Применение окрашивания живых митохондрий при сортировке клеток для очистки гепатоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

Summary

Гепатоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, могут быть очищены путем сортировки клеток с использованием комбинации окрашивания митохондриальными и активированными молекулами адгезии лейкоцитарных клеток (ALCAM, также известными как CD166).

Abstract

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭС) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПКС) имеют потенциальное применение в клеточной регенеративной медицине для лечения тяжелобольных органов благодаря их неограниченной пролиферации и плюрипотентным свойствам. Тем не менее, дифференциация человеческих ES/iPS-клеток в 100% чистые типы клеток-мишеней является сложной задачей из-за их высокой чувствительности к окружающей среде. Онкогенез после трансплантации вызывается загрязненными, пролиферирующими и недифференцированными клетками, что делает технологию высокой очистки необходимой для безопасной реализации регенеративной медицины. Для снижения риска онкогенеза была разработана технология высокой очистки гепатоцитов человека, полученных из iPS-клеток. В методе используется FACS (флуоресцентно-активируемая сортировка клеток) с использованием комбинации высокого содержания митохондрий и маркера клеточной поверхности ALCAM (активированная молекула адгезии лейкоцитарных клеток) без генетической модификации. 97% ± 0,38% (n = 5) очищенных гепатоцитов, использующих этот метод, проявляли экспрессию белка альбумина. Целью данной статьи является предоставление подробных процедур для этого метода применительно к самому современному методу двумерной дифференцировки iPS-клеток человека в гепатоциты.

Introduction

Эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ЭС и ИПК соответственно) считаются перспективными источниками клеток для регенеративной терапии. Тем не менее, эффективность дифференцировки этих клеток в конкретные типы клеток-мишеней может варьироваться, даже при использовании одной и той же клеточной линии, протокола и экспериментатора 1,2,3,4. Эта изменчивость может быть связана с высокой чувствительностью клеток ES/iPS человека к окружающей среде. Поэтому в настоящее время сложно стабильно получать чистые клетки-мишени. Для достижения высокобезопасной регенеративной медицины крайне важно элиминировать пролиферативные клетки и недифференцированные стволовые клетки в терапевтических клетках, а также передовая технология очистки клеток-мишеней ^5,6,7.

Сортировщик клеток — это устройство, которое мгновенно анализирует отдельные клетки и сортирует интересующие их живые клетки на основе уровня флуоресцентного сигнала, предлагая многообещающее решение. Это может быть достигнуто путем окрашивания антителами поверхностных маркеров, специфичных для типа клеток, или путем использования экспрессии репортерных генов, специфичных для типа клеток. Существует несколько сообщений о методах очистки кардиомиоцитов ^8,9,10, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, и гепатоцитов^11,12. Hattori et al. разработали инновационный метод митохондриальной очистки с использованием клеточного сортировщика¹³. Учитывая тот факт, что кардиомиоциты обладают высокими энергетическими потребностями благодаря митохондриальной активности, окрашивание клеток живым митохондриальным красителем TMRM (метиловый эфир тетраметилродамина) может быть использовано для мечения и высокой очистки кардиомиоцитов с помощью FACS из эмбриоидных телец человеческих ES-клеток, содержащих различные типы клеток. Отсутствие онкогенности было подтверждено анализами на образование тератомы с очищенными кардиомиоцитами. Кроме того, Ямасита и др. неожиданно открыли метод очистки гепатоцитов из эмбриоидных телец человека, полученных из ES-клеток, путем выделения фракций с высокой митохондриальной активностью и ALCAM-положительной^{экспрессией}. Обоснование этого метода заключается в том, что гепатоциты также имеют относительно большое количество митохондрий из-за высокого потребления ими АТФ для метаболизма питательных веществ и детоксикации15, а гепатоциты экспрессируют ALCAM, члена суперсемейства иммуноглобулинов, который играет роль в адгезии и миграции ^{клеток16}.

Предыдущие высокоочищающие методы для гепатоцитов, полученных из плюрипотентных стволовых клеток, требовали генетических модификаций, а негенетические методы очистки имели низкую эффективность^. Митохондриальный негенетический метод имеет достоинства для достижения высокой чистоты. Когда необходимы печеночные клетки-предшественники, можно выбрать методы^на основе CD133 и CD13- или Dlk1 ^18,19. Несмотря на то, что точность технологии редактирования генома продвинулась вперед, потенциальный риск непредвиденных изменений генома (например, канцерогенеза) не может быть полностью устранен. Методы, основанные на митохондриальной активности, без привлечения генетической модификации, могут быть свободны от таких рисков.

В результате исследования различных митохондриальных показателей в кардиомиоцитах новорожденных крыс наблюдалось полное исчезновение ТМРМ в течение 24 ч, в то время как другие красители сохранялись в течение не менее 5 дней¹³ дней. Кроме того, важно отметить, что TMRM и JC-1 не влияли на жизнеспособность клеток при оценке с помощью анализа 3-(4,5-диметил-тиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолия бромида (МТТ), в то время как другие красители продемонстрировали различное влияние на жизнеспособность^{клеток13}. TMRM демонстрирует более высокую безопасность.

На сегодняшний день разработано несколько методов двумерной (2D) дифференцировки в качестве более эффективных подходов к индуцированию дифференцировки по сравнению с трехмерным (3D) формированием эмбриоидного тела. Это связано с тем, что пошагово индуцирующие дифференцировку соединения или цитокины могут быть равномерно введены в клетки в двумерной плоскости, а не в трехмерном пространстве. В данном исследовании ранее описанный метод²⁰ был модифицирован для индуцирования дифференцировки в гепатоциты, полученные из iPS-клеток человека. В данной работе подробно описаны процедуры современной 2D-дифференцировки и очистки гепатоцитов, полученных из iPS-клеток человека.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

В этом исследовании использовались коммерчески полученные человеческие iPS-клетки (штамм 253G1) (см. Таблицу материалов).

1. Поддержание iPS-клеток человека

1. Поддерживайте iPS-клетки человека в безпитательных условиях в среде AK02 на чашках для культур, покрытых 0,25 мкг/^см2 iMatrix-511 (см. Таблицу материалов).

2. Печеночная дифференцировка iPS-клеток человека в 2D-культурах

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1А приведен ежедневный график печеночной дифференцировки. На протяжении всего процесса используйте 6-луночные планшеты для культивирования и добавляйте 2 мл специальной промывочной или питательной среды в каждую лунку. Поддерживайте состояние клеточной культуры при 100% влажности, 5%_CO2 и 20%_O2 при 37 °C.

1. Смажьте каждую лунку 6-луночного планшета 1 мл матрицы базальной мембраны (разбавленной на 1/25 PBS (-)) и инкубируйте при 37 °C в течение 1 ч.
2. Пропустите человеческие iPS-клетки на покрытую оболочкой чашку с плотностью 20 000-30 000 клеток/см² с использованием среды AK02N с добавлением 10 μМ ингибитора ROCK (Y-27632) (см. Таблицу материалов). Замените среду без Y-27632 на следующий день и культуру еще на 2 дня.
3. Промойте клетки один раз средой RPMI-1640. Инициируйте дифференцировку энтодермы, заменив среду на RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2% инсулин B27 + 1% дипептид L-аланил-L-глутамин) с добавлением 3-6 мкМ CHIR-99021 и 100 нг/мл активина А в течение 24 ч (см. таблицу материалов).
4. Замените среду на RPMI-B27-Glu с добавлением 50 нг/мл активина А на 24 ч.
5. Чтобы вызвать дифференцировку печеночных предшественников, замените среду на RPMI-B27-Glu с добавлением 1% диметилсульфоксида (ДМСО) на 5 дней.
6. Чтобы ускорить созревание гепатоцитов, переключитесь на среду для созревания гепатоцитов: среду L-15 Лейбовица, содержащую 10 мкМ гидрокортизона 21-гемисукцината, 8,3% триптозофосфатного бульона, 100 нМ дексаметазона (DEX), 50 мкг/мл натрия-L-аскорбата, 0,58% инсулин-трансферрин-селена (ITS), 8,3% фетальной бычьей сыворотки (FBS), 2 мМ дипептида L-аланил-L-глутамина и 100 нМ N-гексаноевого-три-иле-(6)-аминогексанового амида (Дигекса) (см. Таблицу материалов).
7. Меняйте носитель каждые 2 дня в течение 20 дней. Отсортируйте клетки примерно через 27 дней после начала дифференцировки.

3. Клеточный препарат для очистки гепатоцитов iPS-клеток человека

1. Печеночные дифференцированные клетки промывают 2 мл PBS (-) на лунку.
2. Добавьте в буфер Ads 1 мл раствора фермента, который включает 0,1% коллагеназу, 0,083% трипсина, 10 мкМ ингибитора ROCK (Y-27632), 20 нМ циклоспорина А и 50 мкг/мл L-аскорбата натрия (116 мМ NaCl, 12,5 мМ₂PO₄, 20 мМ HEPES, 5,4 мМ KCl, 5,6 мМ глюкозы и 0,8 мМ MgSO4; pH 7,35) (см. Таблицу материалов). Отделите ячейки от пластин, вращая их горизонтально при температуре 37 °C в течение примерно 2 часов.
3. Убедившись, что клетки отделены и округлены под микроскопом, диспергируйте их в отдельные клетки с помощью щадящего пипетирования и соберите в пробирку объемом 50 мл.
4. Центрифугируйте ячейки при 200 x g в течение 5 минут при 18 °C для их гранулирования. Удалите надосадочную жидкость с помощью аспиратора.
5. Окрашивание митохондрий клеток путем диспергирования их в 5 мл среды для созревания гепатоцитов, содержащей 100 нМ TMRM (тетраметилродамин, сложный эфир метла) (см. Таблицу материалов). Выдерживать в течение 30 минут при температуре 37 °C, защищая от света, завернув в алюминиевую фольгу.
6. Центрифугируйте клетки при 200 x g в течение 5 минут при 18 °C для их гранулирования. Удалите надосадочную жидкость.
7. Ресуспендируйте ячейки с 1-5 мл буфера холодной рекламы, содержащего 2% FBS.
8. Подсчитайте количество клеток с помощью 0,4% раствора трипанового синего и планшета для подсчета клеток.
9. Центрифугируйте ячейки при 200 x g в течение 5 минут при 4 °C для их гранулирования. Удалите надосадочную жидкость.
10. Разведите антитело против ALCAM (первичное антитело, см. Таблицу материалов) в соотношении 1:50 в буфере Ads и добавьте 100 мкл разведенного антитела на 10-6 клеток. Окрасьте ячейки на 50 минут на лед. Подготовьте клетки, которые не окрашены первичным антителом в качестве отрицательного контроля.
11. Промойте ячейки холодным буфером Ads, содержащим 2% FBS, дважды.
12. Разбавьте IgG против коз Alexa Fluor 488 (вторичное антитело, см. Таблицу материалов) в соотношении 1:100 в буфере Ads и добавьте 100 мкл разведенного антитела на 10⁶ клеток. Покрасьте клетки на 30 минут на лед. Окрашивание клеток, которые не были окрашены первичным антителом, с помощью вторичного антитела.
13. Промойте ячейки холодным буфером Ads, содержащим 2% FBS, дважды.
14. Повторно суспендируйте ячейки в буфере Ads и отфильтруйте их через сетчатый фильтр с защелкивающейся крышкой (меш 35 мкм) непосредственно перед сортировкой с помощью FACS, чтобы удалить крупные скопления клеток и мусор.

4. FACS-анализ и сортировка гепатоцитов, полученных из iPS-клеток человека

1. Настройте машину FACS для сортировки ячеек в соответствии с инструкциями производителя (см. Таблицу материалов).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте сопло размером 85 мкм или 100 мкм и нейтральный фильтр 2,0 для гепатоцитов. Используйте канал FITC для детектирования Alexa Flour 488 для ALCAM и канал PE для детектирования флуоресценции TMRM для митохондрий.
2. Отрегулируйте напряжения FSC (прямое рассеяние) и SSC (боковое рассеяние) для правильной визуализации популяции ячеек.
3. Отрегулируйте напряжение флуоресцентных каналов FITC и PE. Начните с неразмеченных ячеек и центрируйте популяцию ячеек в нижней части каждого графика канала. Убедитесь, что помеченные ячейки правильно расположены в пределах графика.
4. Используйте общую стратегию стробирования для устранения дублетов: Гейт основной FSC-A против Популяция SSC-A (Рисунок 2A), за которой следует FSC-H в сравнении с -W, а затем SSC-H против. -W (Рисунок 2B,C).
5. Загатите популяцию TMRM^hi и ALCAM⁺ (P2 на рисунке 2E) для сортировки гепатоцитов. Загатите популяцию TMRM^hi и ALCAM^- (P1 на рисунке 2E) для сортировки негепатоцитов. Отсортированные гепатоциты и негепатоциты соберите в пробирки для сбора по 15 мл, содержащие среду для созревания гепатоцитов.
6. Центрифугируйте сборную пробирку, содержащую отсортированные клетки, при температуре 200 x g в течение 5 мин при 18 °C.
7. Удалить надосадочную жидкость и ресуспендировать клетки в среду для созревания гепатоцитов.
8. Посев клеток на обработанные митомицином С эмбриональные фибробласты мышей (МЭФ) или гелеобразный матрикс базальной мембраны средой для созревания гепатоцитов с добавлением 10 мкМ Y-27632 и 20 нМ циклоспорина А. Культивирование клеток в инкубаторе с температурой 37 °C CO₂ в течение 5 дней.

5. Иммуноцитохимия для обнаружения гепатоцитов iPS-клеток человека

1. Культивируемые клетки промыть в течение 5 дней после сортировки PBS (-).
2. Зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом на 5 минут при комнатной температуре.
3. Промойте клетки буфером TBS-T (1x TBS с 1% Tween 20) дважды, чтобы удалить параформальдегид.
4. Инкубировать клетки с 0,1% разбавленным буфером TBS-T Triton X-100 в течение 5 минут при комнатной температуре.
5. Дважды промойте элементы буфером TBS-T, чтобы удалить Triton X-100.
6. Добавить в ячейки имеющийся в продаже раствор блокировки (см. Таблицу материалов) на 30 мин при комнатной температуре.
7. Добавьте первичные антитела против альбумина (маркера гепатоцитов) и ядерного антигена человека (hNA, см. таблицу материалов), разведенные в соотношении 1:50 в блокирующем растворе.
8. Инкубируйте клетки при температуре 4 °C в течение ночи. Дважды промойте ячейки буфером TBS-T.
9. Добавьте вторичные антитела: Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG и Alexa Fluor 546 donkey anti-mouse IgG, разведенные в соотношении 1:100 в блокирующем растворе (см. Таблицу материалов).
10. Инкубируйте клетки при комнатной температуре в течение 30 минут. Дважды промойте ячейки буфером TBS-T.
11. Оцените чистоту гепатоцитов путем подсчета альбумин-положительных и hNA-положительных клеток под флуоресцентным микроскопом. Рассчитайте процент альбумин-положительных клеток на hNA-положительную клетку для популяций P1 и P2.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

Показана временная шкала процессов, индуцирующих дифференцировку iPS-клеток человека в гепатоциты с помощью 2D-культуры (рисунок 1A) и репрезентативных особенностей клеток (рисунок 1B). Примерно на 12-й день дифференцировки клетки начали проявлять многоугол?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

Благодаря своей функции в метаболизме питательных веществ и детоксикации, гепатоциты обладают относительно большим количеством митохондрий по сравнению с^{другими типами} клеток. ALCAM входит в суперсемейство иммуноглобулинов и играет роль в адгезии и миграции клеток. Он экс...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159