Вмешательство Tuina в модели остеоартрита коленного сустава крысы, индуцированной инъекцией монойодоацетата натрия

Резюме

В этом протоколе описаны методы вмешательства Туина в индуцированной инъекцией монойодоацетата натрия модели остеоартрита коленного сустава (КОА) у крыс, что является референсом для применения Туина на животных моделях КОА. Этот протокол также изучает эффективный механизм Туина для КОА, и результаты помогут способствовать его применению.

Аннотация

Остеоартроз коленного сустава (КОА), распространенное дегенеративное заболевание суставов, характеризуется хронической болью и инвалидностью, которая может прогрессировать до непоправимого структурного повреждения сустава. Большое значение имеют исследования связи между суставным хрящом, мышцами, синовиальной оболочкой и другими тканями, окружающими коленный сустав при КОА. В настоящее время лечение КОА включает в себя изменение образа жизни, физические упражнения, лекарства и хирургические вмешательства; тем не менее, выяснение сложных механизмов, лежащих в основе боли, связанной с КОА, до сих пор отсутствует. Следовательно, боль при КОА остается ключевой клинической проблемой и терапевтическим приоритетом. Было обнаружено, что Tuina оказывает регулирующее влияние на двигательную, иммунную и эндокринную системы, что побудило к изучению того, может ли Tuina облегчить симптомы КОА, вызванные повышением регуляции воспалительных факторов, и, кроме того, могут ли воспалительные факторы в скелетных мышцах ускорить прогрессирование КОА.

Мы рандомизировали 32 крыс-самцов Sprague Dawley (SD) (180-220 г) в четыре группы по восемь животных в каждой: antiPD-L1+Tuina (группа A), модель (группа B), Tuina (группа C) и фиктивная хирургия (группа D). Для групп А, В и С в полость правого коленного сустава вводили 25 мкл раствора монойодоацетата натрия (МВД) (4 мг МВД, разведенные в 25 мкл стерильного физиологического раствора), а для группы D – такое же количество стерильного физиологического раствора. Все группы оценивались с использованием наименее или наиболее стрессовых тестов (порог механического вывода лапы, термическая задержка отведения лапы, отек правого коленного сустава, балл по шкале Лекена MG, температура кожи) до инъекции и через 2, 9 и 16 дней после инъекции.

Введение

Остеоартрит коленного сустава (КОА) является распространенным дегенеративным остеоартритом, характеризующимся хронической болью и инвалидностью, а относительно тяжелый КОА приводит к необратимым структурным повреждениям сустава¹. Высокая глобальная распространенность КОА стала серьезной глобальной проблемой общественного здравоохранения ^2,3, что серьезно ухудшает качество жизни пациентов ^4,5. Исследования показали, что КОА поражает более 260 миллионов человек во всем мире⁶. Со старением населения общий уровень распространенности КОА в Китае достигает 17,0% в возрасте старше 40 лет, что ложится тяжелым бременем на семьи заболевших ^7,8.

Согласно китайской медицине, КОА относится к категории «паралича»⁹, а «Классика внутренней медицины Желтого императора» связывает сухожилия, кости и плоть с параличом. Следовательно, мы должны обратить внимание на связь между хрящом, мышцей, синовиальной оболочкой, а также другими тканями вокруг коленного сустава при КОА. В современной медицине воспаление мышц и костей, которые являются основными компонентами иммунного гомеостаза артрита, приводят к прогрессированию боли при КОА. Тем не менее, большинство исследований сосредоточены на воспалении хряща и воспалении синовиальной оболочки в костных суставах, и существует недостаток статей, изучающих воспалительные явления в скелетных мышцах. Таким образом, необходимы дополнительные исследования роли скелетных мышц в воспалении, чтобы получить более полное представление о КОА и предоставить идеи для более эффективных методов лечения. В обзоре литературы мы обнаружили, что ингибирование иммунозависимого фактора лиганда программируемой смерти 1 (PD-L1) усугубляло прогрессирование КОА 10,11 и что наблюдалась дифференциальная экспрессия IL-15 и ^FOXO1 в скелетных мышцах пациентов с КОА^12, а также значительное воспаление скелетных мышц у пациентов с терминальной стадией КОА. что также было связано с изменениями походки. Было показано, что скелетные мышцы также могут секретировать факторы, тесно связанные с воспалительным иммунитетом, такие как IL-6, и что TNF-α также тесно связан с путем PD-L1 и KOA^13,14,15.

В настоящее время доступные методы лечения КОА включают контроль веса, физические упражнения, лекарства и хирургическое вмешательство, которые обычно включают внутрисуставные инъекции, обезболивающие препараты, артроскопическую хирургию и перипротезную остеотомию коленного сустава¹⁶. В настоящее время прогрессирование КОА не может быть полностью остановлено или обращено вспять, и без четкого понимания сложных механизмов, лежащих в основе боли при КОА, пациенты с КОА подвергаются риску чрезмерного использования обезболивающих препаратов и высокой частоты побочных эффектов⁸. Большинство стратегий лечения эффективны только в течение коротких периодов времени и сосредоточены только на временном облегчении симптомов, а не на патогенезе заболевания. Таким образом, боль при КОА остается приоритетом и проблемой для лечения, представляя собой серьезную клиническую проблему. Тем не менее, Tuina может напрямую стимулировать скелетные мышцы вокруг пораженного сустава при лечении КОА и может обеспечить некоторые преимущества. В сочетании с предыдущим описанием, это идеальная терапия для изучения роли скелетной мышечной ткани в КОА, а выяснение роли скелетной мышечной ткани в воспалении также может обеспечить лучшую теоретическую поддержку Tuina of KOA.

Исследования показали, что массажная терапия, остеопатическая манипулятивная терапия и манипуляции с позвоночником могут помочь облегчить боль и восстановить функции организма^17,18. Эти манипуляции могут воздействовать на местное воспаление и снимать спазмы и анальгезию посредством внешнего механического воздействия. Они могут облегчить боль после тотального эндопротезирования коленного сустава, сократить использование обезболивающих препаратов, способствовать послеоперационному восстановлению и улучшить биомеханический баланс¹⁹. Шведский массаж применим при лечении остеоартрита, может уменьшить стресс и улучшить качество жизни²⁰. Терапевтическому действию Туйны на КОА предшествовали определенные исследования.

В этом эксперименте наша команда будет изучать, может ли экспрессия PD-L1 и связанных с ним воспалительных факторов в скелетных мышцах индуцировать КОА и способствовать его развитию, основываясь на модели КОА, индуцированной МИА, у крыс. Также будет внедрен Tuina, чтобы увидеть, может ли он облегчить симптомы КОА, вызванные повышенной экспрессией воспалительного фактора. Tuina будет комбинирован с ингибированием PD-L1, чтобы продемонстрировать связь между Tuina-опосредованным PD-1 путем в воспалении скелетных мышц, влияющим на развитие КОА и боль, закладывая основу для дальнейших многоуровневых исследований терапевтических механизмов вмешательства Tuina при KOA.

Таким образом, в данной работе описывается исследование и разработка механизмов воспаления скелетных мышц при развитии КОА и его боли, а также терапевтическое влияние Туйна на КОА с точки зрения экспрессии иммуновоспалительных факторов в сочетании с поведенческими показателями, чтобы предоставить современные научные доказательства теории «дисбаланса сухожилий и костей» в традиционной китайской медицине.

протокол

Все эксперименты были одобрены и контролировались Комитетом по уходу за животными и их использованию Шанхайского университета традиционной китайской медицины (номер одобрения: SYXK2018-0040), что соответствует положениям Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации.

1. Подготовка животных

1. Крысы-самцы Дома 32 Sprague Dawley (SD) в возрасте 8 недель и массой тела 180-220 г в специальном аппарате, свободном от патогенов, при циклах 12 ч света / 12 ч темноты при 24 ± 2 °C и влажности 60% со стандартным гранулированным кормом для грызунов. Все экспериментальные операции на животных соответствуют этике благополучия экспериментальных животных и правилам безопасности при проведении экспериментов на животных.
2. Рандомизируйте крыс и разделите их на четыре группы по восемь животных в каждой после 1 недели адаптивного кормления: antiPD-L1+Tuina (группа A), модель (группа B), Tuina (группа C) и фиктивная хирургия (группа D).

2. Внутрисуставная инъекция йодоацетата натрия (МИА) в коленный сустав

ПРИМЕЧАНИЕ: За исключением группы D, модель крысы КОА будет подготовлена путем инъекции МИА в полость коленного сустава во всех группах. Для группы D ввести 25 мкл стерильного физиологического раствора в полость правого коленного сустава.

1. Обезболивайте крысу, поместив ее в клетку с анестетиком, а затем вводя 2,5% изофлурана до полного обезболивания. Убедитесь, что животное полностью обезболино, дождавшись момента, когда молодая крыса будет лежать на спине, ее конечности перестанут двигаться, и нет реакции в виде щипки пальца ноги (педальный рефлекс), пальпебрального рефлекса и расслабления мышц.
2. Добавляйте глазную мазь и глазные капли к молодым крысам, находящимся под наркозом, чтобы предотвратить сухость глаз.
3. Побрейте правую заднюю конечность крыс и продезинфицируйте коленный сустав тремя чередующимися приемами йодофора и 75% этанола.
4. Для поддержания стандартизированного экспериментального состояния осторожно фиксируйте сгибание колена под точным углом 90°, следя за тем, чтобы связка надколенника была ориентирована вверх. В дальнейшем в правую полость коленного сустава крыс вводят 25 мкл раствора МИА, состоящего из 4 мг МВД, разведенных в 25 мкл стерильного физиологического раствора.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Эта инъекция проводилась с помощью специализированного микроинъектора, обеспечивающего точность и последовательность процедуры^21,22,23. Сажайте крыс обратно в клетки, пока они не проснутся. Животное, перенесшее операцию, не возвращают в компанию других животных до полного выздоровления.
5. В конце исследования крыс усыпили, введя 1% пентобарбитал натрия в дозе 100 мг/кг.

3. Внедрение Tuina

ПРИМЕЧАНИЕ: При внедрении Tuina будет руководствоваться теорией о том, что «для пациентов с дисбалансом сухожилий и костей сухожилия необходимо лечить в первую очередь». Обе группы А и В начали вмешательство в первый день после успешной оценки модели, и обе группы оперировались один раз в день в течение 14 дней. За остальными двумя группами наблюдали только в течение 14 дней без какого-либо вмешательства. Операторы манипуляции должны быть строго обучены перед экспериментом, чтобы обеспечить постоянство силы, частоты и ритма.

1. Точно определите акупунктурную точку крысы, включая EX-LE4, ST35, SP10, ST34, SP9 и GB34 (рис. 1 и таблицу 1), где будут выполняться методы разминания пальцев с помощью экспериментальной акупунктуры²⁴.
2. Зафиксируйте крысу в положении лежа на приспособлении для фиксации крыс.
3. После того, как он успокоится и нижние конечности будут расслаблены, разминайте EX-LE4 и ST35 пораженной конечности большим и указательным пальцами одновременно в течение 4 мин со скоростью 120-140 раз/мин.
4. Разминать передние и медиально-боковые мышцы пораженной конечности большим и указательным пальцами в течение 3 мин со скоростью 120-140 раз/мин, уделяя особое внимание SP10, ST34 и мышцам возле коленного сустава. Подчеркните манипуляции с этими жесткими мышцами с такой интенсивностью, чтобы крыса не сопротивлялась.
5. Разминайте задние икроножные мышцы пораженной конечности сверху вниз в течение 3 мин со скоростью 120-140 раз/мин большим, указательным и средним пальцами. Чтобы полностью обнажить обрабатываемую область, безымянным пальцем и мизинцем возьмитесь за голеностопный сустав пораженной конечности и осторожно потяните за пораженную конечность. Сосредоточьтесь на SP9, GB34 и мышцах возле коленного сустава с акцентом на ригидные мышцы и интенсивность, чтобы крыса не сопротивлялась.

4. Измерение поведенческого индекса

1. Измерение болевого порога подошвенного механического
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измеряйте пороговые значения подошвенной механической боли за 1 день до инъекции МИА, а также через 2, 9 и 16 дней после инъекции.
   1. Доставить крыс в подошвенную испытательную комнату с решетчатым дном из нержавеющей стали и пластиковым корпусом клетки в тихой обстановке при комнатной температуре (22 ± 2) °C в течение 30 минут адаптации.
   2. Используйте электронный механический болевой тестер с пластиковой тестовой иглой диаметром 0,8 мм для стимуляции центральной области правой задней лапы крыс вертикально. Равномерно и постепенно увеличивайте интенсивность стимуляции до тех пор, пока у крыс не проявятся реакции втягивания лап и избегания.
   3. Запишите показания электронного экрана как механический болевой порог правой подошвенной стопы крысы.
   4. Измерьте каждую крысу 5 раз с интервалом в 5 минут.
   5. Удалите максимальное и минимальное значения из пяти значений. В качестве результата возьмем среднее значение трех средних значений методом усеченного среднего (табл. 2).
2. Измерение механического порога отведения лапы
   ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте порог механической отмены лапы за 1 день до инъекции МИА, через 2, 9 и 16 дней после инъекции.
   1. Поместите крыс в отапливаемую подошвенную испытательную комнату со стеклянным дном 30 °C и пластиковым корпусом клетки в спокойной обстановке при комнатной температуре (22 ± 2) °C в течение 30 минут адаптации.
   2. Стимулируйте правую заднюю подошвенную центральную область с помощью нагревательного устройства источника света при температуре стимуляции 65 °C до тех пор, пока крыса не покажет реакцию втягивания лапы и избегания.
   3. Запишите показания электронного экрана в качестве правого подошвенного теплового болевого порога крысы.
   4. Измеряйте каждую крысу 5 раз непрерывно с интервалом в 5 минут.
   5. Удалите максимальное и минимальное значения из пяти значений. В качестве результата возьмем среднее значение трех средних значений методом усеченного среднего (табл. 3).

5. Измерение отека правого коленного сустава

ПРИМЕЧАНИЕ: Измеряйте отек правого коленного сустава крыс за 1 день до инъекции МИА, через 2, 9 и 16 дней после инъекции.

1. Обезболивайте крысу, поместив ее в клетку с анестетиком и подвергнув воздействию 2,5% изофлурана до полного обезболивания.
2. Положите крысу в горизонтальное положение на операционном столе.
3. Измерьте ширину правого коленного сустава штангенциркулем (рисунок 2 и таблица 4).

6. Измерение балла Lequesne MG

ПРИМЕЧАНИЕ: Измерьте показатель Lequesne MG у крыс через 2, 9 и 16 дней после инъекции MIA. Lequesne et al. разработали индекс тяжести остеоартрита тазобедренного сустава (ISH), который может быть использован для оценки эффективности терапевтических вмешательств. Мы учитываем четыре параметра: болевую стимуляцию, изменение походки, подвижность суставов и отек суставов.

1. Подведите крыс к манипуляционной платформе в тихом месте при комнатной температуре (22 ± 2) °C.
2. Попросите двух операторов, слепых друг к другу, измерить местную реакцию на болевую стимуляцию, изменение походки, движения суставов и отек суставов.
   1. Простимулируйте латеральную сторону правого коленного сустава пластиковой тестовой иглой и оцените по шкале от 0 до 3 в соответствии с ответом. 0 — нет ответа; 3 хороший отклик; 1 сокращение пораженной конечности; 2 сокращение и спазм пораженной конечности, сопровождающиеся легкими генерализованными реакциями, такими как дрожь, облизывание и сосание.
   2. Положите крысу на операционный стол и понаблюдайте за походкой ее правых задних конечностей. Оценка по шкале от 0 до 3 в соответствии с ответом. 0 – отсутствие нарушений в движении пораженной конечности, нормальный бег и сильная работа ног; 3 пораженная конечность не может участвовать в ходьбе, касаться земли или топтать по земле; 1 мягкий треккинг во время бега с сильными толчками; 2 Пораженная конечность участвует в ходьбе, но нарушение в движении крыс (треккинг) очевидно.
   3. Сгибайте и разгибайте правый коленный сустав крысы рукой и наблюдайте за подвижностью сустава. Оценка по шкале от 0 до 3 в соответствии с ответом. 0 угол подвижности сустава более 90°; 3 угол подвижности сустава менее 15°; 1 угол подвижности сустава или 45°-90°; 2 Угол подвижности сустава 15°-45°.
   4. Дотроньтесь до правого коленного сустава крысы и сравните реакцию с реакцией нормальной крысы. Оценка по шкале от 0 до 2 в соответствии с ответом. 0 отсутствие явных отеков и видимых костных отметин; 2 выраженные припухлости и отсутствие костных отметин; 1 Легкая припухлость и поверхностные костные отметины.
   5. Сложите эти баллы, чтобы получить оценку Lequesne MG для каждой крысы, и вычислите среднее значение с помощью метода усечения (Таблица 5).

7. Измерение температуры кожи

ПРИМЕЧАНИЕ: Измеряйте температуру кожи за 1 день до инъекции МИА и через 9 и 16 дней после инъекции.

1. Обезболивайте крысу, поместив ее в клетку с анестетиком, а затем вводя изофлуран до полного обезболивания.
2. Поместите крысу на операционный стол в боковом положении при комнатной температуре (22 ± 2) °C.
3. Выпрямите правый коленный сустав, осторожно обхватив стопу рукой. Фотографируйте для определения температуры кожи с помощью инфракрасной камеры Filr.
4. Считывание температуры кожи коленного сустава и вокруг коленного сустава крысы с помощью вспомогательного программного обеспечения для редактирования. Установите контрольные точки в голеностопном и коленном суставах, где температура постепенно снижается.

8. Статистический анализ

1. Используйте статистическое программное обеспечение для выражения экспериментальных данных в квартилях.
2. Используйте метод trim mean для работы с выбросами. Результаты поведенческих тестов отмечаются как среднее значение ± стандартная ошибка среднего значения.
3. Выполните t-критерий независимых выборок для сравнения между группами. Проанализируйте поведенческие данные с помощью двустороннего дисперсионного анализа с повторной мерой (ANOVA) с последующим многократным сравнением тестов Бонферрони. В тех случаях, когда данные не демонстрируют нормальности или гомоскедастичности, проводят непараметрический тест (выборки k-Краскела-Уоллиса).
   ПРИМЕЧАНИЕ: P < 0,05 указывает на то, что различия являются статистически значимыми. Все данные соответствуют допущениям применяемых статистических тестов.

Результаты

Описанный протокол был внедрен в клинических условиях Юэянской больницы интегрированной традиционной китайской и западной медицины. На рисунке 1 показано точное расположение акупунктурных точек у крыс, а в таблице 1 показаны общие преимущества стимуляции эти...

Обсуждение

Это исследование направлено на оценку улучшения КОА после вмешательства Туина с использованием стандартизированных поведенческих индикаторов и изучение механизмов КОА Туина и связи между скелетными мышцами и КОА. В отличие от фармакологической и хирургической терапии, Туина оказыв?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Anti-PD-L1	Abcam, Cambridge, MA, USA	ab80276
electric von Frey esthesiometer	IITC/Life Science, Woodland Hills, CA, USA	ALMEMO 2450
GraphPad Prism 9.0	GraphPad Software		Software for stastistical analysis
monosodium iodoacetate	Sigma-Aldrich Inc	I9148	Resolved into normal saline for injection
pentasorbital sodium	Sigma-Aldrich Inc	P3761
Sprague Dawley (SD) male rats	Shanghai Jihui Experimental Animal Breeding Co., Ltd	No. SCXK (Hu) 2017-0012
thermal analgesia tester	IITC/Life Science	Model 390