В Планте Экспрессия генов и редактирование генов в листьях бамбука мосо

Резюме

В этом исследовании был разработан новый метод экспрессии генов in planta и редактирования генов, опосредованный агробактериями , в бамбуке. Этот метод значительно повысил эффективность валидации функций генов у бамбука, что имеет значительные последствия для ускорения процесса размножения бамбука.

Аннотация

Для бамбука был разработан новый метод трансформации генов in planta , который позволяет избежать необходимости в длительных и трудоемких процессах индукции и регенерации каллуса. Этот метод включает в себя экспрессию генов, опосредованную агробактериями, через ранение и вакуум для саженцев бамбука. Он успешно продемонстрировал экспрессию экзогенных генов, таких как репортер RUBY и ген Cas9 , в листьях бамбука. Наибольшая эффективность трансформации для накопления беталаина в проростках RUBY была достигнута при использовании штамма GV3101, с процентом 85,2% после заражения. Несмотря на то, что чужеродная ДНК не интегрировалась в геном бамбука, метод оказался эффективным в экспрессии экзогенных генов. Кроме того, с использованием этого метода была разработана система редактирования генов, из которой был получен мутант in situ , сгенерированный отредактированным геном бамбуковой виолаксантиндеэпоксидазы (PeVDE) в листьях бамбука с частотой мутаций 17,33%. Мутация гена PeVDE привела к снижению значений нефотохимического тушения (NPQ) при сильном освещении, что может быть точно обнаружено флуориметром. Это делает отредактированный PeVDE потенциальным нативным репортером как для экзогенных, так и для эндогенных генов бамбука. С помощью репортера PeVDE был успешно отредактирован ген циннамоил-КоА-редуктазы с частотой мутаций 8,3%. Эта операция позволяет избежать процесса культивирования тканей или индукции каллуса, что является быстрым и эффективным для экспрессии экзогенных генов и эндогенного редактирования генов в бамбуке. Этот метод может повысить эффективность верификации функций генов и поможет выявить молекулярные механизмы ключевых метаболических путей в бамбуке.

Введение

Исследование функции генов бамбука имеет большие перспективы для углубленного понимания бамбука и раскрытия его потенциала для генетической модификации. Эффективный способ достижения этой цели может быть достигнут с помощью процесса агробактериальной инфекции в листьях бамбука, при котором фрагмент Т-ДНК, содержащий экзогенные гены, вводится в клетки, что впоследствии приводит к экспрессии генов в клетках листьев.

Бамбук является ценным и возобновляемым ресурсом с широким спектром применения в производстве, искусстве и исследованиях. Бамбук обладает превосходными свойствами древесины, такими как высокая механическая прочность, ударная вязкость, умеренная жесткость и гибкость¹, который в настоящее время широко используется в различных бытовых и промышленных расходных материалах, включая зубные щетки, соломинки, пуговицы, одноразовую посуду, подземные трубопроводы и наполнители градирен для выработки тепловой энергии. Таким образом, разведение бамбука играет решающую роль в получении сортов бамбука с отличными свойствами древесины для замены пластика и сокращения использования пластика, защиты окружающей среды и борьбы с изменением климата, а также создания значительной экономической ценности.

Тем не менее, традиционное разведение бамбука сталкивается с проблемами из-за длительной стадии вегетативного роста и неопределенного периода цветения. Несмотря на то, что методы молекулярной селекции были разработаны и применены для селекции бамбука, процесс трансформации гена бамбука является трудоемким, трудоемким и сложным из-за процессов индукции и регенерации каллуса 2,3,4,5. Стабильная генетическая трансформация часто требует агробактериальных методов, которые включают процессы культивирования тканей, такие как индукция и регенерация каллуса. Однако бамбук обладает низкой способностью к регенерации каллусов, что значительно ограничивает применение стабильной генетической трансформации в бамбуке. После того, как Agrobacterium заражает растительные клетки, фрагмент Т-ДНК проникает в растительные клетки, при этом большинство фрагментов Т-ДНК остаются неинтегрированными в клетках, что приводит к транзиторной экспрессии. Лишь небольшая часть фрагментов Т-ДНК случайным образом интегрируется в ее хромосому, что приводит к стабильной экспрессии. Уровни транзиторной экспрессии показывают кривую накопления, которая может варьироваться для каждого гена, экспрессируемого из Т-ДНК, доставляемой агробактериями. В большинстве случаев самые высокие уровни экспрессии возникают через 3-4 дня после инфильтрации и быстро снижаются через 5-6 дней ^6,7. Предыдущие исследования показали, что более 1/3 мутаций в генетически отредактированных растениях, полученных без давления отбора на резистентность, происходят от транзиторной экспрессии CRISPR/Cas9, в то время как оставшиеся менее 2/3 происходят от стабильной экспрессии после интеграции ДНК в геном⁸. Это указывает на то, что интеграция Т-ДНК в геном растения не является необходимой для редактирования генов. Более того, давление отбора на резистентность значительно ингибирует рост нетрансгенных клеток, непосредственно влияя на процесс регенерации инфицированных эксплантов. Таким образом, используя переходную экспрессию без давления отбора для резистентности у бамбука, можно добиться неинтегрированной экспрессии экзогенных генов и изучать функцию генов непосредственно в органах растений. Таким образом, можно разработать простой и экономящий время метод экспрессии и редактирования экзогенных генов в бамбуке⁹.

Разработанный метод экзогенной экспрессии генов и редактирования генов характеризуется простотой, экономичностью, отсутствием дорогостоящего оборудования и сложных процедур⁹. В этом методе бамбуковый эндогенный ген виолаксантиндеэпоксидазы (PeVDE) был использован в качестве репортера для экзогенной экспрессии генов без давления отбора. Это связано с тем, что отредактированный PeVDE в листьях бамбука снижает способность к фотозащите при сильном освещении и демонстрирует снижение значения нефотохимического гашения (NPQ), которое может быть обнаружено с помощью флуоресцентной визуализации хлорофилла. Чтобы продемонстрировать эффективность этого метода, с помощью этой системы был нокаутирован еще один эндогенный ген бамбука — ген циннамоил-КоА-редуктазы (PeCCR5)⁹ и успешно сгенерирован мутант этого гена. Этот метод может быть использован для функциональной характеристики генов, выполняющих функции в листьях бамбука. Путем гиперэкспрессии этих генов в листьях бамбука можно повысить уровень их экспрессии, а путем редактирования генов их экспрессия может быть снижена, что позволяет изучать уровни экспрессии генов, фенотипы листьев и состав продукта. Это обеспечивает более эффективный и осуществимый подход к исследованию функции генов в бамбуке. Этот метод может быть применен для функциональной характеристики генов, которые функционируют в листьях бамбука. Путем гиперэкспрессии этих генов в листьях бамбука можно повысить уровень их экспрессии, а путем редактирования генов их экспрессия может быть снижена, что позволяет изучать уровни экспрессии генов, фенотипы листьев и состав продукта. Кроме того, важно отметить, что из-за обширной полиплоидизации большинство коммерчески важных генов в геномах бамбука присутствуют в нескольких копиях, что приводит к генетической избыточности. Это создает проблему для выполнения мультиплексного редактирования генома в бамбуке. Прежде чем применять методы стабильной генетической трансформации или редактирования генов, крайне важно быстро проверить функции генов. При решении проблемы множественных копий генов один из подходов заключается в анализе профилей экспрессии транскриптома для выявления генов, которые активно экспрессируются на определенных стадиях. Кроме того, нацеливание на консервативные функциональные домены этих копий генов позволяет создавать общие целевые последовательности или включать несколько сайтов-мишеней в один и тот же вектор CRISPR/Cas9, обеспечивая одновременный нокаут этих генов. Это обеспечивает более эффективный и осуществимый подход к исследованию функции генов в бамбуке.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

1. Подготовка саженцев бамбука

1. Подготовьте саженцы бамбука мосо (Phyllostachys edulis), используя семена, собранные в Гуйлине, Гуанси, Китай. Начните с замачивания семян в воде на 2-3 дня, обязательно меняя воду ежедневно. Далее создают субстрат, смешивая грунт и вермикулит в пропорции 3:1.
2. Посейте замоченные семена в субстрат для проращивания. Держите рассаду в лабораторных условиях, поддерживая температуру в пределах 18-25 °C. Обеспечьте фотопериод 16 ч светлый/8 ч темный с интенсивностью света 250-350 мкмоль/^м2/с во время световой фазы.
3. Поддерживайте относительную влажность воздуха около 60%. Для агробактериальной инфекции используют рассаду, которой 15 дней и которая имеет высоту 2-10 см, что является лучшим этапом для преображения.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку цветение бамбука непредсказуемо, семена доступны не каждый год. Семена обычно хранятся в течение 2-3 лет при температуре 4 °C в сухой среде и могут сохранять жизнеспособность более 20%.

2. Получение плазмид и агробактерий

1. Плазмиды: Для проверки эффекта транзиторной экспрессии используют конструкцию pHDE-35S::RUBY, содержащую видимый репортерный ген, управляемый промотором CaMV 35S ¹⁰. Для редактирования гена используют конструкцию pCambia1300-Ubi::Cas9, которая несет ген Cas9, управляемый промотором кукурузы Ubi ¹¹. Вставьте направляющие последовательности sgRNA PeVDE и других генов-мишеней между двумя сайтами AarI в конструкцию pCambia1300-Ubi::Cas9 9.
2. Вставьте последовательности направляющей РНК CRISPR/Cas9 между двумя сайтами эндонуклеазы рестрикции AarI конструкции pCambia1300-Ubi::Cas9 , включая гены-мишени PeVDE и PeCCR5 .
3. Добавьте GGCA к 5'-концу 20-нуклеотидной последовательности и синтезируйте одноцепочечную последовательность ДНК. Обратное дополнение 20-нуклеотидной последовательности и добавление AAAC к 5'-концу, затем синтез другой одноцепочечной последовательности ДНК.
4. Разбавить обе одноцепочечные последовательности ДНК до концентрации 10 нМ/л в разбавленной воде, тщательно перемешать и нагревать при 95 °C в течение 5 мин. Дайте смеси остыть до комнатной температуры, в результате чего образуются двухцепочечные переходники.
5. Соедините адаптеры с линейным фрагментом pCambia1300-Ubi::Cas9, расщепленным эндонуклеазой Aar I с использованием ДНК-лигазы T4, и секвенируйте сконструированный вектор CRISPR/Cas9 для получения желаемой конструкции, нацеленной на ген.
6. Чтобы превратить плазмиды в агробактерии, используйте метод замораживания-оттаивания следующим образом: смешайте 1 мкл плазмид (концентрация: 10 - 1000 нг/мкл) со 100 мкл агробактериально-компетентных клеток (эффективность трансляции: > 1 x 10⁴ колониеобразующих единиц/мкг) и осторожно перемешайте. Поместите смесь на лед на 5 минут. Переведите смесь в жидкий азот на 5 мин.
7. Разморозьте смесь на водяной бане с температурой 37 °C в течение 5 минут. Добавьте в смесь 500 мкл среды Лурия-Бертани (LB) и инкубируйте ее на встряхивающем инкубаторе при 28 °C при 200 об/мин в течение 2-3 ч. Плазмиды pHDE-35S::RUBY вводят по отдельности в штаммы AGL1, GV3101, LBA4044 и EHA105 Agrobacterium tumefaciens (A. tumefaciens)¹². Для плазмид CRISPR/Cas9 введите их в штамм GV3101 A. tumefaciens.
8. Выращивайте агробактерии в пептоне дрожжевого экстракта (YEP) в среде (10 г говяжьего экстракта, 10 г дрожжевого экстракта и 5 г NaCl на л) с соответствующими антибиотиками (спектиномицин для 35S::RUBY и канамицин для CRISPR/Cas9) при температуре 28 °C. Одиночные колонии наблюдались через 36-48 ч после культивирования.
9. Пикировку и перенос колоний в жидкую среду YEP (с соответствующими антибиотиками) для дальнейшего роста. Через 24-36 ч используют праймеры RUBY-F и RUBY-R (табл. 1) для проведения ПЦР для подтверждения успешного переноса плазмид в Agrobacterium.
10. Переносят 1 мл успешно трансформированной агробактерии в 100 мл свежей жидкой среды YEP (с соответствующими антибиотиками), а затем выращивают в течение ночи при 28 °C до наружного диаметра₆₀₀ 0,8.
11. Центрифугируют бактериальную суспензию при 4 000 x g в течение 5 мин при 4 °C, промывают бактериальные гранулы один раз инфильтрационной средой суспензии (10 мМ MgCl₂ и 10 мМ MES-KOH [рН 5,6]), а затем снова центрифугируют. Ресуспендируйте бактериальные гранулы в инфильтрационной среде суспензии до наружного диаметра₆₀₀ 0,6 для превращения бамбука.

3. Агробактерии, опосредованные в системе трансформации растений

1. Подготовьтесь к трансформации; Осторожно извлеките саженцы с корнями, прикрепленными к почве, из субстрата, следя за тем, чтобы корни оставались нетронутыми. Оберните рассаду оловянной пленкой, чтобы сохранить влагу и предотвратить отслоение почвы (рисунок 1А).
2. Завернутую рассаду переносят в среду с более высокой влажностью (относительная влажность воздуха >90%) и низкой освещенностью (интенсивность менее 50 мкмоль/^м2/с) на 2 ч.
3. С помощью острой иглы из шприца намотают верхнюю часть скрученных незрелых листьев (примерно в 1-2 см от верхушки) саженцев бамбука один или два раза (на что указывают красные треугольники на рисунке 1А).
4. После этого окуните раненую верхнюю часть рассады в суспензию Agrobacterium. Выполняйте весь процесс, от ранения до погружения в агробактерии , быстро, так как свежая рана повысит эффективность инокуляции.
5. Сразу же переложите рассаду в вакуумную камеру с давлением 25-27 мм рт.ст. на 2 мин (рисунок 1Б).
6. После уборки пылесосом аккуратно разверните рассаду и пересадите ее в субстрат. Поместите рассаду на тусклый свет или в темноту (<50 мкмоль/^м2/с) с высокой влажностью (RH>90%) при комнатной температуре (18-25 °C) на 2 дня. В последующем культивируйте рассаду в нормальных условиях роста, поливая ее каждые 5-7 дней. Понаблюдайте за их фенотипами, чтобы получить материал для последующих экспериментов.

4. Разработка однонаправляющих РНК (sgRNAs) для редактирования генов

1. Идентификация сайта протоспейсерного смежного мотива (PAM), расположенного рядом со специфическим и консервативным доменом последовательности гена-мишени. Убедитесь, что конкретная последовательность PAM является NGG в этой системе CRISPR/Cas9. Проверьте целевую специфичность выбранной последовательности, выполнив поиск BlastN по базе данных генома бамбука. Убедитесь, что sgRNA уникальна, особенно в восходящей области и близко к PAM ^9,11.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это сравнение эффективно уменьшит количество потенциальных нецелевых участков в геноме, затронутых процессом редактирования генов.
2. Спроектируйте две sgRNA (sgRNA-1 и sgRNA-2) на первом экзоне гена PeVDE ¹³. Включите сайты рестрикции I возраставыше по течению от PAM в sgRNA-1 и сайты рестрикции XbaI выше PAM в sgRNA-2. Сконструировать одну сгРНК на четвертом экзоне гена PeCCR5 , который кодирует консервативный мотив KNWYCYGK. Этот мотив имеет решающее значение для катализа CCR¹⁴.
3. Спроектируйте 20-нуклеотидную спейсерную последовательность, примыкающую к сайту PAM. Эта спейсерная последовательность направит фермент Cas9 к сайту-мишени для расщепления ДНК и последующего редактирования генов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется выбрать целевую область выше по течению от сайта расщепления фермента эндонуклеазы в пределах сайта PAM. Это облегчит проверку эффективности редактирования генов.

5. Дизайн праймера и ПЦР

1. Вручную разрабатывайте специальные праймеры для амплификации фрагментов PeVDE и PeCCR5 . Спроектируйте праймеры на входе и выходе так, чтобы они располагались на расстоянии не менее 100.о. от целевого участка с разницей в длине более 100.н., чтобы обеспечить четкое разделение полос во время электрофореза. Разработка праймеров для амплификации RUBY в пределах первых 500.н. гена. Список всех используемых грунтовок приведен в таблице 1.
2. Используйте высокоточную ДНК-полимеразу для ПЦР. В этом случае используют ДНК-полимеразу с высокой точностью и эффективной амплификацией при клонировании генов.
3. Приготовьте реакционную смесь для ПЦР следующим образом: 5-кратный буфер (Mg²⁺ Plus): 4 мкл; смесь dNTP (по 2,5 мМ): 1,6 мкл; Прямые и обратные праймеры (по 10 пмоль): по 1 мкл; ДНК генома бамбука (примерно 50 нг); ДНК-полимераза (2,5 Ед/мкл): 0,2 мкл; Разбавьте воду до общего объема 20 мкл.
4. Соблюдайте условия проведения ПЦР: начальная денатурация при 98 °C в течение 5 мин; Денатурация при 98 °С в течение 10 с; Отжиг при 56 °С в течение 5 с; Удлинение при 72 °C в течение 30 с; Повторите денатурацию до удлинения в течение 32 циклов; Окончательное удлинение при 72 °C в течение 5 мин; Хранить при температуре 4 °C неограниченное время.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Условия ПЦР приведены в качестве примера и могут нуждаться в оптимизации для конкретных применений или целей.

6. Экстракция ДНК, расщепление эндонуклеазных ферментов и секвенирование

1. Отделите с помощью ножниц область с более низкими значениями NPQ от свежих листовых пластинок бамбука, как это было определено флуориметром с визуализацией PAM (см. шаг 7.4). Заморозьте образцы листьев жидким азотом и переложите образцы замороженных листьев в ступку. Измельчите образцы в мелкий порошок с помощью пестика, добавив в процессе измельчения достаточное количество жидкого азота. Этот этап способствует высвобождению клеточного содержимого, в том числе ДНК.
2. Извлеките геномную ДНК из измельченного в порошок листа с помощью метода цетилтриметиламмония бромида аммония (CTAB). Добавьте 50 мг образцов порошка листьев к 800 мкл 2% раствора CTAB. Образец тщательно перемешать и инкубировать при 65 °C в течение 30 мин, слегка встряхивая каждые 5 мин.
3. Добавьте равный объем хлороформа/изоамилового спирта (24:1, v/v) и энергично встряхните смесь. После центрифугирования при 8 000 г в течение 8 мин переносят надосадочную жидкость в новую пробирку.
4. Добавьте равный объем хлороформа/изоамилового спирта и повторите шаг 6.3. Добавьте равный объем ледяного изопропанола и переверните пробирку несколько раз, прежде чем поместить ее в -20 °C на 30 минут. После центрифугирования при 8 000 x g в течение 5 мин надосадочную жидкость выбросить.
5. Промойте гранулу ДНК 2 раза 75% этанолом при 4 °C, затем растворите в 50 мкл воды.
6. Амплифицируйте геномную ДНК, содержащую целевой сайт генов-мишеней, как из листьев бамбука дикого типа, так и из листьев бамбука, инфицированных агробактериями, с помощью протокола, описанного в шаге 5.4.
7. Проводят ферментативное расщепление эндонуклеаз продуктов ПЦР. Выберите конкретный фермент, который распознает нужные сайты рестрикции в амплифицированных фрагментах ДНК. Используйте эндонуклеазы AgeI и XbaI для пищеварения.
8. Приготовьте реакционную смесь, состоящую из продуктов ПЦР AgeI или XbaI (20 единиц/мкл) - 1 мкл, 1 мкг продуктов ПЦР, 10x буфера - 5 мкл, и добавьте воду до общего объема 50 мкл. Инкубируют при 37 °C в течение 1 ч.
9. Проанализируйте долю переваренных фрагментов ДНК с помощью гель-электрофореза. Сравните переваренные фрагменты из образцов дикого типа и зараженных агробактериями образцов для оценки эффективности редактирования генов.
10. Пометьте транспозазный адаптер последовательностей TCGTCGGCAGCGTCAGATGTATAAGAGACAG и GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG к 5'-концу прямого и обратного праймеров соответственно для амплификации фрагментов PeVDE и PeCCR5 ^9,15. Для усиления используйте протокол, описанный в шаге 5.4. Подготовьте продукты ПЦР (до переваривания) для глубокого секвенирования.

7. Измерение флуоресценции хлорофилла значений NPQ в листьях

1. Перед измерениями подвергните саженцы бамбука воздействию высокой интенсивности света 1200 мкмоль/^м2/с в течение 2 часов. Такое воздействие увеличивает количество поглощенного кванта света и активирует систему фотозащиты в листьях.
2. Используйте флуориметр для визуализации PAM для измерения флуоресценции хлорофилла PS II листьев бамбука in vivo . Установите интенсивность актинического света на 800 мкмоль/^м2/с для 6-минутных измерений флуоресценции. В течение этого периода применяйте насыщающий импульс каждые 30 с для получения кривых флуоресценции хлорофилла. Стабильные значения кривых будут использоваться для расчетов¹³.
3. Рассчитайте нефотохимическую закалку (NPQ) по формуле:
   NPQ = (F m - F m') / F _m'
   где F m представляет максимальную флуоресценцию в темном-адаптированном состоянии, а F_m' представляет максимальную флуоресценцию в любом светоадаптированном состоянии.
4. Отслеживайте значения NPQ с помощью визуального интерфейса программного обеспечения для обработки изображений. Программное обеспечение позволяет в режиме реального времени анализировать и отображать данные флуоресценции, включая значения NPQ.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

Агробактерии, опосредованные экспрессией гена planta в листьях бамбука
Было продемонстрировано, что репортерный ген RUBY эффективен в визуализации транзиторной экспрессии генов благодаря его способности продуцировать ярко-красный беталаин из тирозина^1...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Этот метод значительно сокращает необходимое время по сравнению с традиционными методами генетической трансформации, которые обычно занимают 1-2 года, и обеспечивает транзиторную экспрессию экзогенных генов и редактирование генов эндогенных генов в течение 5 дней. Тем не менее, этот м?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
35S::RUBY	Addgene, United States	160908	Plamid construct
Agrobacterium competent cells of GV3101, EHA105,LBA4404, and AGL1	Biomed, China	BC304-01, BC303-01, BC301-01, and BC302-01	For Agrobacterium infection
CTAB	Sigma-Aldrich, United States	57-09-0	DNA extraction
Imaging-PAM fluorometer	Walz, Effeltrich, Germany		Detect chlorophyll fluorescence of bamboo leaves
ImagingWin	Walz, Effeltrich, Germany		Software for Imaging-PAM fluorometer
Paq CI or Aar I	NEB, United States	R0745S	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.
PrimeSTAR Max DNA polymerase	Takara, Japan	R045Q	For gene cloning
T4 DNA ligase	NEB, United States	M0202V	Incorporate the target sequence onto the CRISPR/Cas9 vector.