Применение окрашивания живых митохондрий при сортировке клеток для очистки гепатоцитов, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток человека

Резюме

Гепатоциты, полученные из плюрипотентных стволовых клеток, могут быть очищены путем сортировки клеток с использованием комбинации окрашивания митохондриальными и активированными молекулами адгезии лейкоцитарных клеток (ALCAM, также известными как CD166).

Аннотация

Человеческие эмбриональные стволовые клетки (ЭС) и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПКС) имеют потенциальное применение в клеточной регенеративной медицине для лечения тяжелобольных органов благодаря их неограниченной пролиферации и плюрипотентным свойствам. Тем не менее, дифференциация человеческих ES/iPS-клеток в 100% чистые типы клеток-мишеней является сложной задачей из-за их высокой чувствительности к окружающей среде. Онкогенез после трансплантации вызывается загрязненными, пролиферирующими и недифференцированными клетками, что делает технологию высокой очистки необходимой для безопасной реализации регенеративной медицины. Для снижения риска онкогенеза была разработана технология высокой очистки гепатоцитов человека, полученных из iPS-клеток. В методе используется FACS (флуоресцентно-активируемая сортировка клеток) с использованием комбинации высокого содержания митохондрий и маркера клеточной поверхности ALCAM (активированная молекула адгезии лейкоцитарных клеток) без генетической модификации. 97% ± 0,38% (n = 5) очищенных гепатоцитов, использующих этот метод, проявляли экспрессию белка альбумина. Целью данной статьи является предоставление подробных процедур для этого метода применительно к самому современному методу двумерной дифференцировки iPS-клеток человека в гепатоциты.

Введение

Эмбриональные и индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ЭС и ИПК соответственно) считаются перспективными источниками клеток для регенеративной терапии. Тем не менее, эффективность дифференцировки этих клеток в конкретные типы клеток-мишеней может варьироваться, даже при использовании одной и той же клеточной линии, протокола и экспериментатора 1,2,3,4. Эта изменчивость может быть связана с высокой чувствительностью клеток ES/iPS человека к окружающей среде. Поэтому в настоящее время сложно стабильно получать чистые клетки-мишени. Д....

протокол

В этом исследовании использовались коммерчески полученные человеческие iPS-клетки (штамм 253G1) (см. Таблицу материалов).

1. Поддержание iPS-клеток человека

1. Поддерживайте iPS-клетки человека в безпитательных условиях в среде AK02 на чашках для культур, покрытых 0,25 мкг/^см2 iMatrix-511 (см. Таблицу материалов).

2. Печеночная дифференцировка iPS-клеток человека в 2D-культурах

ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1А приведен ежедневный график печеночной дифференцировки. На протяже....

Результаты

Показана временная шкала процессов, индуцирующих дифференцировку iPS-клеток человека в гепатоциты с помощью 2D-культуры (рисунок 1A) и репрезентативных особенностей клеток (рисунок 1B). Примерно на 12-й день дифференцировки клетки начали проявлять многоугол?.......

Обсуждение

Благодаря своей функции в метаболизме питательных веществ и детоксикации, гепатоциты обладают относительно большим количеством митохондрий по сравнению с^{другими типами} клеток. ALCAM входит в суперсемейство иммуноглобулинов и играет роль в адгезии и миграции клеток. Он экс.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
253G1 human iPS cell line	RIKEN BioResource Research Center	HPS0002
4% paraformaldehyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Cell sorter
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182
Ciclosporin A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagenase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix	Corning	354230	Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	ROCK inhibitor
Dexamethasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546	Thermo Fisher Scientific	A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488	Thermo Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap	Corning	352235
Fetal Bovine Serum	Biowest	51820-500
GlutaMAX Supplement	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody	R&D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 silk	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Blocking solution
ITS-G Supplement(×100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz's L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
Sodium L-Ascorbate	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSIN 250	Difco	215240
Tryptose phosphate broth solution	Sigma-Aldrich	T8159