JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

В данной статье описан протокол экстракции ДНК диатомовых водорослей с использованием модифицированного общего набора для экстракции ДНК.

Аннотация

Диатомовые водоросли являются важным вспомогательным средством в судебно-медицинской практике для определения того, утонул ли труп в воде, и для определения места утопления. Тестирование диатомовых водорослей также является важным предметом исследований в области окружающей среды и планктона. Технология молекулярно-биологического тестирования диатомовых водорослей, которая фокусируется на ДНК диатомовых водорослей в качестве основного объекта исследования, является новым методом тестирования диатомовых водорослей. Экстракция ДНК диатомовых водорослей является основой молекулярного тестирования диатомовых водорослей. В настоящее время наборы, обычно используемые для экстракции ДНК диатомовых водорослей, стоят дорого, что увеличивает стоимость проведения соответствующих исследований. Наша лаборатория усовершенствовала общий набор для быстрой экстракции геномной ДНК цельной крови и получила удовлетворительный эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей, тем самым предоставив альтернативное экономичное и доступное решение для экстракции ДНК на основе стеклянных шариков для соответствующих исследований. ДНК диатомовых водорослей, выделенная с помощью этого протокола, может удовлетворить многие последующие задачи, такие как ПЦР и секвенирование.

Введение

В судебно-медицинской практике определение того, был ли труп, найденный в воде утонувшим или брошенным в воду после смерти, имеет важное значение для надлежащего разрешения дела1. Это также один из сложных вопросов, которые необходимо срочно решить в судебно-экспертной практике2. Диатомовые водоросли в изобилии встречаются в природной среде (особенно в воде)3,4. В процессе утопления, из-за гипоксии и реакции на стресс, люди будут иметь интенсивные дыхательные движения и вдыхать большое количество тонущей жидкости. Поэтому диатомовые водоросли, находящиеся в воде, попадают в легкие вместе с тонущей жидкостью, а некоторые диатомовые водоросли могут попадать в кровоток через альвеолярно-капиллярный барьер и распространяться по внутренним органам с током крови 5,6. Обнаружение диатомовых водорослей во внутренних тканях и органах, таких как легкие, печень и костный мозг, является убедительным доказательством утопления перед смертью 7,8. В настоящее время судебно-медицинская экспертиза диатомовых водорослей в основном основана на морфологических методах тестирования. После серии предварительных расщеплений ткани под микроскопом проводят морфологические качественные и количественные оценки непереваренных диатомовых водорослей. В этот период необходимо использовать опасные и экологически небезопасные реагенты, такие как азотная кислота. Этот процесс занимает много времени и требует от исследователей солидных таксономических знаний и большого опыта. Все это создает определенные трудности для судебно-медицинского персонала9. Технология тестирования ДНК диатомовых водорослей - это новая технология тестирования диатомовых водорослей, разработанная в последние годы 10,11,12. Эта технология реализует видовую идентификацию диатомовых водорослей путем анализа специфического состава последовательности ДНК диатомовых водорослей13,14. Технология ПЦР и технология секвенирования являются широко используемыми техническими методами, но их основой является успешное извлечение ДНК из диатомовых водорослей. Однако диатомовые водоросли имеют особую структуру, отличную от других организмов, что делает их методы экстракции ДНК также различными.

Клеточная стенка диатомовых водорослей имеет высокую степень силицификации, а основным ее компонентом является диоксид кремния 15,16,17. Кремнистая клеточная стенка очень твердая, и она должна быть разрушена перед извлечением ДНК. Обычные наборы для экстракции ДНК часто трудно использовать непосредственно для экстракции ДНК диатомовых водорослей, поскольку они не могут разрушить кремнистую оболочку диатомовых водорослей18. Поэтому разрушение кремнистой оболочки диатомовых водорослей является одной из ключевых технических задач, которые необходимо решить при извлечении ДНК диатомовых водорослей.

В то же время, поскольку количество диатомовых водорослей, содержащихся в образцах судебно-медицинской экспертизы, будь то пробы воды или органы и ткани утонувших тел, часто ограничено, необходимо обогащать диатомовые водоросли. Суть обогащения заключается в разделении веществ. Пытаясь собрать диатомовые водоросли вместе, минимизируйте содержание других материальных компонентов (мешающих компонентов). В судебно-медицинской экспертизе лаборатории часто используют методы центрифугирования или мембранной фильтрации для разделения клеток диатомовых водорослей19. Однако, поскольку вакуумное насосное оборудование не получило широкого распространения, метод мембранного обогащения не часто используется в обычных первичных криминалистических лабораториях. Таким образом, метод центрифугирования по-прежнему широко распространен в криминалистических лабораторияхобогащением диатомовыми водорослями 20.

Выделение ДНК из диатомовых водорослей в настоящее время используется в основном в судебно-медицинской практике, и существуют существенные ограничения для его применения. В настоящее время на рынке мало наборов для экстракции диатомовой ДНК, используемых в криминалистике, и они, как правило, дорогие. В этой статье представлен усовершенствованный метод экстракции ДНК диатомовых водорослей, делающий экстракцию ДНК диатомовых водорослей простым, удобным и экономичным. Это расширяет применение последующего молекулярно-биологического тестирования диатомовых водорослей и может лучше решать проблемы, связанные с утоплением в судебной медицине, с помощью тестирования диатомовых водорослей. Этот метод разрушает кремнистые клеточные стенки диатомовых водорослей, добавляя стеклянные шарики и устанавливая подходящее время для вихря. Таким образом, протеиназа К и связывающий раствор быстро лизируют клетки и инактивируют различные ферменты в клетках. Геномная ДНК поглощается матричной мембраной в адсорбционной колонке и, наконец, элюируется элюирующим буфером. Такой улучшенный набор для экстракции генов цельной крови улучшает эффект экстракции ДНК диатомовых водорослей в материалах судебно-медицинской экспертизы, снижает стоимость экстракции ДНК диатомовых водорослей в судебно-медицинской практике и может быть лучше применен для низовых судебно-медицинских исследований.

протокол

Данное исследование было одобрено Комитетом по этике Хайнаньского медицинского университета. Образцы тканей, использованные в этом исследовании, не считаются исследованиями с участием людей. Эти образцы были получены с целью судебно-медицинской патологоанатомической диагностики, а остальные были использованы для выделения ДНК диатомовых водорослей в данном эксперименте. Исследователи не могут легко идентифицировать людей, чтобы получить информированное согласие от соответствующих заинтересованных сторон.

ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить общую применимость метода исследования, представленного в этом эксперименте, этот эксперимент в основном следовал инструкциям по эксплуатации используемого набора, и только некоторые шаги были изменены. Пробы воды, использованные в этом эксперименте, были случайным образом взяты из прудов, расположенных рядом с лабораторией (дополнительный рисунок 1А). В этом эксперименте легочная ткань утонувшего тела была подтверждена в качестве исследовательской ткани для демонстрации протокола экстракции (дополнительный рисунок 1B). В судебно-медицинской практике также иногда возникает необходимость использования других органов и тканей утонувших тел (таких как печень, селезенка, почки, костный мозг и т.д.) для извлечения ДНК диатомовых водорослей, что требует незначительных соответствующих доработок данного экспериментального метода, о чем будет рассказано в соответствующем разделе эксперимента. Образцы легочной ткани, использованные в этом эксперименте, были взяты из трупов, которые явно были утоплены в судебно-медицинских делах. Были проведены морфологические тесты, чтобы доказать, что легочная ткань содержит диатомовые водоросли (дополнительный рисунок 2).

1. Предварительная обработка образцов

  1. Предварительная обработка проб воды
    1. Возьмите 10 мл пробы воды в центрифужную пробирку и центрифугируйте при концентрации 13 400 x g в течение 5 минут. Осторожно слейте 9,8 мл надосадочной жидкости с помощью пистолета для пипетки и перелейте около 200 мкл обогащенной диатомовой воды, оставшуюся на дне, в центрифужную пробирку объемом 2 мл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Сначала может быть проведен предварительный эксперимент, а начальное количество может быть увеличено, если 10 мл пробы воды недостаточно для обогащения.
  2. Предварительная обработка образцов тканей
    1. Возьмите 0,5 г ткани края легких от утопленника, полностью измельчите или измельчите легочную ткань до тех пор, пока она не станет мутной. Предотвращение загрязнения экзогенными диатомовыми водорослями является ядром этого этапа. Разрежьте ткань на кусочки несколько раз с помощью ножниц.

2. Экстракция ДНК

ПРИМЕЧАНИЕ: Все этапы центрифугирования выполняются при комнатной температуре. Использование настольной центрифуги с центробежной силой 14 500 x g; Перед началом эксперимента необходимо подготовить водяную баню (или металлическую ванну), разогретую до 70 °C. Все этапы должны строго соответствовать принципам асептической работы.

  1. Сбор проб воды и тканей
    ПРИМЕЧАНИЕ: Метод извлечения ДНК из образца воды и диатомовых водорослей тканей одинаков.
    1. Добавьте стеклянные шарики в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую предварительно обработанный образец воды. Переверните 10x-15x, чтобы хорошо перемешать. Добавленные стеклянные шарики состоят из больших и маленьких стеклянных шариков, смешанных в массовом соотношении 1:1. Диаметр крупных стеклянных бусин составляет 1,5-2,0 мм, а мелких - 0,4-0,6 мм.
    2. Возьмите 0,5 г мелко нарезанной ткани, добавьте стеклянные шарики в центрифужную пробирку объемом 2 мл, содержащую ткань, как описано выше. Переверните 10-15 раз, чтобы перемешать.
  2. Добавьте 40 мкл протеиназы К (20 мг/мл) в пробирки. Поместите при комнатной температуре на 15 минут, в течение этого периода переверните и перемешайте 10 раз каждые 3 минуты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если ткань не полностью переваривается, количество протеиназы К может быть соответствующим образом увеличено до тех пор, пока раствор не станет прозрачным.
  3. Добавьте 200 мкл связующего буфера в центрифужные пробирки, немедленно встряхните и перемешайте в течение 4 минут (частота колебаний смешивания: 3000 об/мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: На этом этапе интенсивность и время встряхивания должны строго контролироваться, чтобы обеспечить достаточную интенсивность и время смешивания.
  4. Поместите центрифужные пробирки на водяную баню с температурой 70 °C на 10 минут, и раствор станет прозрачным.
  5. Добавьте в центрифужные пробирки 100 мкл изопропанола, перемешайте и перемешайте в течение 15 с, в это время может появиться осадок флокулянта.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Очень важно хорошо перемешать с соответствующей силой на вышеуказанных этапах операции, но следует избегать энергичного встряхивания, чтобы предотвратить сдвиг ДНК.
  6. Раствор, полученный на предыдущем этапе, вместе с осадком флокулянта помещают в адсорбционную колонну (адсорбционная колонна помещается в сборную трубку). Длина адсорбционной колонки составляет 3,0 см, диаметр - 1,0 см, а адсорбционная матрица представляет собой кремниевую матричную мембрану.
  7. Центрифугу при 8 000 x g в течение 30 с, выбросьте отработанную жидкость в сборную трубку и поместите адсорбционную колонну обратно в сборную трубку.
  8. Добавьте 500 мкл буфера для удаления ингибитора в адсорбционную колонну. Центрифугу при 13 400 x g в течение 30 с и выбросьте отработанную жидкость в сборную пробирку.
  9. Добавьте 700 мкл промывочного буфера в адсорбционную колонну. Центрифугу при 13 400 x g в течение 30 с и выбросьте отработанную жидкость в сборную пробирку.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавьте указанное количество абсолютного этанола в буферную бутылку для промывки перед первым использованием.
  10. Добавьте 500 мкл промывочного буфера в адсорбционную колонну. Центрифугу при 13 400 x g в течение 30 с и выбросьте отработанную жидкость в сборную пробирку.
  11. Поместите адсорбционную колонку обратно в пустую сборную трубку. Центрифугу при 14 500 x g в течение 2 мин и максимально удалите промывочный буфер, чтобы остаточный этанол в промывочном буфере не ингибировал последующие реакции.
  12. Выньте адсорбционную колонку и поместите ее в чистую центрифужную пробирку. Добавьте 100 мкл элюирующего буфера в среднюю часть адсорбционной мембраны.
  13. Поместите адсорбционную колонку при комнатной температуре на 3-5 минут и центрифугу при 13 400 x g в течение 1 минуты.
  14. Раствор, полученный на предыдущем этапе, снова добавьте в центробежную адсорбционную колонну. Поместите центробежную адсорбционную колонну при комнатной температуре на 2 минуты и центрифугу при давлении 13 400 x g на 1 минуту.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Элюирующий буфер следует предварительно нагреть на водяной бане с температурой 70 °C в течение примерно 10 минут. Объем элюирования должен быть не менее 50 мкл; в противном случае выход ДНК будет снижен.
  15. Извлеченную ДНК диатомовых водорослей хранят при температуре 2-8 °C для дальнейшего использования. Если раствор ДНК будет храниться в течение длительного времени, храните его при температуре -20 °C.

3. ПЦР-тест

Примечание: Поскольку содержание диатомовых водорослей в образцах судебно-медицинской экспертизы часто бывает низким, экстракты образцов тканей утонувших тел могут также содержать различную степень тканей и органов (например, легких в этом эксперименте) с их собственной ДНК. Таким образом, прямое обнаружение общей ДНК в экстрактах ДНК не отражает ситуацию с экстракцией ДНК диатомовых водорослей. В этом эксперименте были выбраны диатомовые праймеры, специфичные для диатомовых водорослей, и для оценки экстракции ДНК диатомовых водорослей в экстракте использовались продукты ПЦР. Продукты можно наблюдать и анализировать с помощью электрофореза в агарозном геле, а также можно анализировать с помощью флуоресцентной количественной кривой плавления ПЦР в режиме реального времени, которая имеет более высокую чувствительность.

  1. Добавьте 2 мкл выделенной ДНК из образцов воды и тканей в качестве шаблона. Выберите один из следующих двух методов проверки.
  2. Обычный ПЦР-тест
    1. Используйте праймеры22 , которые могут специфически амплифицировать фрагменты рДНК диатомовых водорослей 18S. Подробнее см. в таблице 1.
    2. Установить систему реакции ПЦР и условия амплификации в соответствии с характеристиками праймеров. Подробнее см. в таблице 2.
    3. Запускают продукты ПЦР-амплификации на 2% агарозном геле. Наблюдайте и анализируйте изображение с помощью гелевого тепловизора.
  3. Флуоресцентный количественный ПЦР-тест
    1. Используйте вышеуказанные праймеры, которые могут специфически амплифицировать фрагменты рДНК диатомовых водорослей 18S, для приготовления флуоресцентной реакционной системы количественной ПЦР в реальном времени. Подробнее см. в таблице 3.
    2. Провести ПЦР-амплификацию и проанализировать полученную кривую амплификации и значения Ct. В то же время задайте программу, постепенно расплавляйте двухцепочечные продукты в одноцепочечные с помощью технологии флуоресцентной количественной кривой плавления ПЦР, а затем анализируйте полученные кривые плавления.

Результаты

Поскольку раствор ДНК, выделенный используемым в настоящее время методом экстракции ДНК, содержит в образце все компоненты ДНК из разных источников, ДНК, полученная по этому протоколу, не стала исключением. Таким образом, раствор ДНК был не просто раствором геномной ДНК диатомовых водо...

Обсуждение

Клетки диатомовых водорослей защищены твердыми кремнеземистыми клеточными стенками17, и эта структура должна быть разрушена для извлечения ДНК диатомовых водорослей. Обычные наборы не так легко разрушают кремнистую оболочку диатомовых водорослей; таким образом, трудно у...

Раскрытие информации

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Благодарности

Работа выполнена при поддержке Национального фонда естественных наук Китая (82060341,81560304) и Научно-исследовательского проекта «Инновационная платформа академика» провинции Хайнань (YSPTZX202134).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Binding BufferBioTekeB010006022rapidly lysing cells
ChemoHS qPCR MixMonad00007547-120506qPCR Mix
D2000 DNA ladderReal-Times(Beijing) BiotechnologyRTM415Measure the position of electrophoretic bands
D512Taihe BiotechnologyTW21109196forword primer
D978Taihe BiotechnologyTW21109197reverse primer
Elution bufferBioTekeB010006022A low-salt elution buffer washes off the DNA
Glass beadYingxu Chemical Machinery(Shanghai) 70181000Special glass beads for dispersing and grinding
Import adsorption columnBioTekeB2008006022Adsorption column with silica matrix membrane
Inhibitor Removal BufferBioTekeB010006022Removal of Inhibitors in DNA Extraction
IsopropanolBioTekeB010006022Precipitate or isolate DNA
MIX-30S Mini MixerMiulabMUC881206oscillatory action
Proteinase KBioTekeB010006022Inactivation of intracellular nucleases and other proteins
Rotor-Gene Q 5plex HRMQiagenR1116175real-time fluorescence quantification PCR
Speed Micro-CentrifugeScilogex9013001121centrifuge
Tanon 3500R Gel ImagerTanon16T5553R-455gel imaging
Taq Mix ProMonad00007808-140534PCR Mix
Thermo CyclerZhuhai HemaVRB020Aordinary PCR
Wash BufferBioTekeB010006022Remove impurities such as cell metabolites

Ссылки

  1. Liu, C., Cong, B. Review and prospect of diagnosis of drowning deaths in water. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 3-13 (2022).
  2. Frisoni, P., et al. Forensic diagnosis of freshwater or saltwater drowning using the marker aquaporin 5: An immunohistochemical study. Medicina (Kaunas). 58 (10), 1458 (2022).
  3. Mann, D. G., Vanormelingen, P. An inordinate fondness? The number, distributions, and origins of diatom species. J Eukaryot Microbiol. 60 (4), 414-420 (2013).
  4. Pfister, L., et al. Terrestrial diatoms as tracers in catchment hydrology: a review. WIREs Water. 4, 1241 (2017).
  5. Yu, W., et al. An improved automated diatom detection method based on YOLOv5 framework and its preliminary study for taxonomy recognition in the forensic diatom test. Front Microbiol. 13, 963059 (2022).
  6. Zhang, P., et al. The length and width of diatoms in drowning cases as the evidence of diatoms penetrating the alveoli-capillary barrier. Int J Legal Med. 134 (3), 1037-1042 (2020).
  7. Kihara, Y., et al. Experimental water injection into lungs using an animal model: Verification of the diatom concentration test to diagnose drowning. Forensic Sci Int. 327, 110983 (2021).
  8. Shen, X., et al. Analysis of false-positive results of diatom test in the diagnosis of drowning-would not be an impediment. Int J Legal Med. 133 (6), 1819-1824 (2019).
  9. Manoylov, K. M. Taxonomic identification of algae (morphological and molecular): species concepts, methodologies, and their implications for ecological bioassessment. J Phycol. 50 (3), 409-424 (2014).
  10. Uchiyama, T., et al. A new molecular approach to help conclude drowning as a cause of death: simultaneous detection of eight bacterioplankton species using real-time PCR assays with TaqMan probes. Forensic Sci Int. 222 (1-3), 11-26 (2012).
  11. Kakizaki, E., et al. Detection of diverse aquatic microbes in blood and organs of drowning victims: first metagenomic approach using high-throughput 454-pyrosequencing. Forensic Sci Int. 220 (1-3), 135-146 (2012).
  12. Cai, J., Wang, B., Chen, J. H., Deng, J. Q. Application Progress of High-Throughput Sequencing Technology in Forensic Diatom Detection. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 20-30 (2022).
  13. Xiao, C., et al. Development and application of a multiplex PCR system for drowning diagnosis. Electrophoresis. 42 (11), 1270-1278 (2021).
  14. Yarimizu, K., et al. Development of an absolute quantification method for ribosomal RNA gene copy numbers per eukaryotic single cell by digital PCR. Harmful Algae. 103, 102008 (2021).
  15. Dalgic, A. D., Atila, D., Karatas, A., Tezcaner, A., Keskin, D. Diatom shell incorporated PHBV/PCL-pullulan co-electrospun scaffold for bone tissue engineering. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 100, 735-746 (2019).
  16. Malviya, S., et al. Insights into global diatom distribution and diversity in the world's ocean. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (11), 1516-1525 (2016).
  17. Brunner, E., et al. Analytical studies of silica biomineralization: towards an understanding of silica processing by diatoms. Appl Microbiol Biotechnol. 84 (4), 607-616 (2009).
  18. Annunziata, R., et al. An optimised method for intact nuclei isolation from diatoms. Sci Rep. 11 (1), 1681 (2021).
  19. Zhao, J., et al. The diagnostic value of quantitative assessment of diatom test for drowning: An analysis of 128 water-related death cases using microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy. J Forensic Sci. 62 (6), 1638-1642 (2017).
  20. Zhao, J., Liu, C., Hu, S., He, S., Lu, S. Microwave digestion-vacuum filtration-automated scanning electron microscopy as a sensitive method for forensic diatom test. Int J Legal Med. 127 (2), 459-463 (2013).
  21. Cai, J., et al. Improved glass bead-vortex oscillation method for DNA extraction from diatom. Fa Yi Xue Za Zhi. 38 (1), 119-126 (2022).
  22. Zimmermann, J., Jahn, R., Gemeinholzer, B. Barcoding diatoms: evaluation of the V4 subregion on the 18S rRNA gene, including new primers and protocols. Org Divers Evol. 11 (3), 173-192 (2011).
  23. Vinayak, V. Chloroplast gene markers detect diatom DNA in a drowned mice establishing drowning as a cause of death. Electrophoresis. , (2020).
  24. Plante, C. J., Hill-Spanik, K., Cook, M., Graham, C. Environmental and Spatial Influences on Biogeography and Community Structure of Saltmarsh Benthic Diatoms. Estuaries and Coasts. 44, 147-161 (2021).
  25. Heid, C. A., Stevens, J., Livak, K. J., Williams, P. M. Real time quantitative PCR. Genome Res. 6 (10), 986-994 (1996).
  26. Ben Amor, F., et al. Development of a novel TaqMan qPCR assay for rapid detection and quantification of Gymnodinium catenatum for application to harmful algal bloom monitoring in coastal areas of Tunisia. Environ Sci Pollut Res Int. 29 (42), 63953-63963 (2022).
  27. Doddaraju, P., et al. Reliable and early diagnosis of bacterial blight in pomegranate caused by Xanthomonas axonopodis pv. punicae using sensitive PCR techniques. Sci Rep. 9 (1), 10097 (2019).
  28. Lunetta, P., Miettinen, A., Spilling, K., Sajantila, A. False-positive diatom test: a real challenge? A post-mortem study using standardized protocols. Leg Med (Tokyo). 15 (5), 229-234 (2013).
  29. Marquesda Silva, J., Cruz, S., Cartaxana, P. Inorganic carbon availability in benthic diatom communities: photosynthesis and migration. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 372 (1728), 20160398 (2017).
  30. Yu, Z., et al. The effect of enzyme digestion time on the detection of diatom species. Pak J Pharm Sci. 27 (3 Suppl), 691-694 (2014).
  31. Liu, M., et al. Diatom DNA barcodes for forensic discrimination of drowning incidents. FEMS Microbiol Lett. 367 (17), 145 (2020).
  32. Mizushima, W., et al. The novel heart-specific RING finger protein 207 is involved in energy metabolism in cardiomyocytes. J Mol Cell Cardiol. 100, 43-53 (2016).
  33. Zimmermann, J., et al. Taxonomic reference libraries for environmental barcoding: a best practice example from diatom research. PLoS One. 9 (9), 108793 (2014).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

201

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены