Сравнение двух репрезентативных методов дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в мезенхимальные стромальные клетки

Fangqin Wang; Langping Gao; Xudong Fu; Qintao Yan; Lidan Hu; Jianhua Mao

doi:10.3791/65729

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

Сравнение двух репрезентативных методов дифференцировки индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека в мезенхимальные стромальные клетки

DOI:

10.3791/65729

⸱

October 20th, 2023

Fangqin Wang¹, Langping Gao²^,³, Xudong Fu⁴, Qintao Yan², Lidan Hu¹^,², Jianhua Mao²^,³

¹National Clinical Research Center for Child Health, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, ²Department of Nephrology, The Children's Hospital, Zhejiang University School of Medicine, ³Zhejiang University School of Medicine, ⁴Liangzhu Laboratory, Zhejiang University

Обратите внимание на то, что все переводы сгенерированы ИИ. Нажмите здесь для версии на английском языке.

Резюме

Этот протокол описывает и сравнивает два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в мезенхимальные стромальные клетки (МСК). Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой. Метод эмбриоидных телец (ЭБ) характеризуется меньшими затратами времени.

Аннотация

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) – это взрослые плюрипотентные стволовые клетки, которые широко используются в регенеративной медицине. Поскольку МСК, полученные из соматических тканей, ограничены ограниченным донорством, вариациями качества и биобезопасностью, в последние 10 лет наблюдается значительный рост усилий по получению МСК из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека (ИПСК). Прошлые и недавние усилия по дифференцировке ИПСК в МСК были сосредоточены вокруг двух методологий культивирования: (1) формирование эмбриоидных телец (ЭБ) и (2) использование монослойной культуры. В этом протоколе описаны эти два репрезентативных метода получения МСК из ИПСК. Каждый метод имеет свои преимущества и недостатки, включая время, стоимость, способность клеток к пролиферации, экспрессию маркеров МСК и их способность к дифференцировке in vitro. Этот протокол демонстрирует, что оба метода могут извлекать зрелые и функциональные МСК из ИПСК. Монослойный метод характеризуется более низкой стоимостью, более простой операцией и более легкой остеогенной дифференцировкой, в то время как метод EB характеризуется меньшими затратами времени.

Введение

Мезенхимальные стромальные клетки (МСК) представляют собой взрослые плюрипотентные стволовые клетки, полученные из мезодермы¹. МСК присутствуют практически во всех соединительных тканях². С тех пор, как МСК были впервые обнаружены в 1970-х годах и успешно выделены из костного мозга в 1987 году Friedenstein et al.3,4,5, для выделения МСК использовались различные соматические ткани человека (включая эмбриональные и взрослые), такие как кости, хрящи, сухожилия, мышцы, жировая ткань и поддерживающая кроветворение строма

протокол

1. Поддержание ИПСК

Размораживание ИПСК
1. Выньте клетки из жидкого азота и быстро разморозьте клетки на водяной бане с температурой 37 °C. Переложите размораживающие ячейки в пробирку объемом 15 мл, приготовленную с 3 мл поддерживающей среды для ИПСК (таблица материалов). Аккуратно перемешайте средство.
2. Центрифуга при 300 x g в течение 5 мин. Удалите надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте клетки в 1 мл поддерживающей среды для поддержания ИПСК с 10 мкМ Y-27632 (пипетками вверх и вниз 2-3 раза).
3. Перенесите клеточную суспензию в 6-луночный планшет для культуры тканей, покрытый гел....

Результаты

В соответствии с протоколом (рис. 1А) ИПСК дифференцировали в МСК методами формирования ЭБ и монослойного культивирования. Во время дифференцировки клетки демонстрировали различную репрезентативную морфологию (рис. 1B, C).

Как пока.......

Обсуждение

В данном протоколе были рассмотрены два репрезентативных метода дифференцировки ИПСК в МСК 20,21,22,23,24,25,26,27,28,30.

Раскрытие информации

Авторам нечего раскрывать.

Благодарности

Мы чрезвычайно благодарны всем членам Лаборатории Мао и Ху, бывшим и нынешним, за интересные дискуссии и большой вклад в проект. Мы благодарны Национальному клиническому исследовательскому центру детского здоровья за огромную поддержку. Это исследование было проведено при финансовой поддержке Национального фонда естественных наук Китая (U20A20351 Цзяньхуа Мао, 82200784 Лидань Ху), Фонда естественных наук провинции Чжэцзян Китая (No. LQ22C070004 Лидань Ху).

....

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alizarin red staining kit	Beyotime Biotechnology	C0148S
Anti-human-CD105 (PE)	Biolegend	323206
Anti-human-CD34 (FITC)	Biolegend	343503
Anti-human-CD45 (APC)	Biolegend	304011
Anti-human-CD73( APC)	Biolegend	344006
Anti-human-CD90 (FITC)	Biolegend	328108
Ascorbic acid	Solarbio	A8100
BMP-6	Novoprotein	C012
Carbon dioxide level shaker	Crystal	CO-06UC6
Compensation Beads	BioLegend	424601
CryoStor CS10	STEMCELL Technology	07959
Dexamethasone	Beyotime Biotechnology	ST1254
DMEM/F12 medium	Servicebio	G4610
Fetal bovine serum	HAKATA	HS-FBS-500
FGF2	Stemcell	78003.1
Gelatin	Sigma-Aldrich	G2500-100G
GlutaMAX	Gibco	35050061
human IgG1 isotype control APC	BioLegend	403505
human IgG1 isotype control FITC	BioLegend	403507
human IgG1 isotype control PE	BioLegend	403503
Human TGF-β1	Stemcell	78067
Human TruStain FcX	BioLegend	422301
IBMX	Beyotime Biotechnology	ST1398
Indomethacin	Solarbio	SI9020
Insulin	Beyotime Biotechnology	P3376
iPSC maintenance medium	STEMCELL Technology	85850
ITS Media Supplement	Beyotime Biotechnology	C0341-10mL
Matrigel, growth factor reduced	BD Corning	354230
Oli Red O staining kit	Beyotime Biotechnology	C0158S
Proline	Solarbio	P0011
Sodium pyruvate	ThermoFisher	11360-070
TGFβ3	Novoprotein	CJ44
Toluidine blue staining kit	Solarbio	G2543
TrypLE Express Enzyme(1x)	Gibco	12604013
Ultra-Low Attachment 6 Well Plate	Costar	3471
Versene	Gibco	15040-66
Y-27632	Stemcell	72304
α-MEM	Hyclone	SH30265
β-glycerophosphate	Solarbio	G8100